抗乙肝病毒药物市场分析 *

乙型肝炎(乙肝)病毒(hepatitis B virus,HBV)是引起病毒性乙肝的主要病原体,依然是影响人类健康的全球性问题。干扰素和核苷(酸)类似物是国内外获批上市的主要抗乙肝病毒药物。替诺福韦和恩替卡韦在国外抗乙肝病毒药物市场上占据巨大的份额,而早期推出的拉米夫定和阿德福韦酯因其耐受性和安全性等原因所占市场份额逐年减少。国外有39种抗乙肝病毒新药正处于临床阶段。国内临床上使用更多的是口服核苷(酸)类似药物,尤其是恩替卡韦近年来占近一半抗乙肝药物市场。抗乙肝病毒药物城市零售前10的企业市场份额占整个零售的91.8%,市场集中度较高。虽然国内乙肝新药研发水平与欧美还存在较大差距,但是在国内创新政策推动下,出现了东阳光、正大天晴等20余家从事研发企业,并取得一定的成效。基于我国抗乙肝病毒药物发展困境,提出了继续完善抗乙肝病毒药物医保政策、部署和实施乙型肝炎重大专项等研发项目、推进产学研用深度融合等对策建议。     

HBV DNA环化结构在体外的复制表达水平优于HBV线性结构的表达质粒

为了研究乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）DNA环化结构与HBV线性结构的表达质粒在体外复制表达水平的差异,采用3种含有HBV全长DNA的表达质粒与自连环化的HBV DNA分别转染Huh7细胞. 5 d后收集转染处理过的Huh7细胞和细胞上清,从感染细胞中抽提纯化HBV复制中间体进行Southern印迹分析,并将细胞培养上清进行ELISA分析.结果显示,HBV DNA通过环化后转染Huh7细胞,可高效地进行转录和复制表达,且优于质粒转染的效果.证明在细胞中,HBV DNA环状结构的复制表达能力优于HBV线性结构的表达质粒.     

预测核苷(酸)类似物停药后慢性乙型肝炎复发的生化标记筛查及其临床应用

为探寻核苷(酸)类似物停药后慢性乙型肝炎复发的相关因素及可能血清标记,收集经核苷(酸)类似物治疗的乙型肝炎病毒e抗原(hepatitis B virus e antigen,HBeAg)阳性或阴性慢性乙型肝炎患者,根据治疗应答对其能否停药进行临床评估,分析达到停药标准患者的临床资料,包括性别,年龄,疗程,HBeAg水平,基线丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、HBV DNA,停药时的肝硬度值、HBV表面抗原(HBV surface antigen,HBsAg)水平、白细胞介素21(interleukin 21,IL-21)水平、外周血CD4~+IL-21~+T细胞频数。结果显示,共47例患者符合停药标准,其中HBeAg阳性26例,HBeAg阴性21例;平均年龄(42.45±14.08)岁。抗病毒疗程平均为(4.60±1.61)年。抗病毒治疗初始ALT值为(174.38±200.84)U/L;基线HBV DNA为(5.87±1.06)log拷贝/mL;停药时HBsAg精确定量平均为(1 104.82±1 328.11)IU/mL,IL-21平均为(729.82±427.39)pg/mL,CD4~+IL-21~+T细胞频数平均为(0.79±0.49)%,肝硬度测定F1 27例、F2 16例、F3 4例、F4 0例。共27例患者复发,1年内累积复发率为57.45%。Logistic回归单因素分析提示,慢性乙型肝炎患者停用核苷(酸)类似物后复发与服药总疗程及停药时IL-21水平、CD4~+IL-21~+T细胞频数、HBsAg水平有关;Logistic回归多因素分析则提示,停药时HBsAg和IL-21水平与复发有关。因此,停药时HBsAg和IL-21水平可作为慢性乙型肝炎患者停用核苷(酸)类似物后复发的预测因素。     

慢性肝炎中乙型和丙型病毒混合感染的重症化研究

在慢性肝炎中,乙、丙型病毒性肝炎混合感染相当多见,可使肝炎慢性化、重症化,肝组织损伤加重,肝硬化(LC)和肝癌(HCC)发生率增加[1]。本文应用血清学和分子生物学方法对196例肝病患者的血清进行检测,初步探讨了乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)、丙型肝类病毒(Hepatitis C virus,HCV)的复制状况以及两者间的相互作用与预后的关系。1材料和方法1.1病例受检的196例病例均为2004年1月至2005年7月我院住院及门诊病人,男149例,女47例,年龄15~82岁,其中慢性肝炎(CH)患者139例,肝硬化(LC)患者42例,肝癌(HCC)患者15例。所有病例诊断符合…     

慢性肝炎中乙型和丙型病毒混合感染的重症化研究

在慢性肝炎中,乙、丙型病毒性肝炎混合感染相当多见,可使肝炎慢性化、重症化,肝组织损伤加重,肝硬化(LC)和肝癌(HCC)发生率增加[1].本文应用血清学和分子生物学方法对196例肝病患者的血清进行检测,初步探讨了乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)、丙型肝类病毒(Hepatitis C viruS,HCV)的复制状况以及两者间的相互作用与预后的关系.     

