缺氧通过SIRT1调控结直肠癌细胞自噬

目的:探究缺氧调控结直肠癌细胞自噬的分子机制。方法:分别在常氧及缺氧(1%氧气浓度)条件下处理细胞,western blot检测细胞内沉默信息调节因子1(Silencing Information Regulator 1,SIRT1)及自噬相关标志分子的表达情况;慢病毒转染构建SIRT1稳定过表达或敲减细胞株,利用透射电镜观察细胞内自噬体形成的情况;使用m RFP-GFP-LC3双标腺病毒感染细胞,在激光扫描共聚焦显微镜下观察细胞自噬流的进展。结果:Western blot结果显示,缺氧条件下,HCT116及SW480细胞内SIRT1的表达水平随着缺氧时间的延长而降低,自噬特异性底物p62蛋白水平降低且LC3-I/II转换增加;与对照组相比,SIRT1过表达细胞内自噬特异性底物p62的表达水平升高而LC3-I/II转换受到抑制;相反在SIRT1敲减细胞内,p62的表达水平降低而LC3-I/II转换进一步促进。透射电镜结果发现SIRT1过表达后,细胞内自噬溶酶体形成减少、自噬体数量增多;激光共聚焦结果显示,SIRT1过表达细胞内绿色荧光淬灭减少、自噬体与自噬溶酶体的融合收到明显抑制,说明SIRT1通过抑制自噬溶酶体的形成,阻断自噬流的进展。结论:缺氧通过抑制SIRT1的表达促进结直肠癌的细胞自噬。     

缺氧对大鼠脑微血管内皮细胞增殖和凋亡的影响及其机制研究

目的:探讨缺氧对大鼠脑微血管内皮细胞增殖和凋亡的影响及其可能的分子机制。方法:从2周龄的SD大鼠中提取脑微血管内皮细胞。体外模拟脑缺氧微环境,将体外培养的脑微血管内皮细胞分别置于常氧(21%O_2)和低氧环境(1%O_2)下处理6、12和24小时,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法观测不同时间点细胞增殖能力的变化;用AnnexinV-FITC/PI双标流式细胞术观察不同时间点细胞凋亡情况;Real time-PCR和Western blot法检测细胞中(Hypoxia-inducible factor-1α) HIF-1αm RNA和蛋白的表达。进一步使用HIF-1αsi RNA靶向沉默HIF-1α基因,再检测低氧环境下HIF-1αm RNA和蛋白表达、细胞增殖以及凋亡水平的变化。结果:随着低氧处理时间的延长,大鼠脑微血管内皮细胞的增殖能力被显著抑制,同时凋亡水平显著增加,HIF-1αm RNA和蛋白表达水平显著升高。使用HIF-1αsi RNA特异性阻断HIF-1α表达后,低氧环境下HIF-1αm RNA和蛋白表达明显降低,同时细胞活性增加,细胞凋亡率显著下降。结论:缺氧微环境能够通过上调HIF-1α的表达抑制大鼠脑微血管内皮细胞增殖并促进其凋亡。     

血管细胞黏附分子-1对卵巢癌细胞凋亡的影响及机制研究

目的:探讨过表达血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)对卵巢癌细胞凋亡的影响。方法:构建过表达VCAM-1的慢病毒载体GV358-VCAM1+,转染人类卵巢癌IGROV1细胞株,利用嘌呤霉素筛选稳定表达VCAM-1的IGROV1细胞,通过倒置荧光显微镜下观察绿色荧光,确定细胞转染效率,Western blot及RT-PCR法确定卵巢癌细胞VCAM-1蛋白和m RNA水平;采用流式细胞仪检测过表达VCAM-1的IGROV1的细胞凋亡变化,western blot法检测凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax、Casepase-3、Cleaved Casepase-3)以及STAT3、p-STAT3蛋白表达水平的变化。结果:成功构建的慢病毒载体GV358-VCAM1+在IGROV1细胞中的转染效率达到85%以上,转染细胞的VCAM-1蛋白及m RNA水平均呈稳定表达;VCAM-1过表达卵巢癌细胞的细胞凋亡显著高于空载体对照组(P=0.0149);Bax、Casepase-3、Cleaved Casepase-3表达水平均较对照组显著升高(P0.01),Bcl-2、p-STAT3表达水平明显低于对照组(P0.01),但STAT3表达水平无显著改变。结论:VCAM-1可能通过下调STAT3的磷酸化水平诱导卵巢癌细胞凋亡。     

