基于裂解酶与ATP生物发光法特异定量检测炭疽杆菌方法的研究简

目的：原核表达炭疽杆菌噬菌体叮裂解酶（PlyG）和萤光素酶（Luc）,结合这2种酶建立特异定量检测炭疽杆菌的方法。方法：PCR扩增得到带有His标签的裂解酶基因和萤光素酶基因,构建重组表达载体pET22b-p@G和DET22b-luc,转化至大肠杆菌BL21（DE3）并诱导表达,过镍柱纯化得到目的蛋白;利用裂解酶裂解和ATP生物发光定量检测蜡样芽孢杆菌RSVFl,与平板计数法对比建立线性关系。结果：表达了炭疽杆菌噬菌体γ裂解酶和萤光素酶,并建立了特异定量检测蜡样芽孢杆菌RSVF1的方法,与平板计数方法具有显著的线性相关。结论：因炭疽杆菌与蜡样芽孢杆菌RSVF1均对PlyG具有较强的敏感性,故本研究所建立的将炭疽杆菌噬菌体γ裂解酶与萤光素一萤光素酶系统相结合的检测方法对现场或临床定性定量检测炭疽杆菌提供了理论支持,具有良好的应用前景。     

基于裂解酶与ATP生物发光法特异定量检测炭疽杆菌方法的研究

目的:原核表达炭疽杆菌噬菌体γ裂解酶(PlyG)和萤光素酶(Luc),结合这2种酶建立特异定量检测炭疽杆菌的方法。方法:PCR扩增得到带有His标签的裂解酶基因和萤光素酶基因,构建重组表达载体pET22b-plyG和pET22b-luc,转化至大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达,过镍柱纯化得到目的蛋白;利用裂解酶裂解和ATP生物发光定量检测蜡样芽孢杆菌RSVF1,与平板计数法对比建立线性关系。结果:表达了炭疽杆菌噬菌体γ裂解酶和萤光素酶,并建立了特异定量检测蜡样芽孢杆菌RSVF1的方法,与平板计数方法具有显著的线性相关。结论:因炭疽杆菌与蜡样芽孢杆菌RSVF1均对PlyG具有较强的敏感性,故本研究所建立的将炭疽杆菌噬菌体γ裂解酶与萤光素-萤光素酶系统相结合的检测方法对现场或临床定性定量检测炭疽杆菌提供了理论支持,具有良好的应用前景。     

利用扩增片段长度多态性分析鉴别炭疽和蜡样芽孢杆菌

目的:利用扩增片段长度多态性(AFLP)分析建立鉴别炭疽芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌的分子生物学方法。方法:3株炭疽芽孢杆菌和3株蜡样芽孢杆菌基因组经限制性内切酶EcoRⅠ和MseⅠ酶切后与对应接头连接,通过预扩增和选择性扩增获得特异性DNA片段,将片段进行毛细管电泳,并利用GeneScan和BioNumerics软件对电泳数据进行分析。结果:选择性扩增最佳引物组合为EcoRⅠ-G/MseⅠ-A,其扩增片段在100~500 bp范围内的有效数量为40~50条;比较炭疽芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌的AFLP特征峰值图和DNA指纹图谱,确定了5个有明显差异的片段区。结论:利用AFLP分析可对芽孢杆菌属中相近的炭疽芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌进行鉴别,该方法可作为炭疽芽孢杆菌传统鉴定方法的补充。     

制备炭疽芽胞杆菌检测基因芯片的初步研究

建立制备炭疽芽胞杆菌检测基因芯片的技术,并探讨研制检测炭疽芽胞杆菌基因芯片的方法。酶切炭疽芽胞杆菌的毒素质粒和荚膜质粒,通过建立质粒DNA文库的方法获取探针,并打印在经过氨基化修饰的玻片上,制成用于炭疽芽胞杆菌检测的基因芯片。收集了290个阳性克隆探针,制备了检测炭疽芽胞杆菌的基因芯片。提取炭疽芽胞杆菌质粒DNA与基因芯片杂交,经ScanArray Lite芯片阅读仪扫描得到初步的杂交荧光图像。通过分析探针的杂交信号初步筛选出273个基因片段作为芯片下一步研究的探针。     