Recent advances in research on hepadnaviral infection in the woodchuck model

The woodchuck model is an excellent animal model to study hepadnaviral infection. The new progresses in this model made possible to examine the T-cell mediated immune responses in acute and chronic hepadnaviral infection. Recently, a new assay for cytotoxic T-cells based on detection of CD107 was established for the woodchuck model. In addition, new immunotherapeutic approaches based on combination of potent antiviral treatment and DNA-protein vaccines were proven to be useful for treatment of chronic hepatitis B.     

Recent Advances in Research on Hepadnaviral Infection in the Woodchuck Model

The woodchuck model is an excellent animal model to study hepadnaviral infection. The new progresses in this model made possible to examine the T-cell mediated immune responses in acute and chronic hepadnaviral infection. Recently, a new assay for cytotoxic T-cells based on detection of CD107 was established for the woodchuck model. In addition, new immunotherapeutic approaches based on combination of potent antiviral treatment and DNA-protein vaccines were proven to be useful for treatment of chronic hepatitis B.     

乙型肝炎病毒变异株功能基因组研究及其临床意义

综述了近年对乙型肝炎病毒（HBV）变异株的复制、免疫学特性、致病性、耐药性等功能基因组研究及其临床意义的研究进展,阐述基因组水平研究HBV变异株功能的重要性及有关结果,展望今后HBV变异株生物学特性研究的方向。     

抗乙肝病毒shRNA表达载体转染条件的优化

目的优化抗乙肝病毒(HBV)短发夹样RN(A short hairpin RNA,shRNA)表达载体转染条件,从而克服过量转染所致细胞大批死亡的弊端,以便更客观地反映RNA干扰抗乙肝病毒的效率、方法,通过脂质体介导,将HBV真核表达载体pHBV1.3与我们以前研究确定为能有效抗乙肝病毒的shRNA表达载体pTZU6-C共同转染肝癌细胞HepG2,将共转染的两种质粒及所需的脂质体设立成不同浓度和比例,以pHBV1.3与不表达shRNA的空载体pTZU6的共转染作为未干扰阴性对照,转染36h后收集细胞,通过Southern杂交来观察乙肝病毒DNA明显复制和显著受抑时,所需pHBV1.3与pTZU6-C的最适剂量和比例,以及相应脂质体的用量;同时,通过Western杂交来观察HBV蛋白表达的变化。结果通过southern杂交,发现当将pHBV1.(3μg):pTZU6-C(μg)固定为6:1,脂质体(μl):质粒(μg)为1:1时,对于100ml培养瓶中90%以上融合的细胞,用3.5μl的脂质体共转染0.5μg pHBV1.3和3μg pTZU6-C,即可检测出HBV DNA的表达,此时,存活细胞总数不受任何影响;随着pHBV1.3量的增多,HBV DNA的表达亦增多;当pHBV1.3增至4μg时,虽然表达量增多,但存活的细胞总数却开始明显减少,存活细胞约为70%～80%;当用8μg时,存活的细胞不足40%～50%,检测水平反而下降。当pHBV1.(3μg):pTZU6-C(μg)为1:1时,即可观察到乙肝病毒DNA表达的明显抑制作用,其抑制率为71%;当两者的比例为1:2时,其抑制率为70%;比例为1:6时,抑制率为84%。Western杂交的结果亦证实,共转染0.5μgpHBV1.3和3μg pTZU6-C,即可检测出HBV蛋白的表达;但转染36h后,尚未能观察到HBV表面抗原(HBsAg)表达明显受抑的情况。结论抗乙肝病毒shRNA表达载体的转染条件需要优化,对于100ml培养瓶中90%以上融合的细胞,用6μl的脂质体共转染2μg pHBV1.3和4μg pTZU6-C,即可观察到明显的HBV表达和显著的RNA干扰抑制效果,本研究结果为下一步针对乙肝病毒不同靶区shRNA表达载体的转染奠定了坚实的基础。     

