RNF13通过IRE1/XBP-1 通路调控内质网应激介导的细胞凋亡

目的:在研究内质网应激介导的细胞凋亡过程中,我们发现Ring finger protein13(RNF13)具有促进细胞凋亡的功能。我们拟研究沉默RNF13后细胞对Tunicamycin等引起的细胞凋亡的影响,以及RNF13对活性形式的caspase3,XBP1(X-box binding protein 1)的剪切以及IRE1(Endoplasmic reticulum to nucleus signaling 1)磷酸化的影响以有助于了解RNF13促进细胞凋亡的信号通路的研究。方法:基因沉默RNF13,利用MTT方法研究RNF13沉默后对细胞增殖的影响,RNF13基因沉默后对XBP1剪切的影响,免疫印迹观察RNF13对IRE1磷酸化的影响。结果:RNF13基因沉默效率在80%以上。RNF13基因沉默后明显抑制细胞凋亡;敲低RNF13的细胞可抵抗衣霉素以及毒胡萝卜素的诱导的细胞凋亡。Caspase-3是细胞凋亡的关键蛋白。敲低RNF13后caspase-3的活性形式明显降低(降低70%,P0.001)。在加入衣霉素引起内质网应激的情况下,敲除RNF13的细胞XBP1的切割活性明显降低。敲除RNF13的细胞中IREl的磷酸化明显降低(降低90%,P0.001)。结论:RNF13通过IRE1-XBP1信号通路调节细胞凋亡。     

靶向IRE1a干扰质粒构建及对ERS时细胞增殖及凋亡的影响

目的构建靶向人IRE1a的shRNA干扰质粒（pSUPER-IRE1a）并观察其对人HeLa细胞和HepG2细胞增殖及凋亡的影响。方法设计并合成靶向IRE1a基因的两条shRNA,分别克隆至真核表达载体pSUPER构建重组质粒pS1、pS2,依次转染入HeLa细胞和HepG2细胞中。采用RT—PCR检测pS1、pS2转染前后IRE1a在HeLa细胞和HepG2细胞中的mRNA水平,免疫印迹检测pS1、pS2转染前后IRE1a蛋白的表达;MTT比色法、BrdU／DAPI双免疫荧光法及流式细胞仪分别检测各重组质粒对HeLa细胞和HepG2细胞增殖及凋亡的影响。结果干扰质粒（pSUPER-IRE1a）能有效抑制HeLa细胞和HepG2细胞中IRE1a基因的表达;成功转染后,细胞处于内质网应激（ER stress）状态时,各实验组细胞增殖率及凋亡率与对照组比较,差异均具有统计学意义P〈0．05）。结论成功构建靶向人IRE1a的shRNA真核表达载体pS1、pS2,有效抑制了HeLa细胞和HepG2细胞中IRE1a的表达;细胞处于ERS状态时,IRE1a-shRNA有效促进HeLa、HepG2两种肿瘤细胞的增殖;抑制HeLa和HepG2细胞的凋亡。     

IRE1通路与肿瘤

内质网应激是细胞内广泛存在的一种应激反应。研究表明,内质网应激与肿瘤的发生发展密切相关。针对内质网应激及其相应信号通路进行肿瘤的预防或治疗受到了广泛关注。IRE1(inositol-requiring enzyme 1)通路是内质网应激诱发的最保守的信号通路。研究证实,IRE1及其主要的下游效应分子剪切型X 盒结合蛋白1与肿瘤进展密切相关。本文对IRE1通路与肿瘤发生发展、血管新生、肿瘤转移、肿瘤耐药性和恶性程度的相关性进行了阐述,同时分析了IRE1在不同肿瘤样本中的突变率、突变类型与病人存活状态的关系。作为肿瘤治疗的有效靶点,针对IRE1通路的调控能够有效延缓肿瘤的发生发展。     

内质网应激反应时IRE1-依赖性XBP1剪接机制

在哺乳动物细胞,X盒结合蛋白1(X-box binding protein 1, XBP1)是一种具有重要作用的蛋白质.哺乳动物细胞中,当未折叠蛋白质在内质网蓄积时会激活一种细胞内信号转导系统,即未折叠蛋白质反应(UPR).哺乳动物细胞定位于内质网膜的IRE1a,可通过二聚化而激活其自身的蛋白激酶及核糖核酸酶活性,从而部分地转导UPR 信号.活化的IRE1a在XBP1 mRNA的两个位点对其进行切割反应,诱导一种非传统剪接反应.这种剪接反应会产生一种功能性XBP1转录因子,可作为内质网应激反应时的传感器.同时,在内质网应激反应时还有另一种转录激活因子6(ATF6)蛋白酶解系统发挥作用.     