炭疽芽胞杆菌基因芯片探针文库的构建

为制备炭疽芽胞杆菌的基因芯片探针文库,以炭疽芽胞杆菌毒素质粒pX01和荚膜质粒pX02为原材料,用Sau3A I酶切pX01和pX02质粒DNA,Taq DNA聚合酶72℃补平加A,经AT克隆,PCR初步鉴定筛选出炭疽质粒片段的阳性克隆．DNA自动分析仪对克隆片段进行序列测定;用生物信息学方法对其片段进行同源性分析;并将克隆的探针打印于玻片上,制备成炭疽芽胞杆茵基因芯片,与炭疽杆茵质粒DNA样品进行初步芯片杂交的实验,杂交实验的阳性率达到了90％以上,证明大部分克隆探针属于炭疽芽胞杆菌．炭疽芽胞杆菌基因芯片探针文库的构建为基因芯片探针的制备摸索出一条简便、高效、可行的方法．     

质粒介导的炭疽毒素产生的证据

<正>炭疽杆菌是炭疽的病原菌,而炭疽是一种具有相当经济重要性的高度传染病。家畜诸如牛、绵羊、山羊和马是该病最普通的受害者;而炭疽的人类病例经常是由于暴露于受染动物或动物制品诸如皮革,毛发、肉或骨而发生。大多数的人类炭疽病例实际上是皮肤型的,同时对抗生素类药物的反应良好。但是胃肠型和肺型虽然在所有人类病例中少于5％,却常常是致命的。     

炭疽杆菌毒素的可能的解毒药--多价抑制剂

ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 2 0 0 1年 19卷 10期 95 8～ 96 1页报道 :炭疽毒素是由炭疽杆菌 (Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ)产生的。在临床上 ,炭疽病是罕见的 ,但目前由于在生物战争和恐怖行为中有可能使用炭疽杆菌 ,因而引起科学家对炭疽病的日益增加的关注。如所周知 ,炭疽杆菌毒素是由保护抗原 (ＰＡ) ,即单一的受体结合部分 ,以及两种酶促部分 ,即水肿因子(ＥＦ)和致死因子 (ＬＦ) ,共同组成的。这 3种蛋白作为无毒的单体从炭疽杆菌体内释出后 ,就扩散到哺乳动物细胞表面的受体 ,并组配成为有毒的可结合于宿主细…     

国内外炭疽研究的新进展

<正> 1966年10～11月在美国马里兰州召开的炭疽杆菌专题会议上,Nungester,W J(1967)提出了炭疽今后研究的15个问题,题目的范围很广,包括人和动物的炭疽流行病学。水土等外环境污染的消除。高原( 6000呎以上, 2000米以上)很少发病的原因( Manuel,1967),病原学包括炭疽杆菌的生活史,芽胞侵入机体的方式,芽胞发芽及感染机制,可溶性抗原的生物学和理化特性,炭疽病理生理学,类毒素和活菌苗的免疫应答,中和毒素的治疗作用等等。     

炭疽芽胞杆菌中CRISPR位点

【目的】考察炭疽芽胞杆菌中规律成簇的间隔短回文序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)位点多态性情况及基于CRISPR位点多态性的分子分型方法是否在炭疽芽胞杆菌分型中适用。【方法】下载NCBI数据库中6株炭疽芽胞杆菌基因组并截取其中CRISPR位点片段序列。根据炭疽芽胞杆菌内CRISPR位点信息,设计相关引物,以193株炭疽芽胞杆菌基因组为模板PCR扩增CRISPR位点片段,测序。本地Blast比对截取序列及测序结果,查看CRISPR位点在炭疽芽胞杆菌中的多态性情况,并比较炭疽芽胞杆菌与蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌内CRISPR位点情况。【结果】炭疽芽胞杆菌内CRISPR位点不存在多态性。【结论】基于CRISPR位点多态性的分子分型方法不适用于炭疽芽胞杆菌分型,但可以用于区分炭疽芽胞杆菌与蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌。     

