用于Illumina测序平台不同试剂盒制备RNA-seq文库的方法比较

RNA-seq是利用深度测序进行转录组分析的技术,并且在新一代测序的主流平台Illumina上运用广泛。针对Illumina平台的RNA-Seq建库,目前有多个不同类型的建库方法支持该技术,但是在操作步骤和成本上有很大差距。本研究分别试验了Tru Seq RNA文库制备、NEBNext RNA文库制备以及KAPA RNA文库制备3种方法,首次系统地对这3种建库方法得到的片段长度,浓度和建库流程进行了比较分析。研究显示,3种文库的片段长度都集中在300~1 000 bp之间,KAPA RNA文库制备得到的文库浓度最高,该制备方法只需要进行一次磁珠纯化,操作简便,成本低,所需要的起始量低,适用于进行大规模的建库实验。     

肠道菌群核酸提取自动化流程的优化

目的:优化肠道菌群核酸提取自动化流程。方法:收集粪便样本,分别采用手工方法、核酸提取工作站提取核酸,然后利用液体工作站制备PCR反应液进行PCR扩增,最后采用文库工作站建库测序。结果:400μl样品用QIAamp~ Fast DNA Stool Mini Kit试剂盒裂解液裂解后,用MagMAX~(TM) Express 96机器提取核酸的方法与用QIAamp~ Fast DNA Stool Mini Kit试剂盒手工提取核酸的方法相比,测序得到的序列数基本一致,分析结果也没有明显区别;而单独采用MagMAX~(TM)Viral RNA Isolation Kit试剂盒提取核酸由于样品投入体积受限(50μl)、核酸浓度低、测序得到的序列数太少,不能满足后续的分析要求。结论:通过结合使用两种不同的试剂盒,可以实现核酸提取、PCR反应液配制及文库制备的全流程自动化操作,从而大大提高工作效率和结果的稳定性。     

微量RNA的cDNA PCR文库的构建

使用PCR（polymerase chain reaction)技术,调制了mRNA的cDNA PCR文库,实验证明,cDNA PCR文库能使原cDNA的量放大数百倍,同时,使用人体K562培养细胞的总RNA,对cDNA PCR文库法和反转录中的β-Actin的cDNA量进行了比较,cDNA PCR文库法中的β-Actin的cDNA量大于高于反转录中的β-Actin的cDNA量,使用75pg的人体K562培养细胞的总RNA,调制成50ul的CDNA PCR文库,使用1ul的CDNA PCR文库进行了PCR反应时,可对文库中β-Actin的CDNA进行PCR检测,因此,CDNA PCR文库显示了良好的信息放大性能。     

基于PLP-LDR-HRCA策略进行微量DNA分析——rs17750303位点分型

增强PCR和全基因组扩增是当前微量DNA分析的主要策略,但是,由于DNA模板量过少,受随机效应影响显著,往往不能得到可靠的DNA分型结果.本文提出一种新的检验策略:PLP-LDR-HRCA,尝试微量DNA检材的SNPs分型研究.选择rs17750303位点,并设计等位基因特异性锁式探针,采用连接酶检测反应来识别等位基因,而后采用超分支滚环扩增反应来放大检测信号.结果表明,PLP-LDR-HRCA反应特异性好,灵敏度高,能够直接鉴别微量基因组DNA模板中待测SNP位点,rs17750303纯合型样品(AA型或CC型)和杂合型样品(AC型)准确分型所需最少模板量分别为20pg和30pg.对于增强PCR和全基因组扩增技术不能有效检验的微量检材,PLP-LDR-PCR策略独具优势,可能具有较大的开发价值.     

PCR依赖型方法构建高质量酵母基因突变文库

针对定向进化中利用亚克隆的方法建立酵母突变文库建库周期长、效率低、库容量低、丰度低等问题,建立了一种基于体内同源重组构建酵母整合型基因突变文库的新方法。步骤为：构建目标基因的重组表达质粒;以此为模版,设计长引物片段,PCR/易错PCR/DNA Shuffling等方法扩增得到两端带有与表达载体40~70 bp同源序列的突变基因;再利用PCR扩增得到表达载体;将扩增得到的目标基因和表达载体以一定的摩尔比混合电转化酵母,目标基因和表达载体在酵母体内同源重组成为完整的表达盒,整合入酵母基因组,获得基因突变文库。对构建的突变文库进行筛选,分别得到了酶活、蛋白表达量及热稳定性提高的突变株。该方法为完全PCR依赖型 (PDM),在体内构建表达盒,效率高,操作方便,将建库周期由2周缩短为3 d,将库容量从传统的103~104提高到105以上,库阳性率达到95％。     