靶向IRE1/XBP1信号通路的细胞水平高通量筛选模型建立

目的:建立基于细胞水平的inositol-requiring 1/X-box-binding protein 1 (IRE1/XBP1)信号通路高通量筛选模型,用于发现新型IRE1/XBP1信号通路抑制剂。方法:构建pCAX-F-XBP1△DBD-luciferase质粒,并与pcDNA3.1质粒共转人胚肾细胞HEK293,G418抗性筛选获得多个稳定表达荧光素酶的单克隆。结果:首先利用内质网应激诱导剂衣霉素(tunicamycin,TM)考察单克隆对内质网应激反应的敏感性,确定6#单克隆用于后续研究;其次对细胞接种量、溶剂DMSO终浓度和TM的作用浓度与孵育时间等条件进行优化,最终确定高通量筛选模型条件, Z'因子达到0.62;最后对包含多个激酶抑制剂在内的449个化合物进行筛选,发现27个潜在的IRE1/XBP1抑制剂,其中MG132、Sunitinib和Staurosporine的IC50分别为6.61(±1.51)μmol/L、6.25(±0.36)μmol/L和48(±8)nmol/L。结论:成功建立有效靶向IRE1/XBP1信号通路的高通量药物筛选模型,为基于IRE1/XBP1信号通路为靶点的药物发现奠定坚实基础。     

硒对亚硝酸钠导致的草鱼肝细胞氧化损伤的保护作用

以草鱼(Ctenopharyngodon idella)肝细胞(L8824)为研究对象,设置对照组、亚硝酸钠暴露实验组、亚硒酸钠孵育实验组和亚硒酸钠孵育后亚硝酸钠暴露实验组,探讨亚硒酸钠对不同浓度亚硝酸钠诱导L8824细胞氧化损伤及凋亡的保护作用。结果显示,亚硝酸钠暴露能抑制L8824细胞贴壁,导致细胞凋亡率增加。亚硝酸钠暴露引致L8824细胞的谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性降低;gpx、sod和cat基因表达下调(P<0.05), DNA损伤诱导转录物3(ddit3)和bcl-2相关X蛋白(bax)基因表达上调(P<0.05)。亚硒酸钠(10μmol/L)孵育L8824对细胞形态和凋亡率无显著影响,但GPX、SOD和CAT活性上升,gpx、sod、cat、核因子E2相关因子2(Nrf2)和Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(keap1)基因表达上调(P<0.05)。亚硒酸钠孵育后亚硝酸钠暴露实验组,细胞凋亡率、GPX、SOD和CAT活性较对照组无显著变化,但B淋巴细胞瘤-2(bcl-2)基因表达显著上调(P<0...     

内质网应激介导的细胞凋亡

内质网是细胞内重要的细胞器,内质网功能的损伤引起ER应激(ERS).内质网通过激活未折叠蛋白质反应(UPR)以保护由内质网应激所引起的细胞损伤,恢复细胞功能,包括暂停早期蛋白质合成、内质网分子伴侣和折叠酶的转录激活、内质网相关性降解(ERAD)的诱导.长期过强的内质网应激诱导内质网相关性细胞凋亡,清除受损细胞,包括内质网应激诱导CHOP/GADD153表达、JNK的激活以及caspase-12蛋白水解酶的活化等一系列生物学效应.     

山柰酚通过线粒体凋亡通路诱导三阴性乳腺癌细胞凋亡的机制研究

本文旨在探讨山柰酚对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的抑制作用及其可能的分子机制。用不同浓度的山柰酚处理细胞,CCK-8法检测山柰酚对MDA-MB-231和人正常乳腺上皮细胞MCF-10A活力的影响,倒置显微镜观察各组细胞形态变化,克隆形成法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,JC-1染色法检测细胞线粒体膜电位的改变,Western blot检测B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、细胞色素C(Cyt C)和细胞周期蛋白D1(CyclinD1)的蛋白表达,比色法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)以及半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-9(Caspase-9)的活性。结果显示,山柰酚体外可显著抑制MDA-MB-231细胞的增殖,诱导细胞凋亡,且对正常乳腺上皮细胞活力无影响,降低细胞线粒体膜电位,上调Bax、Cyt C的表达,下降Bcl-2和Cyclin D1的表达,增强Caspase-3、Caspase-9活性。结果表明,线粒体凋亡信号通路的激活是山柰酚诱导MDA-MB-231细胞凋亡的途径之一。     

