抗体选择压作用下H9N2亚型禽流感病毒NA基因的变异

将LG1株H9N2亚型禽流感病毒在带有抗LG1株母源抗体的鸡胚中分4个独立系列连续传40代后,有3个系列从10～20代起在NA基因的#99位发生了可稳定遗传的碱基"G"到"A"的突变,并使氨基酸由蛋氨酸变为异亮氨酸;有2个系列从20～30代起在#473位发生了可稳定遗传的由"A"到"G"的碱基突变,导致相应的氨基酸由天冬酰胺变为丝氨酸,另一个传代系列在50代时也发生了同样的突变。在无抗体的鸡胚上的2个独立对照系列同样传了80代,在这2个位点没有发生突变,表明这2个突变与抗体的选择压相关。在抗LG1母源抗体阳性鸡胚的连续40代传代过程中,NA基因在有抗体组的四个传代系列碱基的非同义突变(NS)与同义突变(S)比为4.6(32/7),而在无抗体组NS/S比为2.0(16/8)。有抗体组NS/S值显著高于无抗体组,也显示出抗体的选择压作用。     

鸡体内疫苗抗体选择压对H9N2亚型禽流感病毒内部基因演化的影响

在我国,接种疫苗是防控H9N2亚型禽流感(Avain influenza,AI)流行的主要措施。为了解H9N2亚型禽流感病毒(Avain influenza virus,AIV)在疫苗抗体选择压下的遗传变异情况,本研究选择A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2,F/98)禽流感病毒分别在有和没有疫苗抗体选择压的SPF鸡体内连续传代。为了减少混合病毒对研究结果的干扰,我们建立了三个独立传代系列。结果表明,母本病毒在经过有和没有疫苗抗体选择压下连续传代后,两种模式下的传代病毒的内部基因都发生了基因突变。与没有疫苗抗体选择压下的传代病毒相比,有疫苗抗体选择压下的传代病毒氨基酸突变数量明显减少(P0.05),肺组织分离到的传代病毒的突变氨基酸数量显著多于相同传代条件下气管中分离到的传代病毒的氨基酸突变数量(P0.05)。此外,疫苗抗体选择压下的传代病毒V9L和V9T有4个特有突变:PB2(H366Q、A322E)和M(P154A、A246Q),没有疫苗抗体选择压下的传代病毒N9L和N9T有9个相同突变:PB2(I298Q、E526R)、PB1(T348A)、PA(L336M)、NP(G52A、L187G)、M(H23I)和NS(S81L、H85S),所有第9代次的传代病毒相同的突变有2个:PB2(R327K、Y369S)。值得注意的是,相比母本病毒没有疫苗抗体选择压下的传代病毒对鸡胚的感染力显著提高(P0.01),而有免疫选择压下的传代病毒对鸡胚的感染力相比母本病毒变化不大(P0.05),但丧失了致死鸡胚的能力。本研究对了解禽流感病毒在疫苗的选择压力下的演化规律,以及理解疫苗对病毒进化的影响具有重要参考意义。     

封闭式饲养鸡场H9N2亚型禽流感病毒HA基因在5年内的遗传变异

选择一个于1998年开始发生H9亚型禽流感的封闭式大型养鸡场,连续5年内分离到22株H9N2亚型病毒,对其中9株与1998年分离株进行HA基因序列和病毒抗原性的比较结果表明,这些分离株均与1998年的具有较高的序列同源性,且在本研究期内HA基因的这些变化尚未产生引起交叉保护性改变。初步推断这些分离株均系1998年分离株在场内循环传播变化得来,其HA基因的变异可能与频繁的疫苗免疫选择压力有关。这为进一步研究禽流感病毒变异的规律和制定正确的禽流感防治对策具有重要意义。     

在疫苗免疫选择压力下H9N2亚型禽流行性感冒病毒HA基因的遗传变异

为了解H9N2亚型禽流行性感冒(流感)病毒在同亚型灭活疫苗的选择压力下的遗传变异情况,对某鸡场的感染鸡群进行连续4年的跟踪监测,对使用疫苗前和持续使用疫苗后不同时段分离到的H9N2亚型禽流感病毒的HA基因进行全序列分析.结果表明,在使用第一次分离的病毒株制备的疫苗后8个月分离到的病毒株,其HA基因仅发生一个氨基酸的差异;但在继续使用该疫苗的第二个和第三个年头分离的病毒株,它们的HA基因则一直在发生较大的变化.这一发现对进一步研究禽流感病毒在不断使用疫苗的选择压力下发生变异的规律,指导制定正确的禽流感防制对策具有重要意义.     