炭疽杆菌检测方法的研究现状与展望

炭疽是严重威胁人类健康的烈性传染病,其病原体为炭疽芽孢杆菌。炭疽芽孢杆菌在我国公布的《人间传染的病原微生物名录》中被列为第二类病原微生物(高致病性病原微生物),其芽孢可作为生物战剂和生物恐怖的原材料,因此,发展灵敏、高效的炭疽杆菌检测方法十分重要和紧迫。按检测的靶标分类,针对炭疽杆菌的检测方法主要有四大类:针对炭疽杆菌芽孢的检测方法,针对细菌繁殖体的检测方法,针对炭疽杆菌基因的检测方法和针对炭疽毒素蛋白的检测方法。其中,针对炭疽杆菌芽孢和细菌繁殖体的检测已经有比较成熟的方法,但其在特异性以及临床的实用性方面难以令人满意;针对炭疽杆菌基因的检测技术在特异性和灵敏度上有较大的提高,但在临床诊断等方面还有欠缺;而针对炭疽毒素蛋白的检测技术的发展,使得直接对炭疽杆菌的主要致病因子的检测成为可能,这对于临床诊断以及流行病学研究具有重要意义。本文对当前炭疽杆菌检测方法的最新进展做了简要的归纳,关注了不同检测方法的适用范围和检测能力,并展望了相关领域的发展趋势,希望能为从事炭疽杆菌检测方法研究的同行提供参考和帮助。     

炭疽杆菌荚膜研究进展

本文对炭疽杆菌荚膜的本质、在感染中的作用、合成与基因调控以及免疫原性进行了回顾。炭疽杆菌荚膜的研究进展使得对炭疽感染的机制,炭疽杆菌逃避宿主免疫系统的机制,机体对炭疽的免疫应答及其作用有了深入的了解。     

炭疽杆菌致病性研究进展

炭疽杆菌是人类历史上第一个被发现的病原菌。炭疽杆菌的研究在近几年取得了较大进展 ,特别是本年度其基因组序列测定已完成并向全世界公布 ,进一步深化了对炭疽杆菌的研究。炭疽杆菌致病性的研究一直是炭疽杆菌研究的重点 ,近年来此方面的研究取得了很多新进展 ,从基因组、致病物质及致病机制 3个方面对此作一个简单的介绍。     

用荧光抗体双重染色法快速检验炭疽芽孢杆菌

用FFTC标记的抗带荚膜的炭疽芽孢杆菌球蛋白和RB-200标记的抗无荚膜的炭疽芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌菌体球蛋白进行双重染色,结果带荚膜的炭疽芽孢杆菌显示特异性染色反应,其荚膜发明亮的黄绿色荧光,荚膜内的菌体里黄红色。而蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(形成荚膜或不形成荚膜的)等都被染成红色,与带荚膜的炭疽芽孢杆菌形成鲜明的对比。这样就避免了交叉反应,成为一种特异性很高的快速检验炭疽芽孢杆菌的方法。     

炭疽杆菌与其他需氧芽孢杆菌鉴别方法的研究

炭疽杆菌与其他需氧芽孢杆菌间的鉴別至今尚无较可靠方法。本文乃报导43株标准炭疽杆菌,33株标准的其他需氧芽孢杆菌及212株新分离的需氧芽孢杆菌实验结果:（1）串珠试验,43株标准炭疽杆菌中95.3%阳性,80株新分离炭疽杆菌92.5%为阳性而165株其他需氧芽孢杆菌全部为阴性。（2）W噬菌体裂解试验,所有炭疽杆菌全部被裂解,其他的需氧芽孢杆菌中仅有1株新分离的蜡样杆菌被裂解,其余全不被裂解。（3）碳酸氢钠培养基上CO2培养试验,43株标准炭疽杆菌中除7株弱毒株外,均出现粘液菌落,80株新分离的炭疽杆菌中78株出现粘液菌落而其他的则均不出现粘液菌落。（4）青霉素抑制试验、水杨苷发酵试验、动力试验及溶血试验在炭疽杆菌为阴性,在其他需氧芽孢杆菌中则不一致。因此提出,串珠试验、W噬菌体裂解试验及碳酸氢钠培养基上CO2培养下菌落的观察可作为炭疽与非炭疽杆菌的主要鉴別方法;而普通培养基上菌落的观察、青霉秦抑制试验、水杨苷发酵试验、动力试验及溶血试验可作为辅助的鉴別方法。     

