登革病毒2型E蛋白基因真核表达和DNA免疫的研究

将编码登革病毒2型(DV2)氨基末端80％的E蛋白的DNA片段克隆到真核表达载体pCXN2 AG强启动子下游,构建成DV2E重组真核表达质粒pCXN-E。间接免疫荧光显示其可在COS-7细胞中表达。ELISA法检测pCXN2-E DNA免疫BALB/c鼠血清中的E抗体变化和维持规律,结果显示三次免疫后2周已有抗体产生,15周时仍维持较高的水平;血清空斑减数中和实验显示其中和滴度高于1:640;流式细胞计数仪(FACS)检测DNA免疫鼠CD4~+、CD8~+T淋巴细胞变化情况,与注射空载体pCXN2的阴性鼠相比,CD4~+淋巴细胞水平略有上升。CD8~+细胞水平有较大升高(p<0.01);动物保护性实验结果显示,当用致死剂量登革病毒攻击免疫鼠时,其保护率为60％。以上结果表明:pCXN2-E在实验动物内表达出的DV2E蛋白可以诱导免疫动物的体液免疫和细胞免疫应答,尤其是MHC-I限制性杀伤性CD8~+T淋巴细胞水平的提高对清除病毒是十分有利的。因此,DV2 E DNA免疫为登革病毒DNA疫苗的发展进行了有益的探索。     

登革病毒2型E蛋白基因真核表达和DNA免疫的研究

将编码登革病毒2型(DV2)氨基末端80%的E蛋白的DNA片段克隆到真核表达载体pCXN2 AG强启动子下游,构建成DV2E重组真核表达质粒pCXN-E.间接免疫荧光显示其可在COS-7细胞中表达.ELISA法检测pCXN2-E DNA免疫BALB/c鼠血清中的E抗体变化和维持规律,结果显示三次免疫后2周已有抗体产生,15周时仍维持较高的水平;血清空斑减数中和实验显示其中和滴度高于1640;流式细胞计数仪(FACS)检测DNA免疫鼠CD4+、CD8+T淋巴细胞变化情况,与注射空载体pCXN2的阴性鼠相比,CD4+淋巴细胞水平略有上升,CD8+细胞水平有较大升高(p＜0.01);动物保护性实验结果显示,当用致死剂量登革病毒攻击免疫鼠时,其保护率为60%.以上结果表明pCXN2-E在实验动物内表达出的DV2E蛋白可以诱导免疫动物的体液免疫和细胞免疫应答,尤其是MHC-Ⅰ限制性杀伤性CD8+T淋巴细胞水平的提高对清除病毒是十分有利的.因此,DV2 E DNA免疫为登革病毒DNA疫苗的发展进行了有益的探索.     

福建省白纹伊蚊中登革病毒的分离与鉴定

近年来福建省登革热(Dengue fever,DF)输入性病例持续存在,且登革热的主要传播媒介白纹伊蚊在全省内广泛分布,为了解福建省福州市登革热的媒介白纹伊蚊携带登革病毒(Dengue virus,DENV)状况,2017年10月7日在福州市台江区元一花园小区内开展伊蚊监测,采用双层叠帐法捕获255只白纹伊蚊蚊体研磨液上清提取核酸后用实时荧光RT-PCR法检测DENV特异性核酸,将检测阳性的蚊体研磨液上清接种C6/36细胞进行病毒分离,成功分离到1株DENV病毒株mosquito13/Fujian/2017;经实时荧光RT-PCR法鉴定所分离病毒株的血清型为I型;利用型特异性引物通过RT-PCR扩增病毒E基因并测序进行分子遗传特性分析;E基因核苷酸和氨基酸同源性分析显示,该毒株与2017年10月17日同小区本地登革热病例血清中分离得到的登革毒株E基因序列完全一致,与越南2014年分离株KT825033/Vietnam/2014核苷酸(99.7%)和氨基酸(99.8%)同源性最高;系统进化树分析表明所分离登革病毒毒株的基因型为I型,与东南亚地区的越南,泰国,柬埔寨等国家进化关系相近,可能输入来源于东南亚国家。本研究证实了登革热外潜伏期的存在以及白纹伊蚊在登革热疫情传播过程中的媒介作用,提示在登革热的防控工作中媒介登革病毒监测、检测的重要性,也提示福建省需要加强输入来源监测,特别是东南亚入境人员的监测。     