IRE1α在代谢性疾病中的作用

IRE1α介导的信号通路是未折叠蛋白反应中最为保守的通路,与动脉粥样硬化、肝功能疾病、肥胖、糖尿病等代谢性疾病的发生发展过程密切相关。本文就IRE1α在上述疾病发生发展中的作用机制简单综述,进一步探究了IRE1α与代谢性疾病的相互作用机制的重要性,为疾病预防和临床治疗提供新的途径。     

草鱼Isthmin-1基因序列分析及转录水平的营养调控

为探讨Isthmin-1(Ism-1)在草鱼糖和脂类代谢中的作用,研究采用RT-PCR技术克隆草鱼Ism-1的开放阅读框(ORF),生物信息学分析Ism-1及其编码的氨基酸序列, RT-qPCR技术检测Ism-1在草鱼各组织中的分布特点,并在细胞和活体水平上分析不同营养条件下Ism-1 mRNA的表达变化。结果显示,成功克隆草鱼Ism-1的ORF区。序列分析表明,草鱼Ism-1基因开放读码框为1380 bp,编码459个氨基酸,预测该蛋白相对分子量为50.96 kD。氨基酸多序列比对和系统进化树分析显示,草鱼Ism-1与黑头软口鲦(Pimephales promelas)的进化关系最近(氨基酸相似度为96.51%)。Ism-1在草鱼各组织中均有表达,在红肌中表达量最高,其次是鳃、脑和白肌等组织。饥饿再投喂实验结果表明,饥饿14d后肝胰脏中Ism-1的表达量显著上调(P<0.05),恢复投喂后表达量降低,但仍显著高于对照组(P<0.05),白肌中Ism-1的表达量在饥饿和再投喂后均显著增加(P<0.05)。腹腔注射不同浓度的胰高血糖素显著下调草鱼肝胰脏中Ism-1的mR...     

草鱼IL-10单克隆抗体的制备与鉴定

白细胞介素10(Interleukin-10, IL-10)参与机体免疫应答调节, 协同其他细胞因子维持免疫系统稳态。为探究草鱼(Ctenopharyngodon idella)IL-10的细胞来源, 研究利用大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli)表达系统制备了高纯度的草鱼IL-10重组蛋白, 免疫小鼠制备单克隆抗体后通过免疫印迹、激光共聚焦和流式细胞术对抗体进行分析。结果表明, 获得的单克隆抗体不仅能特异识别大肠杆菌表达的CiIL-10重组蛋白, 而且能识别HEK293细胞中表达的真核IL-10重组蛋白。脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)和草鱼白细胞介素1β(IL-1β)刺激草鱼性腺细胞系(GCO)36h的免疫荧光染色分析表明, 草鱼IL-10单克隆抗体能与草鱼内源IL-10结合, 但IL-10阳性细胞数量在LPS处理前后无明显变化。该研究成功制备了高纯度CiIL-10重组蛋白, 获得了特异性好的高质量单克隆抗体, 为研究草鱼ILC2和Th2细胞的增殖、分化和功能奠定了基础。     

草鱼在摄食高能饲料后血清生化指标的动态变化

为研究草鱼(Ctenopharyngodon idella) 在摄食高能饲料后血清生化指标的动态变化, 选择均重为(55.0±2.5) g 的健康草鱼320 尾, 随机分成4 组, 每组4个重复, 分别以3组高能纯化饲料(分别以额外的蛋白质、脂肪、糊精供能, 高能饲料组较对照组总能量提高11%)及对照组饲料喂养草鱼11周后, 将鱼体禁食48h后采样(对照), 再饱食投喂, 在摄食后的2h、8h和24h取样, 测定实验鱼8种血清生化指标, 并对采样时间点(T)和不同饲料(D)进行双因素方差分析。为确保实验结果的准确性, 需要保证不同处理组的采样时间同步性, 即均在餐后同一时间点采样。结果显示: 除血清总胆固醇(TCHO)含量外, 血清碱性磷酸酶(ALP)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)活性, 以及血清甘油三酯(TAG)、葡萄糖(GLU)、低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)含量均受到采样时间点(T)即餐后时间的显著影响, 饲料(D)对上述8个指标亦均有显著影响, 且两者存在交互作用。草鱼血清GLU含量和血清AST活性均在餐后2h达到峰值, 血清ALT和ALP活性以及LDLC含量均在餐后24h达到峰值, 血清TAG含量在餐后8h达到峰值, 而血清TCHO和HDLC含量则无明显峰值。在餐后24h, 3个高能组的ALT活性和GLU含量较对照组显著升高, 血清AST和ALP活性以及TAG、TCHO和HDLC含量较对照组无显著差异。上述结果表明, 草鱼血清生化指标受到餐后采样时间点和饲料的显著影响。     