PlcR在炭疽芽胞杆菌A16R中的功能研究

炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)、蜡样芽胞杆菌(B. cereus)和苏云金芽胞杆菌(B. thuringiensis)均属于蜡样芽胞杆菌群,在遗传学上有很高的相似性。PlcR (Phospholipase C regulator)在蜡样芽胞杆菌中是十分重要的调控因子,但plcR基因在炭疽芽胞杆菌中发生一个无义突变导致在炭疽芽胞杆菌中产生一个截短PlcR蛋白。为了研究plcR基因对炭疽芽胞杆菌功能的影响,文章以蜡样芽胞杆菌CMCC6330基因组为模板,构建重组表达质粒pBE2A-plcR后导入炭疽芽胞杆菌疫苗株A16R中获得重组菌株,对其进行表型分析。结果显示,炭疽芽胞杆菌重组菌株的溶血活性基本没有恢复,但恢复了部分神经鞘磷脂酶活性,表明将蜡样芽胞杆菌的plcR基因导入炭疽芽胞杆菌后,可以直接激活神经鞘磷脂酶活性。     

炭疽杆菌保护性抗原在大肠杆菌中的表达及其纯化

利用基因重组技术获取炭疽杆菌保护性抗原(PA)。将炭疽杆菌保护性抗原编码基因pag与pET载体连接构建重组质粒,转化大肠杆菌DE3株,诱导表达炭疽杆菌保护性抗原,并经亲和层析及凝胶过滤纯化此抗原。实验成功构建了表达炭疽杆菌保护性抗原的重组菌株,纯化后PA纯度达90%,且经检测纯化产物具有天然PA的生物学活性。同时表明从大肠杆菌中纯化PA较以往从炭疽杆菌中获取PA简便易行。     

炭疽活疫苗家兔免疫力与血清抗芽胞IgG关系的研究

炭疽疫苗是预防炭疽流行和炭疽生物恐怖的重要手段。已有动物实验表明,炭疽活疫苗的保护力优于以保护性抗原为主要成份的无细胞疫苗,但两类现行疫苗都有待重新评价和改进。炭疽疫苗的效力必须用适当的实验室方法进行检测与分析才能了解其性质和细节。试验中力图探寻炭疽活疫苗家兔免疫力与血清抗芽胞抗体水平的关系。用“皮上划痕人用炭疽活疫苗”免疫家兔,以特定制备的炭疽芽胞抗原用ELISA法检测血清抗炭疽芽胞IgG抗体水平,并用强毒炭疽杆菌攻击进行效力试验。免疫家兔血清几何平均抗芽胞IgG滴度在免疫后一个月内持续升高,14d达到206,28d时达到776,这时其抵抗20MLD毒菌攻击的保护率为80％,符合中国生物制品规程要求的保护力。一个月后抗体水平开始下降,42d时滴度降至223。实验所揭示的炭疽减毒活疫苗诱导的家兔抗芽胞IgG抗体与抗炭疽保护力之间的关系,既为评价现行疫苗提供了资料,也为研制新型疫苗建立了参考性指标。     

蜡样杆菌是否产生炭疽毒素

据先期PNAS在线版报道,在一个幸存于吸入型炭疽肺炎综合症患体内分离到的蜡样杆菌中发现了编码炭疽毒素的质粒,这是首次在炭疽杆菌以外的自然微生物中发现完整炭疽质粒。     

蜡样芽孢杆菌的分类地位和鉴定标准

<正>需氧芽孢杆菌属中发现最早的是枯草芽孢杆菌(1835,1835,1872),其次是炭疽芽孢杆菌(1872)。后来陆续发观许多新的芽孢杆菌,形态与炭疽芽胞杆菌类似或相仿,于是人们把一些与炭疽芽胞杆菌相似的近缘菌统称之为“类炭疽杆菌”或“伪炭疽杆菌”,直到本世纪三十年代尚且如此。(Wagner,1920,1923,Grierson,1928)。 本世纪四十年代以来,对需氧芽孢杆菌属的分类研究有了很大进展,基本均以Bergey的细菌鉴定手册为准。但在各个种的分类地位上仍有不同观点,如Smith等     

炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)检测质粒的构建及其应用

根据炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)毒性质粒pX01和pX02上的2个毒力相关基因cya和capA的序列特点,以pIJ2925为出发载体,采用一步重叠延伸PCR技术(One-step Overlap Extension PCR,简称OOE-PCR)构建了包含cya基因和capA基因保守区DNA片段的炭疽检测质粒pBIB2006。采用复合PCR对模拟炭疽危险品进行分析,结果表明pBIB2006可以为炭疽芽胞杆菌的检测提供准确、安全和方便的阳性参照品,从而为检测炭疽芽胞杆菌和炭疽芽胞杆菌灭活疫苗提供了便利。