山东地区16株H9N2亚型禽流感病毒HA基因的序列分析

为了解H9N2亚型禽流感病毒(AIV)山东分离株的遗传变异情况,采用RT-PCR技术对16株从山东不同地区分离的H9N2亚型禽流感病毒的HA基因进行扩增、克隆和测序,并对所获得的HA全序列进行同源性和遗传进化分析。结果显示,16个分离株的裂解位点均为RSSR↓GLF,符合低致病性禽流感病毒的分子特征;有7～9个潜在糖基化位点;受体结合位点除198位有变异,其他位点均较保守;234位氨基酸均为L,具有与哺乳动物唾液酸α,2-6受体结合的特征;16个分离株HA基因核苷酸及氨基酸序列同源性分别为96.3%～99.9%和97.1%～99.6%;16个分离株同属于欧亚分支中的A/Duck/Hong Kong/Y280/97亚群。     

H9N2亚型禽流感病毒NS1基因的进化分析

利用RT-PCR方法,扩增了1998～2005年间分离的9株H9N2亚型禽流感病毒的NS1基因,对其进行了序列测定和进化分析.序列分析表明,9株AIV NS1基因完整的阅读框均为654bp,编码217个氨基酸,其核苷酸和推导的氨基酸同源性分别为95.4%～99.8%和93.6%～100%;9株病毒的NS1蛋白的C端均有13个氨基酸的缺失;进化分析表明,9株AIV属于A群,且形成一个独立分支,在该分支中,只有Ck/HN/A3/98株属于Ck/HK/Y280/97-like亚类,且与Ck/BJ/8/98的进化关系最近,其余8株属于Ck/SH/F/98-like亚类,说明Ck/SH/F/98-like亚类的H9N2亚型AIV在中国大陆的鸡群中广泛存在.NS1基因的进化及其编码产物的特性分析,为AIV的毒力变异、致病机制、药物靶位点的设计及鉴别诊断的研究奠定了基础.     

H9N2亚型禽流感病毒基因组全长序列测定和各基因的遗传分析

用RTPCR技术及cDNA末端快速扩增法获得禽流感病毒分离株A/Chicken/Shanghai/F/98（H9N2）代表基因组全长的8个基因片段。基因组序列比较及遗传进化分析结果表明,Chicken/Shanghai/F/98的8个基因均不属于Quail/Hong Kong/G1/97亚系,与香港禽流感事件没有直接关系。它与Chicken/Beijing/1/94的HA、NA、M、NS基因同源率分别为96.7%、96.4%、97.5%和98.0%,这4个基因属于Chicken/Beijing/1/94亚系,其中,NA基因与Duck/Hong Kong/Y280/97的同源率为97.4%,而且它们均在205位后缺失9个核苷酸。而PB2、PB1、PA和NP基因与已知的3个亚系关系较远,分别在相应的进化树上另成分支。因此,Chicken/Shanghai/F/98是两个以上不同基因亚系间发生自然重排的产物。     

上海地区H9N2亚型禽流感病毒的遗传演化分析

为阐明上海地区 H9N2亚型禽流感病毒分离株的遗传变异、分子特征和重组模式,选取2002和2006～2014年分离自活禽市场、家禽养殖场和生猪屠宰场的14株 H9N2亚型禽流感病毒进行分析。这14株病毒分别来源于鸡、鸭、鸽、野鸡咽喉和泄殖腔样品及猪肺脏样品,用 H9亚型荧光反转录‐聚合酶链反应（RT‐PCR）试剂盒检测后,阳性样品经无特定病原体（SPF）级鸡胚尿囊腔接种并分离病毒,用血凝抑制（HI）实验进一步确定其血凝素（HA）亚型。RT‐PCR分别扩增这14株病毒全基因并进行序列测定,分析8个基因片段的遗传发生关系,发现这些分离株主要由 F／98亚系、Y280亚系、G1亚系及未知亚系重组而成。根据8个基因片段的组合情况,这14株病毒可分成5个基因型。2002、2006～2008年分离的5株H9N2亚型禽流感病毒代表了4个不同基因型,2009～2014年分离的9株H9N2亚型禽流感病毒属第5种基因型,推测可能与疫苗免疫选择压力有关。因此,在以后工作中加强H9N2亚型禽流感分子流行病学监测是非常必要的。     

