中华绒螯蟹两个Sox基因HMG－box的克隆及测序

参照人SRY基因HMG-box保守区的序列设计一对兼并引物,PCR扩增中华绒螯蟹的Sox基因,并对扩增产物进行了克隆和测序。结果表明：在雌雄性个体中筛选出两个不同的Sox基因ESSox3和ESSox22,尽管中华绒螯蟹属甲壳类动物,但所测序列ESSox3和ESSox22的DNA序列和编码的氨基酸序列与人相应SOX基因的相似性分别为84%,85%和97%,81%,表明该基因在进化上具高度的保守性。本研究为探索中华绒螯蟹的性别决定机制以及Sox基因的进化提供了分子资料。     

虎斑颈槽蛇Sox基因的克隆及测序

参照人SRY基因HMG-box保守区序列设计一对兼并引物,PCR扩增虎斑颈槽蛇的Sox基因,采用SSCP技术筛选阳性克隆,并对其进行了测序。结果表明：在雌雄个体中共筛选出3个Sox基因,其中一个为雄性独有,显示出性别差异性,3个Sox基因DNA序列及编码的氨基酸序列与人相应SOX3,SOX11,SOX22基因的相似性分别为91%,92%,91%和98%,96%,96%。显示出高度的保守性,实验结果为虎斑颈槽蛇的性别决定机制研究提供了分子资料。     

大头蛙Sox基因的克隆与序列分析

参考人SRY基因HMC—box的保守区序列,设计一对特异引物,采用PCR技术扩增了大头蛙的Sox基因,并对扩增产物进行了克隆与测序。结果在雌雄个体中均扩增出217bp的基因片段,与人对照相同。序列分析表明,大头蛙雌雄个体之间Sox序列没有差异,与人SOX基因的同源性达到88％,与其它各类动物的Sox基因也都有非常高的相似性。结果支持Sox基因在进化上十分保守的结论。     

小鼠Sry基因和Sox基因的克隆分离与鉴定

为了深入探讨性分化分子机制,构建了小鼠基因库以ＳＲＹ探针筛选,分离到了两组阳性克隆,一组含ＥｃｏＲⅠ／３．５ｋｂ,此片段中载有小鼠Ｙ染色体上的Ｓｒｙ基因,另一组含ＥｃｏＲⅠ／３．０ｋｂ或ＳａｌⅠ／３．０ｋｂ,此片段有小鼠Ｙ染色体之外的Ｓｏｘ基因。     

乌龟Sox gene的PCR扩增及其条件

参照人SRY gene HMG-box保守区的序列,设计一对引物,扩增了乌龟的Sox gene,并对扩增条件进行了优化。结果显示乌龟Sox gene的扩增片段与人SRY gene扩增片段大小相同,为220bp左右,且雌雄个体间无差异;最佳扩增条件为：Mg^2 2.0mM、dNTP120μM、引物0.3μM及退火温度52℃。本研究为探索乌龟的性别决定机制以及Sox gene进货的保守性提供分子资料。     

赤链蛇Sox基因的克隆及序列分析

参照人SRY基因HMG-box保守区的序列,设计一对兼并引物,采用PCR技术扩增了赤链蛇的Sox基因,并对扩增产物进行了克隆和测序,结果在雌雄个体中共筛选出三个Sox基因,其中有一个为雌雄共有,显示出性别差异性;三个Sox基因编码的氨基酸序列与人相应SOX3,SOX4,SOX22基因的相似性分别为96%,98%,96%。显示出Sox基因在进化上的高度保守性,本文为赤链蛇的性别决定机制研究提供了分子资料。     

鲤鱼中Sox9b基因的克隆和表达

Sox9基因是一个重要的转录调控因子,参与性别决定及软骨等多种组织和器官的发育过程。本研究利用简并引物扩增鲤鱼基因组DNA,首次发现在鲤鱼中存在两种形式的Sox9基因。二者在保守盒区编码的氨基酸序列相同,并都存在一个内含子,但内含子序列差异很大,分别长704bp和616bp。在此基础上采用RACE技术克隆了鲤鱼Sox9b基因的5’端和3’端,通过拼接获得了2447bp的全长cDNA序列。编码428个氨基酸。其中96—174位共79个氨基酸为HMG保守盒。将鲤鱼Sox9b基因与三刺鱼等九种动物的氨基酸序列相比较发现。它们的同源性高达75％以上,显示soz9基因在进化中较保守。应用半定量RT—PCR技术对成体鲤鱼不同组织中Sox9b基因的表达进行了分析。结果表明该基因广泛表达,尤以脑及精巢中表达最为丰富。     

