蔗糖-葡萄糖双功能酶传感器的研究

结合蔗糖转化酶(INV)酶管与葡萄糖氧化酶(GOD)-葡萄糖变旋酶(MUT)双酶电极构成一种新的蔗糖传感器。该传感器可以分别用于蔗糖及葡萄糖的测定。蔗糖经酶管作用产生α-D-葡萄糖,再用COD-MUT双酶电极定糖。若是样品中蔗糖和葡萄糖共存,比较样品流经不同路径(Ws和Wg)时传感器的响应值,可以排除葡萄糖对蔗糖测定的干扰。传感器的最适pH和温度范围分别为:5.0—6.5和30—40℃。在稳态法实验中,传感器的线性范围为:2.5×10~(-4)—5×10~(-3)mol/L。传感器的重复性很好,CV<1％。该传感器在用于测定发酵培养基(含葡萄糖)的蔗糖含量,平均回收率为97.9％。传感器与糖度计法测定的相关系数为0.997。传感器至少可以稳定使用8天以上。     

诱导温度调控华根霉(Rhizopus chinensis)前导肽脂肪酶的表达及稳定性研究

比较了7 L发酵罐中不同诱导温度对华根霉前导肽脂肪酶在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达水平和稳定性的影响。通过实验表明在28℃条件下,最大酶活可以达到1412.5 U/mL,是30℃条件下的2.3倍,25℃条件下的1.3倍;而其产率可以达到12811 U/L·h~(-1),比产率达到82.6 U/g_(DCW)·h~(-1)。同时,在实验过程中发现诱导温度对目的蛋白的降解和聚合有重要的影响。通过对蛋白酶活性的测定和还原SDS-PAGE证实随着诱导温度的提高,蛋白酶活性急剧上升,从而导致由前导肽(37 kD)降解为成熟肽(30 kD)的降解作用的加剧。此现象在30℃条件下最为明显,在诱导84 h时前导肽已经全部降解为成熟肽。另外,通过非还原SDS-PAGE和分析表明随着诱导温度的提高也导致了二聚体的含量也逐渐增加。     

红平红球菌絮凝基因提取及絮凝剂对血红素肽-铁絮凝特性

优化了红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)絮凝基因(NOC-1)的提取条件,探讨了该菌种发酵产生的微生物絮凝荆(MBF)对猪血红蛋白酶解的主要产物-血红素肽铁的絮凝特性.结果表明:采用溶菌酶与CTAB相结合方法,在水浴温度为65℃,时间为20 min条件下,提取絮凝基因,获得了清晰平整明亮的DNA条带,无明显弥散,DNA提取量多且断裂少,利用PCR扩增出了产絮凝基因(NOC-1)16S rRNA,测定并分析了产絮凝基因片段的1400 bp碱基组成.该MBF对猪血红蛋白酶解主要产物,即血红素肽铁絮凝特性与溶液的pH、温度、絮凝方式等有关,当猪血红蛋白酶解溶液pH值为6.0,絮凝温度45℃,结合超声波处理,MBF对血红素肽铁的絮凝率达到最佳,且絮凝沉降规律为拥挤沉淀,絮凝杌理为该菌种产生的MBF为粘多糖,分子上的活性基团(羧基、羟基、氨基等)借助离子键、氢键和范德华力,吸附血红素肽铁形成微粒,并通过架桥方式将2个或更多的微粒交联在一起从而导致絮凝.     