乙肝病毒感染对细胞基本自噬的影响

【目的】慢性乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染在肝硬化和肝癌的发生过程中起着重要的作用,通过研究HBV感染对细胞基本自噬的影响,为HBV感染诱发肝癌以及HBV的免疫逃逸机理研究提供新的思路。【方法】本研究利用乙肝病毒表达质粒瞬时或稳定转染不同肝细胞,通过计数绿色荧光蛋白(greenfluorescent protein,GFP)聚集数目检测自噬小体形成,western blot检测LC3(microtubule-associated proteinlight chain 3,微管相关蛋白质轻链3)脂酰化和p62的降解,通过构建HBV B型和C型X蛋白(HBx)的表达质粒并瞬时转染肝癌细胞和正常肝细胞,对不同基因型X蛋白对细胞自噬的影响进行了分析。【结果】乙肝病毒感染后促进了LC3的脂酰化和p62的降解,增加了自噬小体的形成,增强了细胞的基本自噬。进一步研究发现,HBV感染增强的细胞基本自噬水平由HBx所引发,且C型HBx比B型对细胞基本自噬的增加更加显著。【结论】HBV通过HBx增强细胞的基本自噬,且不同基因型HBx对细胞基本自噬的增强程度不同,为进一步阐明HBV感染机理奠定了基础。     

黑龙江省乙型肝炎血清流行病学调查分析

为了掌握黑龙江省乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)流行现状和人群免疫水平,评价我省儿童乙肝疫苗预防接种效果,为制订乙肝预防控制策略提供依据。采用横断面调查方法,选择全省7个国家级疾病监测点,在每个监测点随机抽取2个乡级单位,1～59岁作为目标人群共调查3337名人群。黑龙江省1～59岁人群乙肝病毒表面抗原(HBsAg)阳性率、乙肝病毒表面抗体(抗-HBs)阳性率和乙肝病毒核心抗体(抗-HBc)阳性率经标化后为5.65%、55.45%、30.50%,1～3岁人群乙肝表面抗原阳性率明显低于15～59岁人群。1～3岁、4～10岁和11～14岁人群乙肝疫苗全程接种率为99.43%、89.40%和64.81%;首针及时接种率分别为86.64%、75.57%和49.87。城市和农村HbsAg阳性率分别为3.26%和5.04%。医院出生儿童乙肝疫苗首针及时接种率高于在家出生儿童。结果显示接种乙肝疫苗可明显提高抗-HBs阳性率,提高人群对HBV的免疫保护能力,降低HBsAg携带率。     

应用RNAi文库筛选HBV复制相关基因

深入研究HBV复制机理,筛选参与HBV复制的基因,可能为开发抗乙肝病毒新药提供新 的靶点．本文拟建立一种筛选HBV复制相关基因的方法: RNAi文库感染HepG2.2.15细胞后,利用免疫磁珠收集HBsAg表达降低的细胞,提取DNA,PCR扩增siRNA编码序列,将PCR产物克隆入T-easy载体,随机挑选克隆测序,发现DDB1基因可能参与HBV复制．本试验建立了一种筛选HBV复制相关基因的方法,为大规模全基因组筛选参与HBV复制的基因奠定了基础．     

Antiviral effect of interferon-induced guanylate binding protein-1 against Coxsackie virus and Hepatitis B virus B3 <Emphasis Type="Italic">in Vitro</Emphasis>

Guanylate binding protein-1(GBP-1) is an interferon-induced protein. To observe its antiviral effect against Hepatitis B virus (HBV) and Coxsackie virus B3 (CVB3), we constructed an eukaryotic expression vector of human GBP-1(hGBP-1). Full-length encoding sequence of hGBP-1 was amplified by long chain RT-PCR and inserted into a pCR2.1 vector, then subcloned into a pCDNA3.1(−) vector. Recombinant hGBP-1 plasmids and pHBV1.3 carrying 1.3-fold genome of HBV were contransfected into HepG2 cells, and inhibition effect of hGBP-1 against HBV replication was observed. Hela cells transfected with recombinant hGBP-1 plasmids were challenged with CVB3, and viral yield in cultures were detected. The results indicated that recombinant eukaryotic expression plasmid of hGBP-1 was constructed successfully and the hGBP-1 gene carried in this plasmid could be efficiently expressed in HepG2 cells and Hela cells. hGBP-1 inhibit CVB3 but not HBV replication in vitro. These results demonstrate that hGBP-1 mediates an antiviral effect against CVB3 but not HBV and perhaps plays an important role in the interferon-mediated antiviral response against CVB3. Foundation item: National Natural Science Foundation (No.30271170, No.30170889).     