草鱼感染GCRV后血液中淋巴细胞变化及BCL10表达分析

为了研究草鱼BCL10基因在草鱼出血病中的应答机制, 文章克隆了BCL10基因, 并利用生物信息学、荧光定量和血涂片等技术对其进行了分析。生物信息学结果显示, BCL10基因开放阅读框为738 bp, 编码245个氨基酸。实时荧光定量PCR结果显示, 感染病毒后草鱼体内BCL10表达量持续上调, 在肝胰腺和中肾中第4天达到峰值, 第7天表达量开始下调。血涂片显微镜观察发现了血液中淋巴细胞在感染病毒后第1到第4天下降, 第7天时上升。肾脏的组织病理学观察也发现中肾中肾小管上皮细胞第1到第7天逐渐空泡化, 脱落坏死。以上结果表明, BCL10基因参与了草鱼应对草鱼呼肠孤病毒(GCRV)入侵的免疫应答。     

感染草鱼呼肠孤病毒对肠道菌群多样性的影响

为揭示草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus, GCRV)对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肠道菌群的影响, 在通过人工浸泡方式感染GCRV后, 采用针对16S rRNA基因的高通量测序技术对草鱼肠道菌群的组成和多样性进行了研究。结果显示, 感染组与对照组差异显著(MRPP, Anosim, Adonis, P<0.01), 且感染组肠道菌群的Alpha多样性指数(Shannon-Wienner、Inverse Simpson、Pielou evenness)显著低于对照组(t-test, P<0.05)。此外, 肠道菌群在感染组个体间差异显著大于对照组(Wilcoxon test,P<0.05), 表明患病草鱼肠道菌群失去原有平衡而变得紊乱。尽管病毒感染组和对照组草鱼肠道优势菌门均为Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes、Fusobacteria, 但在OTU水平仍表现出明显的变化, 如OTU_69(Pasteurellaceae)、OTU_504(Comamonadaceae)和OTU_1898(Cetobacterium)在感染GCRV组丰度显著降低(t-test, P<0.05), 也表明GCRV感染可使草鱼肠道微生态发生紊乱。肠道菌群结构稳定对于宿主健康具有重要意义, 研究患病鱼肠道菌群状况为鱼类常见疾病的防控提供科学依据, 也为健康养殖提供参考。     

草鱼高脂日粮磷酸二氢钙适宜添加量的研究

为探讨草鱼高脂(7%)实用日粮磷酸二氢钙(MCP)适宜添加量对草鱼生长性能、脂质代谢及抗氧化能力的影响, 以磷酸二氢钙[Ca (H₂PO₄)]为磷源, 配制含MCP分别为0(对照组)、1.0%、2.0%、3.0%和4.0%的5种等氮等能实用日粮, 饲喂初始均重为(105.23±0.55) g的试验草鱼, 每种日粮设置3个重复, 每个重复15尾鱼, 进行为期8周的养殖试验。结果显示: 在高脂日粮中添加适宜的MCP可显著增加草鱼增重率(WGR)和全鱼磷含量, 降低饲料系数(FCR)和脏体比(VSI)。以WGR、FCR和全鱼磷为观测指标, 折线模型分析得出日粮MCP适宜添加量分别为3.26%、2.96%和2.63%; 全鱼、内脏、肌肉和肝脏粗脂肪含量随日粮中MCP的增加呈先降后升趋势, 而全鱼和肌肉粗蛋白含量则呈相反趋势; 在MCP3.0%组, 草鱼肠道淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶活性, 血清碱性磷酸酶(AKP)活性最高, 血清甘油三酯、肝脏丙二醛含量, 乙酰辅酶A羧化酶(ACC)活性最低; 添加组血清总胆固醇含量均显著低于对照组(P<0.05), 肝脏肉碱脂酰转移酶(CPT-I)活性随日粮MCP添加量增加而渐增。研究表明, 草鱼高脂(7%)日粮中MCP适宜添加水平为2.96%—3.26% (饲料总磷1.43%—1.50%), 该添加水平能促进草鱼对日粮中营养物质的消化利用, 减少鱼体及肝脂蓄积, 增加鱼体蛋白, 提高抗氧化机能, 促进生长。     