扬子鳄4个Sox基因保守区的克隆及序列分析

参考人SRY基因HMG－box的保守区序列,设计一对简并引物,用PCR扩增了扬子鳄Sox基因的HMG－box,并对PCR产物进行了亚克隆和测序。结果在雌雄个体中均筛选到4个不同的Sox基因,无性别差异。其序列与人相应的SOX基因保守区编码序列的相似性分别为91％、96％、100％、96％,分别命名为AS－Sox1,ASSox2,ASSox11,ASSox22。与其他动物相关的Sox/SOX基因的聚类分析结果表明,扬子鳄Sox基因编码的氨基酸序列与进化位置各异的其他动物的Sox/SOX基因编码的氨基酸序列存在高度的同源性,显示出Sox基因在系统进化上的高度保守性。     

虎纹蛙四个Sox基因的克隆及序列分析

参照人SRY基因HMG－box保守区的序列,设计一对兼并引物,扩增了虎纹蛙的Sox基因,并对扩增产物进行了克隆和测序。结果在雌雄个体中共筛选出四个不同的Sox基因,其序列与人相应SOX基因的相似性分别为92％、94％、985和98％。本研究为探索虎纹蛙的性别决定机制提供了分子资料。     

乌龟血液生物化学指标的初步研究

乌龟Chinemys reevesii 隶属龟鳖目、龟科、乌龟属。       

乌龟脑细胞辐射损伤的研究

在细胞培养的基础上,利用透射电镜和流式细胞术对乌龟脑细胞的辐射损伤进行了研究。在电镜下观察,未辐射脑细胞为不规则的几何形状,有突起伸出;细胞核不规则,几何状或椭圆形,核仁和核周间隙明显;线粒体基质电子密度均匀,内部嵴结构清晰;内质网清晰可见;细胞质匀质,内部充满大量糖原颗粒。乌龟脑细胞受辐射后,细胞外碎片增多;核出现明显的分叶,并可见核碎片;核染色质固缩、边集;线粒体、内质网和部分细胞质出现空泡化;可见凋亡小体。流式细胞术的检测结果显示:辐射组和未辐射组的细胞大部分都处于G₀/G₁期,分别占检测细胞总数59.7%和61.9%:在主峰前,辐射组细胞出现细胞凋亡峰:在G₂/M期,辐射组细胞的细胞数较未辐射组有所减少。研究结果表明,乌龟脑细胞经辐射后出现了凋亡现象。     

乌龟胚胎及仔龟的卵黄代谢

乌龟卵、卵黄、剩余卵黄和仔龟的含水量分别为６８．８７％、６１．４７％、６０．７５％和７６．４３％;干重分别为２．２９１５±０．２１０１ｇ,１．３０７１±０．２９１３ｇ,０．２６８１±０．０２４１ｇ和１．２３０５±０．２９９４ｇ;脂肪含量分别为１８．０３％、３１．７６％、３２．１０％和１９．３０％。卵黄、剩余卵黄和仔龟的热值分别为６．７１ｋｃａｌ／ｇＤＭ,６．７６ｋｃａｌ／ｇＤＭ和４．１０ｋｃａｌ／     

变色栓菌漆酶基因的克隆与序列分析

本研究以PCR扩增的方法,从变色栓(菌Trametes versicolor)的基因组DNA中扩增出了一预期大小的DNA片断,并将其克隆到了pUCM-T载体上。经筛选、酶切、PCR鉴定,序列分析,证明该片断为变色栓菌漆酶基因的克隆。该基因的开放阅读框由1560个核苷酸组成,编码一个由519个氨基酸组成的多肽。与GeneBank中发表的Laccase基因(AY081188)序列比较发现,编码的氨基酸序列同源性为96%,而核苷酸序列的同源性为92%。     