浙江蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒激肽释放酶Ⅰ的分离纯化及其性质的研究

浙江产蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒中含有激肽释放酶,不需活化即可水解激肽原,释放激肽,并具有较弱的精氨酸酯酶的活力。粗毒经DEAE纤维素(DE-22,DE-52)和Sephadex G-75分离纯化后,可得到两个激肽释放酶的组分:Ⅰ与Ⅱ,二者电泳行为与酶活力有所不同,激肽释放酶Ⅰ在聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈一条带,而组分Ⅱ中还杂有少量组分Ⅰ。激肽释放酶Ⅰ为一糖蛋白,含糖量20.3%,约由221个氨基酸残基组成,凝胶过滤和SDS电泳测定其分子量分别为31,000和30,000。此酶具有严格的底物专一性,能作用于激肽释放肽的专一底物Z-Phe-Arg-MCA及Bz-Pro-Phe-Arg-PA,不作用于一般蛋白质底物酪蛋白,对TAME的水解速度仅是对BAEE的14%。以BAEE为底物时,其最适pH为8～9,K_m值为2.85×10~(-4)M。本文测定了不同pH和不同温度下酶的稳定性,pH低于5或大于9,温度在40℃以上,酶活力迅速下降。其精氨酸酯酶及激肽释放酶的活力均能被丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF和DFP所抑制,两者呈平行关系,但都不被胰蛋白酶的专一抑制剂TLCK所抑制,慈菇抑制剂与大豆(Kunitz)抑制剂对此酶有部分抑制作用。经磷酸纤维素等阳离子交换树脂层析或交联的慈菇抑制剂Sepharose-4B亲合层析也能提纯激肽释放酶Ⅰ,但提纯后精氨酸酯酶活力下降,激肽释放活力几乎全部丧失。经圆二色光谱测定表明,酶的构象已发生改变。     

质量肽谱在蛋白质结构研究中的应用

蛋白质的一级结构始终是生物学家关心的一个焦点,他们通常使用肽谱分析的方法测定蛋白质的一级结构。肽谱是一种技术,它使用特异性的酶或化学的方法,将蛋白质降解成小肽,然后进行分离和分析[1]。肽谱在蛋白质研究中起着重要的作用,它可以确证蛋白质的序列,用于蛋白质鉴定;鉴定翻译后的修饰及体外的化学修饰;检测单个氨基酸的变异(即突变);鉴定不同的蛋白构型;也可用于产生核苷酸探针检测ＤＮＡ文库;合成多肽诱导...     

人的体温调节

体温是指人体深部血液的平均温度而言,是相对恒定的,通常以直肠温度(约37.5℃)、口腔温度(约37.2℃)和腋窝温度(约36.8℃)来表示.其中直肠温度比较接近于深部体温,且较稳定,但测量不方便. 人体内各器官的温度,由于各器官代谢水平不同而略有差异.肝脏温度为38℃左右,在全身最高.大脑产热也较多,其温度接近38℃.肾脏、胰腺、十二指肠等要低些. 体表各部分皮肤温度的数值差别较大.在环境温度为23℃时测定,足的皮肤温度是27℃,手为30℃,躯干为32℃,头为33℃.由此可以看出四肢末梢皮肤温度低,越近躯干处的皮肤温度越高.身体左右两侧皮肤温度通常是相同的. 皮肤温度的高低与局部血流量有密切关系.凡能影响皮肤血管舒缩的因素(如环境温度变化或情绪紧张、激动等)都能对皮肤温度产生     

大肠杆菌抗药性质粒R144drd3温度敏感突变型的分离

温度敏感突变型可用于研究DNA复制的控制机制,也可用于测定质粒的拷贝数,还可作为遗传分析研究的工具。抗药性质粒R144drd3是去阻遏、抗卡那霉素、Ej-质粒,转移频率在10^-3-10^-1之间,是国内外实验室在分子遗传学研究中常用的抗药性质粒。 我们用整体诱变的方法,获得了抗药性质粒R144drd3温度敏感突变型。对其中一菌株进行温度敏感效应侧定,42℃ 表现温度敏感。进行温度敏感部位测定,结果证明,大肠杆菌抗药性质粒R144drd3经诱变剂亚硝基腮处理后产生的温度敏感突变型属于抗性基因温度敏感突变型。回复突变频率为4.5 X 10^-8.     