饲料蛋白质和小麦淀粉水平对中大规格草鱼生长性能及肝脏组织结构的影响

草鱼(Ctenopharyngodon idella)对碳水化合物的利用能力显著优于脂肪, 因此研究碳水化合物与蛋白的相互作用关系是解决草鱼配方策略的重要途径。实验探讨了中规格(460 g)草鱼和大规格(1970 g)草鱼饲料中蛋白与碳水化合物的相互作用关系。实验采用2×4的双因子实验设计, 实验一: 中规格草鱼饲料的2个淀粉梯度为25%和35%, 4个蛋白梯度为22%、24%、26%和28%, 共8个处理; 实验二: 大规格草鱼饲料的2个淀粉梯度为30%和40%, 4个蛋白梯度为18%、20%、22%和24%, 共8个处理。在56d的等量投喂后, 实验结果显示: 中规格草鱼的生长性能随着饲料蛋白水平的升高显著上升, 在28%蛋白水平组达到最高(P<0.05), 且小麦淀粉水平35%组的生长性能显著高于25%组(P<0.05); 大规格草鱼的生长性能也随着饲料蛋白水平的升高显著上升, 在蛋白水平大于20%之后差异不显著(P>0.05), 且小麦淀粉水平40%组的生长性能显著高于30%组(P<0.05)。同时, 中规格和大规格草鱼饲料分别添加35%和40%小麦淀粉时不会对草鱼的肝脏组织造成明显的负面影响。由此可见, 在实验条件下, 中规格和大规格草鱼分别在饲料小麦淀粉水平35%和40%以内时, 可以有效地利用淀粉节约饲料蛋白而不造成肝脏组织损伤。     

草鱼两个细胞因子信号抑制因子3基因序列及表达分析

细胞因子信号抑制因子3 (SOCS3)是一类调节免疫反应的蛋白,为研究其在草鱼(Ctenopharyngodon idella)中的功能,文章克隆了草鱼SOCS3b基因,分析了SOCS3s基因在成鱼组织中的表达情况。序列分析结果显示,草鱼SOCS3b基因全长2126 bp,编码216个氨基酸。qRT-PCR结果显示,草鱼SOCS3a和SOCS3b在成鱼11个组织中均有表达,但表达略有差异。注射嗜水气单胞菌(Aerononas hydrophila)后,草鱼SOCS3a和SOCS3b在肝、脾、肠、肾中的表达均有明显上升。以上结果表明SOCS3s基因在草鱼的组织生长调控中发挥着重要的作用,且SOCS3s可以调节细菌诱导的免疫应答。研究将为后续草鱼SOCS3s基因的功能研究提供参考依据。     

草鱼肠道黏膜厌氧细菌的分离与鉴定

研究以草鱼(Ctenopharyngodon idellus)为实验对象, 运用厌氧培养的方法, 研究了饥饿状态下草鱼肠道黏膜固有微生物的类群及其在不同肠段的分布。实验结果显示草鱼前肠、中肠与后肠中细菌的数量分别是3.17×103、1.63×104和1.79×107 cfu/g。研究共分离到274株单菌落, 经16S rRNA鉴定, 分别属于拟杆菌属(Bacteroides spp.)、鲸杆菌属(Cetobacterium spp.)、梭形杆菌属(Fusobacterium spp.)、气单胞菌属(Aeromonas spp.)、希瓦氏菌属(Shewanella spp.)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、泛菌属(Pantoea spp.)和柠檬酸杆菌属(Citrobacter spp.)8个种类, 其中专性厌氧细菌的数量占9.1%, 兼性厌氧细菌的数量占90.9%。进一步分析发现, 前肠中只分离到兼性厌氧细菌, 中肠与后肠专性厌氧细菌和兼性厌氧细菌都有分布。专性厌氧细菌Bacteroides paurosaccharolyticus和Bacteroides luti在中肠与后肠都有分布, 而Cetobacterium somerae和Fusobacterium ulcerans只在后肠有发现。兼性厌氧细菌是草鱼肠道黏膜的优势菌群, 其中嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila占73.7%。草鱼肠道不同部位固有厌氧微生物组成存在差异, 细菌数量也明显不同, 后肠中具有更高的细菌丰度和多样性。