脱Ca~（2＋）与结合Ca~（2＋）蝮蛇毒酸性磷脂酶A_2晶体的培养和X射线衍射数据

钙离子是磷脂酶Ａ２催化必须的铺因子,以蝮蛇毒酸性磷脂酶Ａ２为材料,采用在晶体培养液中加入ＥＤＴＡ或ＥＧＴＡ螯合剂络合法除去ＰＬＡ２中可能有的Ｃａ＾２＋离子和加入ＣａＣｌ２以确保ＰＬＡ２能克分结合上钙离子的方法培养充分结合Ｃａ＾２＋和脱Ｃａ＾２＋的ＰＬＡ２晶体。加了螯合剂后长出的晶体为长棒状六方柱,加Ｃａ＾２＋离子后长出的晶体则为短粗的六方柱。经Ｘ射线鉴定两种晶体为同晶型,空间群为Ｐ６１,晶胞参数很     

蝮蛇毒酸性磷脂酶A_2的空间晶体生长

对血小板聚集抑制剂—蝮蛇毒酸性磷脂酶A_2结晶研究的基础上,进行了空间结晶买验,与地面对照实验结果比较,空间的微重力环境对该酶的晶体生长有明显的改进作用.     

高血压大鼠红细胞膜Ca~（2＋），Mg~（2＋）─ATP酶对Ca~（2＋）反应的变化及Mg~（2＋）的作用

本实验观察了正常及高血压大鼠红细胞膜Ｃａ２＋,Ｍｇ２＋－ＡＴＰ酶对不同浓度Ｃａ２＋及Ｍｇ２＋的反应。结果表明：（１）在自发性高血压大鼠（ＳＨＲ）,此酶最适反应的Ｃａ２＋浓度为１０－６ｍｏｌ／Ｌ;ＷＫＹ大鼠为１０－４ｍｏｌ／Ｌ;两肾一环型肾性高血压大鼠（ＲＨＲ）为１０－７ｍｏｌ／Ｌ,Ｗｉｓｔａｒ大鼠为１０－４ｍｏｌ／Ｌ,Ｃａ２＋高于以上各相应浓度时该酶活性受到抑制;（２）作为该酶激动剂的Ｍｇ２＋有其最适激活浓度,在ＷＫＹ大鼠、ＲＨＲ及Ｗｉｓｔａｒ大鼠均为４．５ｍｏｌ／Ｌ;（３）高浓度Ｍｇ２＋（３６．０ｍｏｌ／Ｌ）可以逆转高浓度Ｃａ２＋对该酶的抑制作用。以上结果表明,底物Ｃａ２＋浓度的变化对Ｃａ２＋,Ｍｇ２＋－ＡＴＰ酶的催化活性影响极大,该酶活性的促发及维持必须有适宜浓度的Ｍｇ２＋。高血压时此酶对Ｃａ２＋的敏感性增高,且Ｍｇ２＋对酶保护作用更为明显。本结果提示,胞内高浓度Ｃａ２＋不仅是高血压发生的原因之一,并可能与其发展及恶化有关。     

神经节苷脂（Gangliosides）对人红细胞膜Ca~（2＋）－Mg~（2＋）ATPase的影响

神经节苷脂（Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ）是红细胞膜Ｃａ~（２＋）－Ｍｇ~（２＋）ＡＴＰａｓｅ的一种激活剂,这种激活作用也是依赖于Ｃａ~（２＋）存在。在２００μｍｏｌ／ＬＣａ~（２＋）存在的反应体系中,１００μｇ／ｍＬＧａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ对Ｃａ~（２＋）－Ｍｇ~（２＋）ＡＴＰａｓｅ的激活作用最大,为基本酶活性的１５０％以上。实验还发现ＣａＭ拮抗剂三氟拉嗪（ＴＦＰ）、粉防已碱（Ｔｅｔ）等也同样抑制Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ的这种激活作用。其抑制的ＩＣ_（５０）值为２５μｍｏｌ／Ｌ和３０μｍｏ１／Ｌ;而此浓度下抑制剂存在的反应体系中,对Ｃａ~（２＋）－Ｍｇ~（２＋）ＡＴＰａｓｅ的基本活性影响不大。     