口服型HCV融合抗原DNA疫苗在小鼠诱导免疫应答

将编码一个外源信号肽、一个通用型辅助性T淋巴细胞抗原表位和HCV核心 包膜蛋白E2融合抗原基因的真核表达质粒pST CE2t(DNA疫苗 )转化到减毒鼠伤寒沙门菌SL72 0 7.将该重组菌口服接种BALB c小鼠 3次 .小鼠的抗HCV核心和E2抗体阳转率分别达 6 0 %和 70 % .体外以重组HCV核心或E2抗原刺激小鼠脾细胞 ,均使之发生明显的增殖反应 ,且小鼠脾细胞能有效杀伤表达HCV核心抗原的同系骨髓瘤细胞SP2 0 .这为研制高效免疫、成本低廉、接种方便的HCV疫苗提供了一个新的可行途径     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白实验性核酸疫苗的构建及其免疫原性的初步研究

扩增了猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)长春分离株ORF5基因,并将其克隆至真核表达载体pVAX1、pVIR-IL-18的CMV启动子下游,构建成真核表达质粒。通过Western blot以及IFA检测方法确认,所构建的2个重组DNA疫苗质粒在真核细胞能进行有效的转录,并表达了目的蛋白(GP5)。同时辅以不同佐剂进行了BALB/c小鼠免疫试验,检测了免疫后的ELISA抗体水平和脾T淋巴细胞亚群数量。结果表明:共表达猪IL-18基因的核酸疫苗pVIR-IL-18-ORF5免疫后的ELISA抗体水平和脾T淋巴细胞亚群数量均优于pVAX1-ORF5,而且加佐剂实验组优于未加佐剂的实验组。     

猪戊型肝炎核酸疫苗的构建及在BAL B/C小鼠免疫效应

将含有kozak序列及BamH I的上游引物和带有终止密码子及EcoRV酶切位点的下游引物,以猪HEVDQ1 ORF2为模板,进行PCR。将扩增片段和pcDNA3.1质粒以BamH I/EcoRV进行双酶切后进行连接。连接产物转化至大肠杆菌DH5α,经测序证明该序列正确,命名为pcDQ1。进行pcDQ1质粒提取,以Vero细胞为表达细胞进行转染,以间接免疫荧光试验进行验证。以100μg/次/只剂量的pcDQ1对BAL B/C小鼠进行免疫以获取单因子血清。共免疫3次,采集血清,进行ELISA效价测定。结果表明,该核酸疫苗可以免疫使小鼠产生抗体。     

IL-12增强HBV融合抗原DNA疫苗在小鼠诱导的细胞免疫应答

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)极易形成慢性感染,主要机制在于感染者不能产生强有力的细胞免疫应答以清除病毒[1].慢性HBV感染者体内虽然存在HBV抗原特异性T淋巴细胞,但对HBV抗原的反应性较低.研究发现,增强这类T淋巴细胞的反应性,可以促进HBV的清除[2].     

乙型肝炎病毒全S基因疫苗诱导小鼠的特异性免疫应答

乙型肝炎病毒 (ＨＢＶ)感染是我国常见病及多发病。ＨＢＶ难以清除的原因之一就是机体的免疫功能障碍。目前虽然基因重组ＨＢＶ表面抗原 (ＨＢｓＡｇ)疫苗预防ＨＢＶ感染取得了较好的效果 ,但基因重组ＨＢｓＡｇ疫苗主要能诱导特异性体液免疫 ,不能刺激机体的细胞免疫应答。近年来发现基因疫苗可诱导机体产生细胞及体液免疫反应 ,特别是诱导细胞免疫反应的能力优于蛋白、多肽类疫苗 ,更适应于慢性病毒感染的预防与治疗[1,2 ] 。为了探讨应用ＨＢＶ基因疫苗预防ＨＢＶ感染的可能性 ,本文构建了ＨＢＶ全Ｓ基因和ＨＢｓＡｇ基因疫苗 ,观察和比…     

Establishment of Murine Infection Models with Biological Clones of Dengue Viruses Derived from a Single Clinical Viral Isolate

Virologica Sinica - Dengue virus (DENV) is a single-stranded RNA virus transmitted by mosquitoes in tropical and subtropical regions. It causes dengue fever, dengue hemorrhagic fever and dengue...     

A、B型流感病毒HA1嵌合基因疫苗的构建及免疫保护研究

为制备能提供交叉保护的疫苗,本研究在证实A型、B型流感病毒HA1 DNA能够提供抗流感病毒保护的基础上,将编码A型和B型流感病毒HA1的基因构建在同一质粒中,制备成嵌合DNA疫苗.将该重组质粒免疫小鼠,并以致死量同种流感病毒A/PR/8/34或B/Ibaraki/2/85攻击,通过测定小鼠的血清抗HA抗体和保护效果(包括存活率、肺部病毒量和体重丢失率)来评价DNA疫苗的免疫效果.结果表明:A、B型流感病毒HAl嵌合DNA疫苗能保护小鼠抵抗两种致死量流感病毒的攻击,具有提供交叉保护的能力.     