温度对三种满江红光合及固氮活性的影响

本文报道满江红(Azolla imbricata)、卡洲满江红(A.caroliniana)和蕨状满江红(A.filiculoides)的光合与固氮(乙炔还原)活性对温度的反应差异。根区培养液温度在7—40℃范围内满江红与卡洲满江红的光合活性在30℃达到峰值,高于或低于30℃均急剧下降。而蕨状满江红在7—25℃的根区温度范围内光合活性差异不大,高于25℃则下降(图2)。0℃24小时或40℃2小时暗预处理对三种满江红光合活性与乙炔还原活性表现出不同影响(图3,4)。本文报道的方法可用于满江红生理生态参量的比较研究。     

温度对三种满江红光合及固氮活性的影响

本文报道满江红(Azolla imbricata)、卡洲满江红(A. caroliniana)和蕨状满江红(A. filiculoides)的光合与固氮(乙炔还原)活性对温度的反应差异。根区培养液温度在7—40℃范围内满江红与卡洲满江红的光合活性在30℃达到峰值,高于或低于30℃均急剧下降。而蕨状满江红在7—25℃的根区温度范围内光合活性差异不大,高于25℃则下降(图2)。0℃24小时或40℃2小时暗预处理对三种满江红光合活性与乙炔还原活性表现出不同影响(图3,4)。本文报道的方法可用于满江红生理生态参量的比较研究。     

蔗糖—葡萄糖双功能酶传感器的研究

结合蔗糖转化酶酶管与葡萄糖氧化酶－葡萄糖变旋酶双酶电极构成一种新的蔗糖传感器。该传感器可以分别用于蔗糖及葡萄糖的测定。蔗糖经酶管作用产生α－Ｄ－葡萄糖,再用ＧＯＤ－ＭＵＴ双酶电极定糖。若是样品中蔗糖和葡萄糖共存,比较样品流经不同路径时传感器的响应值,可以排除葡萄糖对蔗糖测定的干扰。传感器的最适ｐＨ和温度范围分别为：５．０－６．５和３０－４０℃,在稳态法实验中,传感器的线性范围为：２．５×１０＾－４     

980 nm半导体激光照射对种植体表面结构和温度影响的实验研究

目的:980 nm半导体激光可用于种植体周围软组织处理和种植体周围炎治疗,但其对种植体的作用尚未完全被了解。本文研究980 nm半导体激光照射对种植体表面结构和温度变化的影响,以期为临床使用参数设置和操作方法提供依据。方法:980 nm半导体激光照射纯钛圆盘试件,扫描电镜观察钛盘表面结构变化,热电偶检测钛盘温度变化范围和到达骨组织损伤温度升高阈值(10℃)的照射时长。结果:实验全部参数设置下980 nm半导体激光照射,钛盘表面结构均无明显改变。脉冲模式输出功率1 W,移动照射20 s钛盘温度上升19.8℃;经过10.2 s钛盘温度升高可达10℃。连续输出模式或增加输出功率,钛盘温度显著上升,并可在数秒内超过10℃。结论:980 nm半导体激光照射对种植体表面结构无损伤,但存在种植体温度升高造成周围组织热损伤的风险。     

胰蛋白酶消化法测定牛胶原蛋白三股螺旋结构的含量

本研究建立了一种测定胶原蛋白的三股螺旋结构含量的方法。该方法通过使用柱前衍生高效液相色谱(HPLC)法表征经胰蛋白酶酶解后胶原蛋白羟脯氨酸(Hyp)质量浓度的变化,进而对胶原蛋白的三股螺旋结构进行定量。探讨了不同的酶解时间(0~48h)、酶与底物的比例(1∶100、1∶50和1∶20)和温度(20、25、30、37℃)对明胶降解率的影响。获得了酶解的最佳条件——当胰蛋白酶与底物的比例为1∶50时,25℃酶解3h。使用该方法对明胶胶原蛋白混合液检测,结果表明,该方法能灵敏(RSD<10%)的测定胶原蛋白三股螺旋结构的含量。该方法不仅可用于生物组织研究领域,也可用于胶原蛋白食品、保健品和组织工程产品质量的评价。     