KKXX-motif对VKORC1亚细胞定位的影响

目的研究细胞内质网蛋白贮留信号KKXX-motif,对维生素K环氧化物还原酶复合物亚基1（VKORC1）的亚细胞定位的作用。方法利用点突变试剂盒构建VKORC1的KKXX突变体——VKORC1-SSXX;同时应用pEGFP载体构建VKORC1-SSXX和VKORC1-KKXX的绿色荧光融合蛋白表达质粒。瞬时转染HEK293s细胞,观察野生融合蛋白和突变融合蛋白的表达情况。结果野生型融合蛋白荧光分布在胞浆内,而突变型融合蛋白聚集表达。结论KKXX-motif影响了VKORC1的亚细胞定位。     

siRNA沉默SIRT1基因对宫颈癌细胞HeLa增殖和凋亡的影响

化学合成靶向SIRT1基因的小干扰RNA,脂质体法转染人宫颈癌细胞株HeLa,观察小干扰RNA沉默SIRT1基因对HeLa增殖及细胞凋亡的影响。在优化siRNA SIRT1转染条件的基础上,应用RT-PCR和Western blot分别检测各组SIRT1 mRNA、SIRT1蛋白及凋亡相关蛋白的表达;CCK-8法检测细胞增殖抑制率;Hoechst荧光染色法和流式细胞仪检测细胞凋亡。结果表明,siRNA SIRT1转染细胞组SIRT1 mRNA水平和蛋白表达量明显低于对照组;siRNA SIRT1转染组细胞增殖受抑制,细胞凋亡率明显增加;凋亡相关蛋白P53、P21表达上调,Survivin表达下调。上述结果表明:siRNA SIRT1诱导的HeLa细胞凋亡与P53、P21、Survivin通路关系密切,但siRNA SIRT1诱导HeLa细胞凋亡的详尽机制有待进一步研究。     

姜黄素后处理通过SIRT1/FOXO1信号通路拮抗小鼠脑缺血再灌注损伤

目的:探究姜黄素后处理是否通过激活SIRT1/FOXO1信号通路抵抗小鼠脑缺血再灌注损伤。方法:小鼠脑缺血30 min,再灌注24 h建立脑缺血再灌注模型。手术前脑室内注射SIRT1特异性抑制剂EX527。再灌注后腹腔注射姜黄素。小鼠随机分为以下6组:假手术组;单纯姜黄素后处理组;缺血再灌注组;缺血再灌注+姜黄素后处理组;EX527预处理+缺血再灌注+姜黄素后处理组;EX527预处理+脑缺血再灌注组。再灌注24 h检测脑梗体积、Complex I活性、ROS含量以及SIRT1、Ac-FOXO1、Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达情况。结果:与手术组相比,姜黄素后处理组梗死区脑组织SIRT1的表达量及活性明显增加,脑梗体积降低,ROS含量降低而Complex I活性增高,Bcl-2的表达增高而Bax和Caspase-3的表达量降低(均P0.05)。阻断SIRT1信号通路后上述姜黄素脑保护作用均减弱(P0.05)。结论:我们的研究首次证实姜黄素后处理通过激活SIRT1/FOXO1信号通路,进而降低氧化应激与凋亡,最终减轻脑缺血再灌注损伤。     

向光色素Phototropin1的细胞和亚细胞定位

向光色素 1 (ｐｈｏｔ1 )是在蓝光 (ＢＬ)下进行自我磷酸化的Ｓｅｒ/Ｔｈｒ型光受体激酶 ,它的两个保守的ｄｏｍａｉｎ分别结合着作为发色团的两个ＦＭＮ分子。它是与原生质膜 (ＰＭ)结合的 1 2 0ｋＤ的蛋白。ｐｈｏｔ 1和ｐｈｏｔ 2蛋白都是植物向光性反应的光受体 ,它们也是调节叶绿体运动、开闭气孔和快速抑制黄化芽延长生长的蓝光受体。为了解ｐｈｏｔ 1和ｐｈｏｔ 2调节这 4个反应的机理 ,有必要了解其细胞和亚细胞定位。将编码融合的ｐｈｏｔ 1和ＧＦＰ(绿色荧光蛋白 )的结构 (在内源ＰＨＯＴ1启动子控制下 )转化无ｐｈｏｔ1的拟南芥…     