不同孵化湿度下的乌龟卵孵化成功率及新生幼体特征

A total of 51 Chinese three-keeled pond turtle Chinemys reevesii eggs were incubated on wet and dry substrates (water potentials of - 12 kPa and - 300 kPa, respectively) at 30℃ to assess the influence of the hydric environments on egg survival and hatchling traits. Eggs incubated in the dry condition lost weight, whereas those incubated in the wet condition did not. The hydric environments did not affect incubation lengths (60.3 vs 60.7 days) as well as hatching successes (69.2% vs 88.0% ). Except for wet body mass and carapace width, which were larger for hatchlings from the -12 kPa treatment than from the -300 kPa treatment, the hydric environments did not affect most hatchling traits. These unaffected traits included dry body mass, carapace length, tail length, limb length, hatehling components (carcass, residual yolk and fat bodies), swimming performance and critical thermal minimum. In conclusion, within the water potential of -12 to -300 kPa, hydric environments have little effect on embryonic development and hatchling traits in Chinese three-keeled pond turtles [Acta Zoologica Sinica 50 (1) : 133 - 136, 2004].     

Comparisons of egg incubation and hatchling traits among captive cohorts of the Chinese three-keeled pond turtle, Chinemys reevesii

Freshly-laid eggs of the Chinese three-keeled pond turtle (Chinemys reevesii) from captive cohorts in Hunan, Shanghai and Jiangxi were incubated at four constant temperatures of 24, 26, 28 and 30 °C to assess the effects of incubation temperature and cohort origin on incubation duration and hatchling phenotypes. Eggs from the three cohorts differed in size and shape. Egg mass and width were greatest in the Hunan cohort, smallest in the Jiangxi cohort, with the Shanghai cohort in between. Incubation duration decreased with increasing temperature and differed among the cohorts, with longer incubation duration for eggs from the Jiangxi cohort than those from the Hunan or Shanghai cohorts. Incubation temperatures significantly affected hatchling size and hatchlings from 30 °C were smaller than those from the lower temperatures in terms of carapace size and body mass. When incubated at a common temperature, hatchlings from the Hunan and Shanghai cohorts were larger than those from the Jiangxi cohort. The swimming capacity of hatchlings was affected by incubation temperature, but did not differ among the cohorts. The characteristics of eggs and hatchlings were similar among the Hunan and Shanghai cohorts, but they differed significantly from the Jiangxi cohort.     

孵化温度与性别对乌龟幼体大小和生长的影响

以温度依赖型性别决定(TSD)物种乌龟(Chinemys reevesii)为对象,应用17β-雌二醇和芳香化酶抑制剂Fadrozole处理26、28和30℃条件下孵化的卵,抑制孵化温度对后代性别的作用,获得性别逆转幼体。通过比较幼体形态、游泳能力和生长特征的孵化温度和性别间差异,检验TSD适应意义的Charnov-Bull假设。雌雄幼体的孵化期因孵化温度不同而不同,在26℃条件下,雄性幼体的孵化期长于雌性幼体,而在28和30℃条件下,孵化期则无两性差异。幼体大小与孵化温度和性别有关。低温幼体大于高温幼体,雌性幼体大于雄性幼体。幼体的游泳能力既不受孵化温度的影响,也无两性差异。幼体生长与孵化温度无关,但存在两性差异,雌体生长速度显著快于雄体。Charnov-Bull假设预测,TSD Ia型物种的高温雌体适合度应高于低温雌体,而高温雄体适合度则应低于低温雄体。研究结果与上述预测不符,故不支持该假设。     

孵化温度对乌龟胚胎能量利用及矿物质代谢的影响

在24℃、27℃、30℃和33℃条件下孵化乌龟(Chinemysreevesii)卵,检测温度对胚胎利用卵内能量和矿物质的影响。孵化温度显著影响乌龟胚胎的能量利用。卵在温和温度下(27℃和30℃)比在高温(33℃)和低温(24℃)孵化有较高的干物质、脂肪和能量转化率。因而,27℃和30℃新生幼体的总能量高于33℃和24℃下孵出的幼体。新生幼体内剩余卵黄随温度升高而增大。27℃下新生幼体的躯干能量显著高于其它温度。此外,孵化温度显著影响乌龟胚胎钙代谢,但对镁和钾代谢影响微弱。24℃下胚胎从卵黄和卵壳吸收的总钙量小于其它温度条件下胚胎,与之相对应,24℃下孵出卵卵壳内残留较多的钙。由此可见,温和温度(27-30℃)可提高胚胎能量转化效率,促进胚胎从卵黄和卵壳吸收较多的矿物质,有利于孵出发育良好的乌龟幼体