Antiviral Effect of Interferon-Induced Guanylate Binding Protein-1 against Coxsackie Virus and Hepatitis B Virus B3 in Vitro

Guanylate binding protein-1(GBP-1)is an interferon-induced protein.To observe its antiviral effect against Hepatitis B virus(HBV)and Coxsackie virus B3(CVB3),we constructed an eukaryotic expression vector of human GBP-1(hGBP-1).Full-length encoding sequence of hGBP-1 was amplified by long chain RT-PCR and inserted into a pCR2.1 vector,then subcloned into a pCDNA3.1(-)vector.Recombinant hGBP-1 plasmids and pHBV1.3 carrying 1.3-fold genome of HBV were contransfected into HepG2 cells,and inhibition effect of hGBP-1 against HBV replication was observed.Hela cells transfected with recombinant hGBP-1 plasmids were challenged with CVB3,and viral yield in cultures were detected.The results indicated that recombinant eukaryotic expression plasmid of hGBP-1 was constructed successfully and the hGBP-1 gene carried in this plasmid could be efficiently expressed in HepG2 cells and Hela cells.hGBP-1 inhibit CVB3 but not HBV replication in vitro.These results demonstrate that hGBP-1 mediates an antiviral effect against CVB3 but not HBV and perhaps plays an important role in the interferon-mediated antiviral response against CVB3.     

向下转膜法在乙肝病毒Southern杂交中的应用

目的评价向下转膜法在乙肝病毒(HBV)Southern杂交中的应用效果。方法用带有1.3倍HBV基因的真核表达载体转染HepG2细胞,使其产生瞬时HBV表达,72小时收集细胞并提取细胞总DNA,琼脂糖凝胶电泳后,以向上和向下两种方式转移在尼龙膜上;用化学发光标记和检测试剂盒将乙肝病毒基因片段标记成探针,再与向上和向下转膜后的尼龙膜进行杂交,判断产生明显HBV杂交条带所需的细胞总DNA量,从而验证向下转膜法在乙肝病毒Southern杂交中的应用效果。结果发现向下转膜后,检测HBV表达所需的细胞总DNA量极少,灵敏度高,0.5μg细胞总DNA电泳后转膜,即可检测出HBVDNA的表达,凝胶中仅有8%的DNA残留;而向上转膜所需的总DNA量大,灵敏度低,25μg的细胞总DNA电泳后转膜,仅能检测出弱的条带。结论向下转膜法是一种较好的转膜方式,适于对乙肝病毒的Southern杂交,值得推广应用。     

eNOS基因（894G／T）多态性与HBV感染

为探讨HBV感染临床转归与eNOS基因多态性的关系,选择传染科门诊及住院部2002.2-2004.2诊治的无亲缘关系的重庆地区汉族居民2400人,采用聚合酶链反应(PCR)及限制性内切酶技术检测eNOS exon7位点894G/T多态性,应用SPSS软件χ2检验进行统计学处理:首先Hardy-Weinberg平衡检验Pa>0.01,表明拟合度优良,收集病例有良好的代表性;其次乙肝病毒携带与其余任何组比较(急乙肝与肝癌组因例数太少除外)等位基因频率与基因型频率Pb<0.05,乙肝病毒携带 慢乙肝组与肝硬化 重症肝炎组等位基因频率与基因型频率比较Pb<0.05。以非条件logistic回归校正年龄及性别因素进行分层分析,在隐性模式和共显性模式下,eNOS基因位点894G/T SNP与HBV感染后疾病的携带状态显著关联。与894G/T和T/T基因型相比,G/G基因型的个体发展为携带状态的易感性显著增高(隐性模式:OR=1.428 95%CI=1.050-1.942;共显性模式:OR=1.310 95%CI=1.025-1.676)。     

乙肝治疗性疫苗的研制与临床应用

尽管乙肝预防性疫苗非常有效,我国仍有约9300万乙肝病毒(HBV)携带者。抗病毒治疗疗效有限,患者长期使用容易产生耐药性。因此,研制乙肝治疗性疫苗可补充甚至替代目前的抗病毒治疗。T细胞免疫对于乙肝病毒的控制和清除至关重要,目前已经设计出蛋白疫苗、表位多肽疫苗以及DNA或病毒载体疫苗通过临床试验检验其疗效。将就研制乙肝治疗性疫苗这一日益活跃的领域加以概述,着重评价疫苗的细胞免疫应答和临床疗效。