利用反向遗传技术产生8基因全禽源流感病毒疫苗候选株

利用反向遗传技术将含有A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)株禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的6个内部基因与H5N1亚型AIV的2个表面基因HA和NA共转染COS-1细胞,产生了6 2全禽源的重配AIV。将H5N1亚型AIV的HA基因经基因突变致弱,然后将A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)AIV的6个内部基因的cD-NA和以上致弱的禽源HA基因及NA基因的cDNA分别克隆到转录/表达载体pHW2000中,构建成8个转录/表达质粒。将8个质粒共转染COS-1细胞,24h后收获细胞及上清接种SPF鸡胚,72~90h后鸡胚死亡,收取鸡胚尿囊液进行血凝、血凝抑制试验、序列分析、病毒致病性试验和动物免疫保护试验,最终证实产生了致弱的全禽源AIV疫苗候选株。     

粘膜免疫戊型肝炎试验性疫苗的研究

采用原核表达的戊型肝炎病毒结构区基因(HEV ORF2)编码蛋白,与新型人用疫苗佐剂类MF59配制成试验性疫苗,通过粘膜免疫途径免疫实验小鼠,研究其产生粘膜免疫和体液免疫的效果。结果表明,通过滴鼻和灌胃两种粘膜免疫途径免疫BALB／c小鼠,均能诱导小鼠产生针对HEV ORF2试验性疫苗的血清IgG和IgA,血清IgG的抗体滴度为1：800～1：1600,血清IgA抗体滴度为1：100～1：200。对免疫小鼠血清中IgG的动态观察表明,血清抗体可持续存在至少6个月以上。比较类MF159佐剂和传统铝盐佐剂经注射免疫所诱导产生的血清IgG抗体滴度,发现类MF59佐剂可有效增强HEV0RF2重组蛋白的免疫原性4倍左右。类MF159佐剂可诱导粘膜免疫反应,在肠道粘膜部位产生SIgA,滴度为1：100。这些结果为新型戊型肝炎病毒基因工程重组疫苗的研制提供了一条新的思路。     

H9N2亚型禽流感病毒HA基因的克隆及其DNA疫苗的动物免疫试验

血凝素(HA)是决定禽流感病毒的毒力强弱和免疫原性的主要蛋白质.根据已发表的H9亚型AIV的HA基因序列,设计合成了1对H9 HA特异引物,以AIV A/Chicken/Henan/1/1999/(H9N2)核酸为模板,通过RT-PCR扩增出1条1.6 kb cDNA片段.将HA基因插入pVAX1中,构建了真核表达质粒pVAX-H9.采用活体电击法免疫3周龄SPF鸡10只,剂量为50 μg/只,3周后加强免疫一次,5周后以100倍鸡胚感染剂量(EID)的HA基因同源病毒对所有鸡进行攻毒.其间每周检测抗体水平变化,6周后以棉拭子进行泄殖腔病毒分离.结果为攻毒后免疫组鸡HI效价为9log2～10log2,对照组为2log2～4log2;免疫组病毒分离数为0/10,对照组为10/10.表明所构建的HA基因表达质粒可作为基因疫苗诱导鸡产生免疫保护反应.     

融合表达DEC205单链抗体和NS3蛋白的HCV DNA疫苗的免疫原性研究

为研发新型HCV DNA疫苗并探讨优化其免疫原性的策略,我们分析靶向树突状细胞(Dendritic cells,DC)的分子对HCV DNA疫苗免疫原性的影响。我们基于抗小鼠DC细胞表面分子DEC205/CD205的单克隆抗体DEC205的单链分子,构建可单独表达DEC205单链抗体或者与HCV非结构蛋白NS3融合表达的DNA表达质粒,并构建单独表达HCV非结构蛋白NS3的DNA表达质粒;经瞬时转染法鉴定HCV NS3及其与DEC205单链抗体融合蛋白的表达;随后采用注射结合电转的方式免疫Balb/C小鼠并研究各疫苗的体液(NS3特异性IgG抗体)与细胞免疫(IFN-γELISPOT)效果。结果表明:DEC205单链抗体基因与HCV NS3编码基因的融合可显著增强NS3特异的免疫应答;采用皮内注射加卡钳电极电转的方式可以产生最强的NS3特异性抗体和T细胞免疫反应。因此,通过DEC205单链抗体与HCV DNA疫苗靶抗原融合可明显增强免疫应答效果。该策略为HCV及其他类似病原的新型DNA疫苗研制提供重要依据。     

The Efficacy of a Live Attenuated TW I-Type Infectious Bronchitis Virus Vaccine Candidate

Virologica Sinica - Infectious bronchitis (IB) is a highly contagious avian disease caused by infection with infectious bronchitis virus (IBV), which seriously affects the development of the global...     