培养大鼠心肌细胞缺氧与复氧时H~＋－Ca~（2＋）交换的研究

大量研究表明：心肌细胞缺氧后再复氧，可因氧反常和ｐＨ反常造成细胞内Ｃａ２＋超载。通常认为，在心肌细胞发生ｐＨ反常后，Ｈ＋－Ｎａ＋和Ｎａ＋－Ｃａ２＋交换加强是细胞内Ｃａ２＋超载的重要机制。本实验结果表明：阻断了Ｈ＋－Ｎａ＋和Ｎａ＋－Ｃａ２＋交换后，仍有部分Ｃａ２＋进入细胞，Ｃａ２＋内流量与缺氧时间成正比关系。在无Ｎａ＋溶液中也得到了同样结果，表明此时Ｃａ２＋内流是通过与Ｎａ＋无关的通路进入细胞的。进一步实验表明这种Ｃａ２＋内流与细胞膜内外ｐＨ梯度差密切相关。当胞外ｐＨ升高即胞内相对Ｈ＋浓度增加时，Ｃａ２＋内流量也增加。故推测：ｐＨ反常所致细胞内Ｃａ２＋超载的原因，除Ｈ＋－Ｎａ＋和Ｎａ＋－Ｃａ２＋交换外，尚有Ｈ＋－Ｃａ２＋交换机制。     

江浙蝮蛇毒中性磷脂酶A_2的荧光光谱学研究

用荧光光谱方法研究了江浙蝮蛇毒中性磷脂酶A_2(NPLA_2).研究结果表明NPLA_2分子中确实含有一个色氨酸残基.且位于NPLA_2分子表面;我们还发现荧光探针bis-ANS在NPLA_2分子上有一结合区,其解离平衡常数为11.6μmol/L ;利用结合了的bis-ANS与NPLA_2分子中色氨酸残基之间的能量传递计算出两者之间的距离为17.7(?).     

江浙蝮蛇毒溶血毒素晶体培养及初步晶体学研究

从江浙蝮蛇中分离纯化的碱性磷脂酶Ａ２在ｐＨ９．５,０．０５ｍｍｏｌ／ＬＣＨＥＳ缓冲液中,用汽相悬滴扩散的方法,获得了适用于高分辨率Ｘ射线结构分析的单晶．经Ｘ２００Ｂ面探测器分析,表明该晶体属于正交晶系,Ｐ２Ｉ２Ｉ２Ｉ空间群,晶胞参数为ａ＝９７．１３,ｂ＝１０３．６９,ｃ＝２３．２７．并收集了一套衍射数据,独立衍射点数１２００１个,数据完整度为８６．２％,Ｒｍｅｒｇｅ为０．０４５９．最高分辨率达２．０,根据分子量与晶胞体积估算,一个不对称单位含两个分子．     

尖吻蝮蛇毒酸性磷脂酶A2的新晶型结构

从尖吻蝮蛇毒中分离出一种酸性磷脂酶A2 ,得到了一种新的晶型。用分子置换法测定其晶体结构 ,结构的分辨率达到 0 .2 8nm。该结构给出 2 1.9%的晶体学R因子 (R free =2 5 .7% )和合理的立体化学参数。与已报道的晶型相似 ,不对称单元的两个独立分子形成二体 ,揭示了这种二体的稳定性。二体的形成过程也伴随着 14～ 2 3肽段显著的构象变化 ,这一肽段属于磷脂酶A2 的界面识别部位。氨基酸序列分析表明 ,带正电荷的 34位残基是所有第二类具有溶血活性磷脂酶A2 的共同特点。NaCl对晶体的堆积具有显著的影响 ,从而导致晶胞参数的明显改变。与已报道的晶型不同 ,在酶分子的疏水通道内观测到了 2 甲基 2 ,4戊二醇 (2 methyl 2 ,4 pentanediol,MPD)分子     

蝮蛇毒碱性磷脂酶A_2基因的克隆

从蝮蛇毒腺中抽提总ＲＮＡ．利用人工合成寡核苷酸引物作逆转录,以ｃＤＮＡ为模板进行体外扩增,获得磷脂酶Ａ２（简称ＰＬＡ２）基因,克隆至ｐＢＳ－ｋｓ载体中。通过对３个碱性ＰＬＡ２（简称ＢＰＬＡ２）基因单独克隆分别作ＤＮＡ全序列分析,推导ｐｒｏ－ＢＰＬＡ２由１３８个氨基酸残基构成,与已测定的部分氨基酸序列比较,基本相符。该基因成功的克隆,不仅推导出ＢＰＬＡ２的蛋白质全序列,也为进一步开展蛇毒功能肽蛋白质工程的研究工作打下了良好的基础。     