和厚朴酚通过激活SIRT1/FOXO1信号通路抵抗小鼠脓毒症脑损伤

目的:探究和厚朴酚是否通过激活SIRT1/FOXO1信号通路抵抗小鼠脓毒症脑损伤。方法:通过C57BL/6小鼠盲肠结扎穿孔法建立脓毒症脑损伤模型。小鼠随机分为以下6组:假手术(Sham)组;和厚朴酚处理(HKL)组;盲肠结扎穿孔(CLP)组;盲肠结扎穿孔+和厚朴酚处理(CLP+HKL)组;EX527 (SIRT1特异性抑制剂)预处理+盲肠结扎穿孔+和厚朴酚处理(CLP+HKL+EX527)组;EX527预处理+盲肠结扎穿孔(CLP+EX527)组。盲肠结扎穿孔48 h后检测脑组织内水含量、凋亡率及凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和cleaved Caspase-3的表达情况、炎症相关分子IL-1β与TNF-α、SIRT1信号通路相关蛋白表达情况。结果:与CLP组相比,CLP+HKL组脑组织内SIRT1的表达量及活性、Bcl-2表达量明显增加,而脑组织水含量、凋亡率、Bax、cleaved Caspase-3、IL-1β与TNF-α的表达量明显降低(均P 0.05)。EX527可明显抑制HKL的上述脑保护作用(P 0.05)。结论:和厚朴酚主要通过激活SIRT1/FOXO1信号通路,抑制凋亡与炎症,从而缓解脓毒症脑损伤。     

Nupr1调控非小细胞肺癌细胞迁移、凋亡机制的研究

目的:探讨核蛋白1(Nupr1)调控非小细胞肺癌细胞迁移、凋亡机制的研究。方法:肿瘤抑制剂盐酸素(salinomycin)不同时间处理非小细胞肺癌细胞A549后采用Western Blot法检测非小细胞肺癌细胞A549中Cleaved Caspase-3、Nupr1的蛋白表达;Transwell小室检测Nupr1基因沉默后非小细胞肺癌细胞A549细胞体外迁移、侵袭能力的变化;Western Blot法检测Nupr1沉默后非小细胞肺癌细胞A549 MMP-2、TIMP-1的蛋白表达;流式细胞仪检测Nupr1沉默后非小细胞肺癌细胞A549的凋亡情况。结果:与未经肿瘤抑制剂salinomycin处理对照组相比较,salinomycin处理后的非小细胞肺癌细胞A549中Nupr1蛋白表达量下降,Cleaved Caspase-3蛋白表达量升高,并且随着作用时间呈依赖关系。Nupr1-siRNA转染组的迁移能力相比对照组未转染组下降(64.4±7.2)%,Nupr1-siRNA转染组的侵袭能力相比对照组下降(58.7±7.3)%。与未转染Nupr1-siRNA对照组相比较,转染后TIMP-1的表达明显上调,而MMP-2的表达则明显下调。流式细胞仪检测结果显示Nupr1沉默后非小细胞肺癌细胞A549出现大量凋亡。结论:Nupr1基因沉默后通过上调TIMP-1的表达,下调MMP-2的表达降低肺癌A549细胞的侵袭和迁移能力,进而促进非小细胞肺癌细胞凋亡。     