泛肽的结构与功能

泛肽(ubiquitin)是一种活细胞内普遍存在的小分子蛋白质,分子量仅8565道尔顿,为76个氨基酸组成的单链多肽。以前根据牛和人泛肽氨基酸顺序测定的结果,认为它是一条羧基末端含精氨酸的74肽;后来才知道,76肽才是泛肽的真正活性分子。从不同种属分离提取的泛肽,在进化过程中其氨基酸顺序保存得完好,例如,从昆虫、乌龟、牛及人红细胞里鉴定出的泛肽,其1～74位氨基酸顺序完全相同。泛肽的理化性质颇为独特,它虽含有7个赖氨酸和4个精氨酸,但却能耐受胰蛋白酶特异性消化,pH 与温度变化也不影响其稳定性。核磁共振(NMR)研究表明,pH1.18～8.48和23～80℃温差范围     

火龙果抗寒性研究

试验材料选取3种火龙果品种红皮红肉、红皮白肉、黄皮白肉的3个月生幼苗,挑选生长良好、长势基本相同的幼苗置于人工气候箱,设置0℃、2℃、4℃、6℃、10℃、15℃共6个温度处理,以未处理为对照,低温处理12 h后取枝条测定丙二醛(MDA)、超氧化歧化酶(SOD)、可溶性蛋白、脯氨酸(PRO)等抗寒性生理生化指标。结果表明,不同的温度处理下,3种火龙果幼苗的MDA、SOD、可溶性蛋白、PRO做出的响应差别显著。不断地降低处理温度后,其SOD活性增强,MDA、可溶性蛋白以及PRO含量均呈现升高的趋势。实验表明这4种变化指标能够用于3种火龙果幼苗的抗寒性测定,3种火龙果中红皮白肉抗寒性最强,红皮红肉居中,黄皮白肉抗寒性较弱。     

棉铃虫成虫期的呼吸代谢及其能量消耗

在25℃下,用Gilson示差呼吸计测定了棉铃虫成虫期静止时的呼吸代谢。雌、雄蛾在整个生活期间的代谢速率(微升O_2/毫克鲜重/小时)都呈“U”型曲线变化,并有明显的昼夜节律。同时还测定棉铃虫成虫在不同温度下、在取食后、在黑暗条件下、在饥饿和飞翔期同的耗氧量。根据测定资料估测,在25℃下,棉铃虫雌雄成虫一生在静止时平均消耗氧气分别约为66.0毫升和72.5毫升。由于棉铃虫蛾期的平均呼吸商是0.94,所以成虫一生通过呼吸消耗的能量约在1,400焦耳或330卡(雌蛾)和1500焦耳或360卡(雄蛾)左右,还不到它们一生在活动和静止时通过呼吸消耗的总能量的1/4。     

N末端脑钠肽前体在围冠状动脉搭桥术期的变化及意义

N-末端脑钠肽前体(N-terminal pro brain natriuretic peptide,NT-proBNP)是体内脑钠肽前体(proBNP)裂解成脑钠肽(brain natriuretic peptide,BNP)时的产物,NT-proBNP的血浆浓度及稳定性比BNP更高,半衰期更长,属于钠尿肽系统的重要一员,本身无生物学活性。NT-proBNP主要由正常的心肌细胞合成和分泌,在心肌损伤或坏死后迅速升高,可反映机体代偿病理改变和恢复循环的能力,是心功能障碍性疾病,如心力衰竭、左室肥厚等诊断、疗效监测和预后评估等最佳的心肌标志物,临床通过测定血浆NT-proBNP水平用于急慢性充血性心力衰竭(congestive heart failure,CHF)的诊治及预后,本文主要就NT-proBNP在围冠状动脉搭桥术(Coronary Artery Bypass Grafting,CABG)期的变化及临床意义的新进展进行综述。     

冷适应微生物产生的冷活性酶

冷适应微生物 (Ｃｏｌｄａｄａｐｔｅｄｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ)包括嗜冷菌和耐冷菌。嗜冷菌可在 0℃生长 ,其最适和最高生长温度分别低于 1 5℃和 2 0℃。耐冷菌可在 0℃～ 5℃生长繁殖 ,其最适和最高生长温度分别低于2 0℃和 35℃。冷适应微生物通过产生冷活性酶 (Ｃｏｌｄ ａｃｔｉｖｅｅｎｚｙｍｅ)来调节它们的代谢活动并以此来适应低温环境。依Ｆｅｌｌｅｒ( 1 996)提出的定义 ,冷活性酶具有如下特征 :1 酶活性曲线作为温度的函数趋向于低温 ;2 在低温范围内 ( <40℃ )酶的转换数 (ｋｃａｔ)或生理系数 (ｋｃａｔ/Ｋｍ)高于来自…     