稀土对肌质网Ca~（2＋）－ATP酶活性的影响

研究了镧、轧、镱及四种配合物对Ｃａ~（２＋）－ＡＴＰ酶活性的影响．结果表明,低浓度的Ｌａ~（３＋）,Ｇｄ~（３＋）和Ｙｂ~（３＋）对肌质网Ｃａ~（２＋）－ＡＴＰ酶有激活作用;随着其浓度的增加,它们对酶活性的抑制程度增大;而Ｌａ~（３＋）,Ｇｄ~（３＋）和Ｙｂ~（３＋）对纯化的Ｃａ２~（＋）－ＡＴＰ酶则只有抑制作用;Ｇｄ─Ｎ─乙酰─缬氨酸和Ｙｂ─丙氨酰代丙氨酸配合物对肌质网膜和纯化的Ｃａ~（２＋）－ＡＴＰ酶活性的影响与Ｇｄ~（３＋）及Ｙｂ~（３＋）类似,但其激活程度和抑制程度比Ｇｄ~（３＋）及Ｙｂ~（３＋）小;Ｇｄ─ＤＴＰＡ和Ｙｂ－ＤＴＰＡ对Ｃａ２~（＋）－ＡＴＰ酶活性基本无影响。     

江浙蝮蛇毒碱性磷脂酶A2单斜晶体的培养和晶体学研究

江浙蝮蛇毒碱性磷脂酶Ａ_２单斜晶体的培养和晶体学研究牛秀田,孟五一,桂璐璐,王小强,林政炯（中国科学院生物物理研究所生物大分子国家重点实验室,北京１００１０１）顾培忠,周元聪（中国科学院上海生物化学研究所,２０００３１）关键词江浙蝮蛇毒碱性磷脂酶Ａ_２...     

钙离子对江浙蝮蛇毒酸性磷脂酶A_2结构与功能的影响

钙离子在江浙蝮蛇毒酸性磷脂酶Ａ_２中的作用是多方面的。它不仅能够引起酸性磷脂酶Ａ_２在溶液中构象的变化,而且对该酶活性有较大的影响。Ｃａ~（２＋）为酶活力所必需,当Ｃａ~（２＋）浓度达到０．０６ｍｍｏｌ／Ｌ时,酶表现出很高的活力;Ｃａ~（２＋）浓度超过０．５ｍｍｏｌ／Ｌ时,催化反应出现一个明显的延滞期。化学修饰表明Ｈｉｓ_（４７）在表现活力方面起重要作用,Ｃａ~（２＋）的存在可降低其修饰反应的速度,提示这是由于Ｃａ~（２＋）引起构象发生变化而造成的。     

尖吻蝮蛇毒酸性磷脂酶A_2I的表达及其生化特征

将尖吻蝮蛇毒酸性磷脂酶 Ａ２ Ｉ（ Ａ．ａ Ａ Ｐ Ｌ Ａ２ Ｉ） 的基因克隆至表达载体ｐ Ｂ Ｌ Ｍ Ｖ Ｌ２ , 在大肠杆菌 Ｒ Ｒ１ 中成功表达。表达产物 Ａ．ａ Ａ Ｐ Ｌ Ａ２ Ｉ约占细菌蛋白质总量的３０ ％ , 以包含体的形式存在。纯化包含体后, 将产物变性、复性, 然后用 Ｆ Ｐ Ｌ Ｃ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ Ｔ Ｍ１２ 纯化, 产物经过 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 检测只有单一条带。对表达的 Ａ．ａ Ａ Ｐ Ｌ Ａ２ Ｉ进行了酶活性、抑制血小板聚集活性和溶血活性的测定。结果显示, 表达的 Ａ．ａ Ａ Ｐ Ｌ Ａ２ Ｉ的酶活性同变性后复性江浙蝮蛇酸性磷脂酶 Ａ２（ Ａ Ｐ Ｌ Ａ２） 的酶活性相近, 既具有抑制血小板聚集活性也具有溶血活性。最后对磷脂酶 Ａ２（ Ｐ Ｌ Ａ２） 的结构与这些活性的关系进行了讨论     

尖吻蝮蛇毒酸性磷脂酶A_2Ⅱ的表达及其生化特征

将尖吻蝮蛇毒酸性磷酯酶 A2 ( A.a APLA2 )基因克隆至温敏表达载体 p BLMVL2 ,在大肠杆菌 RR1中成功诱导表达 .表达产物 A.a APLA2 约占细菌蛋白质总量 2 5 % ,并以包涵体形式存在 .纯化包涵体后 ,将产物变性、复性 ,然后用 FPLC Superose TM1 2纯化 ,产物经过 SDS- PAGE检测只有单一条带 .对纯化后的表达 A.a APLA2 进行了酶活性、抑制血小板聚集活性和溶血活性的测定 .结果显示 ,A.a APLA2 的酶活性处于变性后复性江浙蝮蛇酸性磷脂酶 A2 和碱性磷脂酶A2 的酶活性之间 ,没有抑制血小板聚集活性 ,只有微弱溶血活性 .最后对 PLA2 的结构与这些活性的关系进行了讨论     