毛蕊异黄酮抑制SIRT1促乳腺癌细胞MCF-7凋亡

目的:探讨毛蕊异黄酮促乳腺癌细胞MCF-7凋亡的机制。方法:MTT检测低、中、高(10μM,50μM,100μM)剂量的毛蕊异黄酮对细胞活力的影响;Tunel检测毛蕊异黄酮对细胞凋亡的影响;Western blot检测SIRT1,p53和cleaved caspase-3的蛋白表达;Real-time PCR检测caspase-3 mRNA的表达。结果:毛蕊异黄酮能够剂量依赖性地降低细胞活力,100μM剂量组的毛蕊异黄酮显著地促进肿瘤细胞凋亡并降低SIRT1,增加p53和cleaved caspase-3的蛋白表达。SIRT1抑制剂烟酰胺(Nicotinamide,NAM,300μM)组与毛蕊异黄酮处理组相比显著地抑制SIRT1的蛋白表达,p53和cleaved caspase-3蛋白表达水平进一步增加;SRT1720(SIRT1特异性激动剂)与毛蕊异黄酮共孵育组逆转SIRT1蛋白表达,降低p53和cleaved caspase-3的蛋白水平。结论:毛蕊异黄酮促进肿瘤细胞MCF-7的凋亡,部分可能是通过降低SIRT1的表达水平,从而增加p53和cleaved caspase-3的蛋白表达促进细胞凋亡。     

UBE2T基因对结直肠细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨人类泛素结合酶E2T(Ubiquitin-conjugating enzyme E2T,UBE2T)基因对结肠细胞增殖和凋亡的影响。方法:体外培养人正常结直肠粘膜细胞FHC,采用将UBE2T基因慢病毒质粒转染至FHC细胞48 h后,通过MTT法检测细胞增殖情况,western blotting检测细胞中增殖相关蛋白UBE2T蛋白、Ki67、促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:与转染空质粒的FHC细胞相比,UBE2T基因慢病毒质粒转染FHC细胞48 h后,细胞增殖能力显著上调(P0.05),UBE2T蛋白明显增加,Ki67的表达明显增加(P0.05),细胞凋亡率显著降低(P0.05),且Bax的表达明显下调而Bcl-2的表达上调(P0.05)。结论:UBE2T基因能够促进正常结肠粘膜细胞的增殖,并抑制其凋亡。     

慢病毒介导的靶向沉默信息调节因子1（SIRT1）的RNA干扰对肝癌细胞生长及凋亡的影响

目的探讨慢病毒介导的靶向SIRTlshRNA对肝癌细胞生长和凋亡的影响。方法Western印迹分析SIRT1在多个肝癌细胞系中的表达;通过慢病毒介导的shRNA干扰技术靶向沉默SIRT1的表达,并通过Western印迹验证SIRTl基因的沉默效果。台盼蓝排斥实验分析SIRT1基因沉默对肝癌细胞生长的影响;流式细胞术和Western印迹检测PARP蛋白的剪切物观察细胞凋亡状态。结果SIRT1在多个肝癌细胞系中表达水平明显上调;慢病毒介导的shRNA能显著抑制细胞中SIRT1的表达。流式细胞术及Western印迹结果均显示SIRT1表达沉默显著诱导了肝癌细胞的凋亡。结论慢病毒介导的靶向SIRT1shRNA显著地抑制SIRT1的表达;SIRT1基因沉默抑制肝癌细胞生长并促进了细胞凋亡。     

白藜芦醇对缺氧诱导的肝癌细胞株BEL-7402增殖及凋亡的影响

目的:探讨不同浓度白藜芦醇在常氧环境及缺氧环境下对肝癌细胞株BEL-7402增殖及凋亡的影响。方法:采用MTT法分析不同浓度(0、12.5、25、50、100、200μmol/L)白藜芦醇在常氧环境及缺氧环境下对肝癌细胞株BEL-7402增殖的影响,应用流式细胞仪检测其对BEL-7402细胞凋亡的影响。结果:不同浓度的白藜芦醇在常氧及缺氧环境中对肝癌细胞株BEL-7402均有明显抑制增殖及诱导凋亡作用,呈剂量-效应相关,其中50、100、200μmol/L白藜芦醇两种环境中对肝癌细胞的抑制率及凋亡率与对照组比较差异均具有统计学意义(P0.05)。50、100、200μmol/L白藜芦醇,常氧环境中对肝癌细胞的抑制率分别为18.70±2.15%、22.13±2.18%、31.47±2.26%,凋亡率分别为11.82±2.28%、19.80±2.64%、38.00±2.57%;缺氧环境中对肝癌细胞的抑制率分别为17.87±1.76%、23.52±2.29%、29.87±1.51%,凋亡率分别为12.36±3.15%、19.71±2.78%、37.87±4.83%。结论:白藜芦醇在缺氧环境下能抑制肝癌细胞株BEL-7402的增殖并诱导其凋亡,且其作用与常氧环境相似。     