提高H9N2亚型禽流感病毒的拯救效率条件的优化

目的:在原有的8质粒转染体系的基础上,提高H9N2亚型禽流感病毒8质粒转染的效率。方法:以脂质体细胞转染法,用293T细胞和MDCK细胞共转染A/Chicken/Jiangsu/SH14(H9N2)禽流感病毒的8个连接在PHW2000载体上的反向遗传质粒,并且NS片段携带有GFP绿色荧光基因。通过TPCK胰酶的浓度,DMSO,尿囊液的作用,以及转染后孵育时间来摸索出最佳的转染条件。转染后48h用倒置荧光显微镜检测绿色荧光,并计算出转染效率。结果:通过统计学分析结果可见,转染后8h,使用DMSO处理后再加入1ug/m L的TPCK胰酶,转染效率最高,绿色荧光表达的最多。结论:我们通过联合DMSO和TPCK的方法一定程度上提高了H9N2亚型禽流感病毒8片段转染的效率。     

鸭源H9N2AIV血凝素基因序列比较

为明确国内外鸭源H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)血凝素基因(hemagglutinin,HA)的遗传进化关系、血凝素蛋白裂解位点的氨基酸结构特征和血凝素蛋白受体结合位点的氨基酸变异特征,本研究选取GenBank中登录鸭源H9N2亚型AIV HA基因,通过MEGA4.1进行比对和分析,并绘制其遗传进化树。结果表明,鸭源H9N2亚型AIV在遗传进化上分为2大谱系:即Ck-Bj-1-94-like和North-Ame-like,中国大陆鸭源H9N2亚型AIV和亚欧美其它国家鸭源H9N2亚型AIV在遗传进化上分居完全不同的谱系,相互之间遗传进化关系较远。从血凝素受体结合位点看,亚欧美国家鸭源H9N2亚型AIV在第183、190和226位点的氨基酸均为鸭源AIV经典H、E和Q,且高度保守。但中国大陆地区H9N2亚型AIV第183位为N;第190位为A or V or T,与中国大陆鸡源H9N2亚型AIV一致;第226位中国鸭源H9N2亚型AIV有相当一部分为L,且近年福建省H9N2亚型AIV分离株在此处均为L。提示我们,中国大陆地区H9N2亚型AIV鸭鸡和鸡鸭相互交叉感染较为普遍。     

H9N2亚型禽流感病毒基因组的遗传进化分析

2009～2011年从江苏省、湖北省和安徽省等地来源于鸡、鸭、鹌鹑和鸽子的样品中分离鉴定出16株H9N2亚型禽流感病毒。通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出分离株的全基因片段,并对其进行测序及遗传进化分析。序列分析显示,16株病毒HA基因裂解位点氨基酸序列为P-S-R/K-S-S-R,符合低致病性禽流感的分子特征;226位均为L,具有与哺乳动物唾液酸α,2-6受体结合的特性。M2基因均出现了对金刚烷胺产生耐药性的N31S突变。不同宿主来源的H9亚型AIV的主要分子特征一致。全基因遗传进化分析表明16株H9N2亚型禽流感病毒全基因发生了3配体重组,即以F98亚系AIV为骨架,HA来源于Y280亚系,PB2和M基因来源于G1亚系,形成了2种新的基因型。因此,要加强对H9N2亚型禽流感病毒的监测,密切关注它的重组趋势。     

Selection pressure on Haemagglutinin genes of H9N2 influenza viruses from different hosts

Positive selection and differential selective pressure analyses were carried out to study Haemagglutinin (HA) genes of H9N2 influenza viruses from different hosts in this paper. Results showed that, although most positions in HAs were under neutral or purifying evolution, a few positions located in the antigenic regions and receptor binding sites were subject to positive selection and some of them were even positively selected at the population level. In addition, there were always some positions differentially selected for viruses from different hosts. Both selection pressure working on HA codons and positions differentially selected might account for the extension of the host range and adaptations to different hosts of H9N2 influenza viruses.     

一株针对H7N9亚型禽流感病毒血凝素蛋白茎部的单克隆抗体的表征

流感病毒血凝素蛋白(hemagglutinin,HA)的茎部区相对保守,是广谱疫苗、抗体与病毒检测制剂的重要靶点.前期研究获得了一株与H7N9亚型禽流感病毒HA蛋白茎部多肽(aa 428-452)反应的单克隆抗体(5D3-1B5).为系统评价其生物学特性,本研究测定了5D3-1B5的抗体效价(IgG、血凝抑制与病毒中和...     

H5N8亚型高致病性禽流感病毒的全球流行概况

H5N8亚型高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus,HPAIV)随候鸟的迁徙活动及商业贸易活动现已蔓延至亚洲、欧洲、非洲、美洲等国家和地区.2014-2015和2016-2019年H5N8亚型HPAIV已引发两波全球疫情,现正经历第三波疫情,导致家禽及野生鸟类...