缺氧心肌收缩蛋白Ca~（2＋），Mg~（2＋）－ATP酶活性研究

将大鼠置于模拟海拔８ｋｍ高度的低压舱内缺氧１周及缺氧后空气中常氧恢复１周和２周,观察了左右心室功能、心肌肥厚、心肌收缩蛋白含量及其Ｃａ￣（２＋）,Ｍｇ￣（２＋）－ＡＴＰ酶活性的动态变化。结果表明,８ｋｍ缺氧１周后肺动脉压及右心室收缩压明显升高,左右心室±ｄｐ／ｄｔｍａｘ及收缩指数明显降低。左右心室肌明显肥厚,心肌收缩蛋白Ｃａ￣（２＋）,Ｍｇ￣（２＋）－ＡＴＰ酶活性明显减低。缺氧后常氧恢复１和２周后,左右心室功能逐渐恢复达到或接近正常水平,心肌肥厚逐渐减轻或恢复正常,心肌收缩蛋白Ｃａ￣（２＋）,Ｍｇ￣（２＋）－ＡＴＰ酶活性也逐渐升高。因此说明：心肌收缩蛋白Ｃａ￣（２＋）,Ｍｇ￣（２＋）－ＡＴＰ酶活性的改变是心功能变化的重要生化基础之一,它的减低是缺氧心肌对环境的代偿适应。     

Ca~（2＋）与含β－桐酸磷脂脂质体的相互作用

通过测定含β－桐酸（β－ＥＳＡ）的双棕榈酰磷脂酰胆碱（ＤＰＰＣ）脂质体在加入Ｃａ（２＋）后浊度,粒度及内包荧光物释放的变化,研究了Ｃａ（２＋）与ＤＰＰＣ／β－ＥＳＡ脂质体的相互作用,结果表明,ＤＰＰＣ／β－ＥＳＡ脂质体是一类对外加Ｃａ（２＋）敏感的脂质体,Ｃａ（２＋）的作用首先是引起脂质体间的集聚然后使脂质体融合;此时加速脂质体内包荧光物的释放。     

神经节苷脂GM_3对肌质网Ca~（2＋）－ATP酶活力的调节

研究了神经节苷脂ＧＭ_３参入肌质网膜后Ｃａ~（２＋）－ＡＴＰ酶活力的变化,结果表明：ＧＭ_３参入肌质网膜后,对肌质网Ｃａ~（２＋）ＡＴＰ酶活性（ＡＴＰ水解活力与转运活力）有明显的激活作用．当参入的ＧＭ_３浓度为８μｍｏｌ／Ｌ、参入时间为１２０ｍｉｎ、温度为３０℃时,对Ｃａ~（２＋）－ＡＴＰ酶的激活作用最大．     

江浙蝮蛇毒酸性与碱性磷脂酶A_2溶液构象变化的差示扫描量热法研究

运用差示扫描量热法,在不同ｐＨ值的缓冲溶液内和各种浓度的碱土族氯化物溶液内,研究了来自江浙蝮蛇（ＡｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎｈａｌｙｓＰａｌｌａｓ）毒的酸性与碱性磷脂酶外Ａ２（ＰＬＡ２）的热变性过程。得到表征这两种酶溶液构象变化的热力学参数。依据这些参数研究了两者的溶液构象及其变化。在ｐＨ４．５以下,分子净荷正电的这两种酶在溶液中不形成可热致伸展的有序构象;ｐＨ高于４．５时,Ａｓｐ和Ｇｌｕ的侧链羧基以负离子形式存在有利于有序构象的稳定。Ｈｉｓ是决定ＰＬＡ２活力和热稳定性的重要残基。磷酸根离子和这两种酶有结合作用而降低有序构象的热稳定性。碱土族阳离子除和这两种酶结合外,还以依赖于离子强度的方式复杂地影响酶的溶液构象,但其作用不完全是静电性的,是或多或少地随离子的不同而不同的。计算给出酸性ＰＬＡ２的△Ｈｃｄ．     

脑缺血诱导Ca~（2＋）／CaM依赖性蛋白激酶Ⅱ自身磷酸化的抑制作用

脑缺血诱导Ｃａ~（２＋）／ＣａＭ依赖性蛋白激酶Ⅱ自身磷酸化的抑制作用张光毅,唐放鸣,赵昇皓（徐州医学院生化教研室,２２１００２）关键词脑缺血;Ｃａ~（２＋）／ＣａＭ依赖性蛋白激酶Ⅱ;自身磷酸化兴奋住氨基酸通过其突触后膜受体导致ｏｄｅ内流,不仅具有诱导和...