烟曲霉在不同温度和营养条件下的生长特性初探

目的确定烟曲霉的最适生长温度、最高生长温度及致死温度。方法生长曲线法用来确定培养烟曲霉的最适宜培养基,并测定其最适生长温度和最高生长温度;菌落计数法用来确定其致死温度。结果 1)酵母浸膏培养基(yeast ex-tract medium,YG)是测定烟曲霉生长曲线的最适宜培养基;2)在YG培养基中,37℃是烟曲霉的最适宜生长温度,52℃为其最高生长温度。随着温度的升高,菌株的生长速度逐渐减慢;3)65℃处理180 min或70℃处理120 min能使烟曲霉完全失活。结论在YG培养基中,37℃是烟曲霉的最适宜生长温度,52℃为其最高生长温度;烟曲霉的致死条件为65℃处理180min或70℃处理120 min。     

甘精胰岛素肽图分析方法研究

目的:探索并确定甘精胰岛素的最佳酶解条件,建立酶解更完全、特异性更强的甘精胰岛素肽图分析方法。方法:采用0.4 mol/L Tris-HCl(pH9.0)溶液作为酶解缓冲液,V8蛋白酶与甘精胰岛素之比为1 U∶10μg,于37℃反应1 h后加入磷酸终止反应,采用RP-HPLC分离目标肽段,采用液相色谱-质谱联用(LC-MS)方法鉴定酶解产生的肽段。结果:甘精胰岛素基本完全酶解,未消化的主成分较《欧洲药典》9.5版(EP9.5)方法大幅减少,时间缩短了1/2,酶解的完全性与有效性大幅提高。产生的4个目标肽段可通过RP-HPLC清晰呈现并有效分离,肽段Ⅱ和Ⅲ的分离度大于25.0,拖尾因子均小于1.5,且各肽段与对照品的相对保留时间在1.00±0.01范围内。4个目标肽段和2个非特异肽段均由质谱鉴定出。较好地克服了现行EP9.5甘精胰岛素分析方法酶解反应的完全性较差、非特异酶解肽段含量较高、理论目标肽段Ⅳ及Ⅰ含量过低等不利于表征目标肽段并确证其氨基酸序列正确性的缺陷。选取B32脱精氨酸甘精胰岛素评价方法的专属性,证实本方法专属性良好;6次重复测定各肽段的保留时间及峰面积的RSD为0.05%～0.20%,考察不同实验人员在不同时间处理样品得到结果的变异程度,RSD为0.01%～0.36%,表明方法的中间精密度较好。V8酶量为15～25 U、柱温为38～42℃、采用3个不同厂家的色谱柱时测定的相对保留时间的RSD为0.12%～0.26%,表明方法的耐用性较好。酶解后的样品于6℃存放24 h及-20℃储存7 d,稳定性较好。结论:实现了甘精胰岛素主成分的高效特异酶解及目标肽段的有效分离,该方法专属性、重复性、中间精密度及耐用性均表现良好,可用于甘精胰岛素的结构确证及专属性鉴别。     

蜂毒溶血肽的研究进展

蜂毒溶血肽 (melittin)是蜜蜂毒液的主要组分 ,由 2 6个氨基酸残基组成 ,具有两亲性和种的特异性。它的cDNA已经被克隆 ,并以融合蛋白的形式在大肠杆菌Escherichiacoli中进行表达。蜂毒溶血肽的作用机制主要包括脂酶的激活 ,产生第二信使 ,调节一些酶及离子通道 ;Ca2 +的水平调节 ,影响骨骼肌和心肌的收缩 ;作为脂类代谢的探针。由于蜂毒溶血肽结构简单 ,且抑制病毒复制 ,因此可将其用于癌症的基因治疗及爱滋病的防治。此外 ,蜂毒溶血肽还可作为对一些作用机理进行研究的模型肽。