突变型乙肝病毒核心抗原DNA疫苗的体外表达

目的:构建突变型核心抗原核酸疫苗,观察该核酸疫苗在体外蛋白的表达.方法:采用基因工程定点突变技术,构建5种突变型核酸疫苗,分别去除乙肝病毒核心抗原N端的第1、2位氨基酸,命名为M12,去除3、4位氨基酸命名为M34以及去除5、6位的氨基酸命名为M56,用上述构建的核酸疫苗与野生型HBc核酸疫苗(pJW4303/Hc)及空载体质粒pJW4303分别用脂质体转染293T细胞,应用蛋白印迹法检测核心蛋白的表达.结果:经过pstl和BgI双酶切和测序鉴定结果突变型核心抗原核酸疫苗构建成功.在去除2个氨基酸的核酸疫苗结果中显示:野生型pJW4303/HBe、M12、及M56体外转染293T细胞后,在细胞上清和裂解中能很好的表达,而M34上清未见表达,仅裂解中可见极少量疑似表达条带;在原有基础上分别去除第3位和第4住氨基酸,命名为M3和M4,结果显示M3上清未见表达,裂解液中可见少量表达,而M4在上清和裂解中均可见明显的表达.结论:去除核心抗原N端第3位的氨基酸(M3)可以明显影响核心抗原的表达,HBcAg氨基端第3位氨基酸对蛋白的表达可能起到重要的作用.     

鸡新城疫病毒HeB02分离株F基因的克隆及其DNA疫苗的研究

根据GenBank报道的鸡新城疫病毒F基因序列设计了一对引物,以鸡新城疫病毒HeB02分离株基因组为模板,通过RT-PCR扩增出了1·66kb左右的F基因片段,序列分析表明HeB02株F基因与国内标准强毒株F48E9及弱毒疫苗La Sota和Clone30的F基因核苷酸序列的同源性分别为88·1%、84·9%和83·8%。将HeB02株F基因插入真核表达载体pVAX1中,构建了真核表达质粒pSV-F,通过脂质体转染COS-7细胞,SDS-PAGE分析可见表达的特异蛋白条带;Western blot、ELISA和中和试验检测结果表明:真核表达的蛋白与抗新城疫病毒的抗体发生特异性反应,说明F蛋白具有很好的免疫原性。采用活体电击法以真核表达质粒pSV-F免疫3周龄SPF鸡,剂量为50μg/只,3周后加强免疫1次,5周后以100倍鸡胚感染剂量(EID)的F基因同源病毒对所有鸡进行攻毒,攻毒前后每周分别以喉拭子进行病毒分离和HI效价测定。结果显示对照组在攻毒前一直没有检测到抗体效价,攻毒后检测效价为3·0log2±1·40,并且于攻毒后第9天全部死亡;活疫苗组和实验组免疫后第2周检测到抗体效价,第5周最高,HI效价分别为8·3log2±1·30和7·2log2±1·23,攻毒1周后HI效价分别达9·8log2±1·55和8·9log2±1·77,极显著高于对照组(P<0·01)。免疫组未分离到新城疫病毒,对照组全部分离到新城疫病毒。表明所构建的F基因真核表达质粒可作为候选基因疫苗诱导鸡产生免疫保护反应。     

携带HBV包膜大蛋白DNA疫苗的减毒沙门菌在小鼠诱导免疫应答

探索一种简便、有效的乙型肝炎病毒DNA疫苗免疫方法。将编码绿色荧光蛋白的真核表达质粒pEGFPN1转化到减毒鼠伤寒沙门菌SL7207,灌胃饲服BALB/c小鼠,流式细胞术检测出小鼠脾细胞内表达的绿色荧光蛋白;构建编码HBV包膜大蛋白的DNA疫苗pCIS1S2S,分别以SL7207为载体的口服途径或直接肌肉注射途径免疫BALB/c小鼠,检测小鼠的血清抗体、T细胞增殖和细胞毒性T淋巴细胞反应,结果表明两种免疫途径均能在小鼠体内诱生细胞和体液免疫应答,但口服途径诱导免疫应答的强度明显强于肌肉注射途径。口服携带HBV DNA疫苗的减毒伤寒沙门菌可能代表一种简便、有效的治疗乙型肝炎的新方法。 