去乙酰化酶SIRT1的表达及活性调控机制

SIRT1是哺乳动物中重要的NAD+依赖性去乙酰化酶,参与许多重要的生理和病理过程,如衰老、细胞死亡和肿瘤发生。如何精确调节SIRT1的表达和活性对SIRT1执行其生物学功能至关重要。文章以基因表达的不同阶段为切入点,对调控SIRT1表达及活性的机制进行了论述。     

丁酸钠通过调节SIRT1/AMPK信号通路对慢性肾衰竭大鼠肾功能的影响

摘要 目的：探讨丁酸钠（NaB）通过调节沉默信息调节因子1（SIRT1）/单磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）信号通路对慢性肾衰竭（CRF）大鼠肾功能的影响。方法：选用SD大鼠72只,随机分为6组（12只/组）：control组、Model组、NaB低剂量组（100 mg/kg）、NaB中剂量组（200 mg/kg）、NaB高剂量组（400 mg/kg）、抑制剂组（400 mg/kg NaB+2 mg/kg SIRT1/AMPK通路抑制剂EX527）;采用饲喂0.5%腺嘌呤饲料以建立CRF大鼠模型,建模成功后,灌胃和腹腔注射相应药物。使用试剂盒检测大鼠24 h尿蛋白（24 h U-pro）、血清肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）水平;采用苏木精-伊红（HE）及Masson染色法观察肾脏病理改变,并计算胶原容积分数（CVF）;采用茜素红染色法与主动脉钙含量测定评估主动脉钙化情况;采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测各组大鼠肾脏组织白细胞介素（IL）-6、IL-β、肿瘤坏死因子（TNF）-α水平;采用过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、活性氧（ROS）检测试剂盒检测大鼠肾脏组织中CAT、MDA、ROS水平;采用蛋白免疫印迹法（WB）检测各组大鼠SIRT1/AMPK信号通路及骨形态发生蛋白2（BMP2）、Runt相关转录因子2（Runx2）蛋白的表达。结果：与control组比较,Model组大鼠肾脏组织损伤严重、胶原纤维沉积显著、主动脉钙化严重,CAT活性、SIRT1、p-AMPK/AMPK表达水平显著降低（P<0.05）,CVF、主动脉钙含量和SCr、BUN、24 h U-pro、IL-6、IL-β、TNF-α、MDA、ROS水平及BMP2、Runx2蛋白表达水平显著升高（P<0.05）;与Model组比较,NaB低、中、高剂量组大鼠肾脏组织损伤减轻、胶原纤维沉积面积明显减少、主动脉钙化程度减轻,CVF、主动脉钙含量和SCr、BUN、24 h U-pro、IL-6、IL-β、TNF-α、MDA、ROS水平及BMP2、Runx2蛋白表达水平显著降低（P<0.05）,CAT活性、SIRT1、p-AMPK/AMPK表达水平显著升高（P<0.05）;SIRT1/AMPK通路抑制剂EX527可降低高剂量NaB对CRF大鼠主动脉钙化和肾功能的改善作用（P<0.05）。结论：NaB可能通过激活SIRT1/AMPK信号通路,减轻肾脏组织炎症、氧化应激损伤、主动脉钙化和肾纤维化,从而起到改善CRF大鼠肾功能的作用。     

MFN1介导的线粒体融合在心肌细胞凋亡中的作用研究

目的:探讨线粒体融合关键蛋白MFN1介导的线粒体融合在调控心肌细胞凋亡中的作用。方法:通过si RNA降低体外培养H9C2心肌细胞中MFN1的表达后,采用Western blot检测线粒体细胞色素c(Cyto c)释放及其下游凋亡效应分子Caspase9与Caspase3活性,流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)的产生情况,流式细胞术检测细胞凋亡的情况。结果:干扰MFN1可显著促进H9C2心肌细胞内细胞色素c由线粒体释放至胞浆,促进Caspase9与Caspase3的激活,增加细胞内活性氧ROS产生并提高细胞凋亡率(均P0.05)。结论:MFN1介导的线粒体融合可保护心肌细胞凋亡,其机制可能与抑制ROS产生与细胞色素C释放有关。