猪FGL2基因cDNA末端序列检测及结构分析

检测猪FGL2基因cDNA末端序列并对该基因结构初步分析。α-32P dCTP放射性同位素标记cDNA探针筛选猪基因组DNA文库;cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA end,RACE)。以猪正常小肠及心脏组织提取新鲜总RNA,反转录后作为模板,设计基因特异性引物,采用Advantage 2 聚合酶混合物进行PCR扩增;依据猪与人FGL2基因3′端已知同源序列设计PCR上游引物,以人FGL2基因3′末端序列设计下游引物,以猪基因组DNA为模板采用Advantage 2 聚合酶混合物进行PCR反应;PCR载体重组质粒DNA亚克隆扩增。同位素探针未能筛选到特异阳性克隆,RACE反应检测到特异性转录起始位置及第一个转录终止位置,但仍未检测到第二个转录终止位置。猪基因组DNA行PCR扩增成功检测到猪FGL2基因3′末端未知序列及第二个转录终止位置。     

采用单碱基突变模板作为内对照对组织中mRNA水平进行PCR定量

用PCR方法对原始模板进行单碱基突变,在原始模板DNA的特定位点引入一个EcoRI酶切位点。单碱基突变的DNA经PCR扩增后定量、稀释,作为内标加入到样品中与待测DNA同时进行PCR扩增．扩增产物经酶切后电泳,根据电泳结果中不同分子量DNA片段的含量,对样品中待测基因拷贝数进行定量分析。实验结果观察到：每1μg肝脏组织总RNA经逆转录后AVPV1受体cDNA拷贝数约1．25×10－20mol。     

小鼠c-Myc基因的克隆表达及其纯化

目的:克隆小鼠c-Myc基因,构建原核表达载体并对其进行蛋白表达及纯化。方法:以TetO-FUW-OSKM质粒为模板经PCR扩增c-Myc基因,再通过基因重组技术与pET-3C载体相连转化大肠杆菌DH5α。经抗性筛选,PCR鉴定阳性重组子,测序正确后,重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE对重组蛋白进行鉴定分析。结果:DNA电泳结果证实PCR扩增产物与预期大小一致,DNA测序结果显示与GenBank公布的c-Myc基因序列一致,IPTG诱导SDS-PAGE电泳后,在分子量64kDa左右出现诱导后蛋白新增条带,与预测的c-Myc分子量大小一致。结论:成功地构建了pET3C-Myc原核表达载体,表达并纯化出了c-Myc蛋白,为今后研究c-Myc蛋白及相关蛋白诱导体细胞成多能干细胞打下基础。     

有效提取病毒诱导基因沉默植株中DNA的方法

根据PCR反应的要求,用改良的CTAB法,以番茄植株为材料,实现了微量番茄叶片基因组DNA的快速提取。提取基因组DNA所用的组织量少,所得的DNA经过电泳检测虽有降解,但足以用于PCR检测,以其作模板扩增中国番茄黄化曲叶病毒诱导的硫黄素酶（Su）基因沉默植株中病毒组分中的DNAmβ和1.7 A,片段大小分别为1 300、500 bp。测序结果证明是相应基因的部分片段。该方法的材料不需要使用液氮,可以单人大批量提取,并在基因沉默的番茄植株中能稳定而准确的规模化PCR检测。     

小鼠GP73蛋白真核表达质粒的构建及其对mTOR转录水平的影响

目的:构建小鼠高尔基蛋白73(m GP73)的真核表达质粒,转染HEK293T细胞株验证重组质粒活性,并检测m GP73过表达情况下对小鼠肝癌细胞中mTOR m RNA水平的影响。方法:以实验室保存的H22小鼠肝癌细胞c DNA文库为模板,采用PCR技术扩增获得m GP73序列,将其插入pc DNA3.1-Flag-vector载体构建成重组质粒,转染HEK293T细胞后用蛋白免疫印迹检测融合蛋白的表达,并用q PCR检测在GP73过表达情况下H22细胞中mTOR转录水平的变化。结果:菌液PCR、重组质粒的双酶切结果及测序均表明重组质粒构建成功,蛋白免疫印迹表明m GP73蛋白在HEK293T细胞中获得表达,q PCR结果表明在m GP73过表达时mTOR的转录水平随之上升。结论:构建了pc DNA3.1-Flag-m GP73真核表达质粒,m GP73 m RNA过表达时mTOR的m RNA水平也上升,这为进一步研究m GP73在小鼠肝脏肿瘤转移过程中的作用奠定了基础。     

双基因真核表达载体pIRES-BMP2-TGFβ3 的构建与鉴定

目的:构建与鉴定骨形态发生蛋白BMP2和转化生长因子TGFβ3双基因真核表达载体pIRES-BMP2-TGFβ3。方法:首先,用PCR方法从质粒pGEMT/BMP2中扩增出BMP2基因全长,并将其连入双基因真核表达载体pIRES,得到质粒pIRES-BMP2,其次,从人胚胎组织提取总RNA,反转录成cDNA,以反转录的cDNA为模板,PCR扩增出TGFβ3基因全长,将TGFβ3基因连入质粒pIRES-BMP2;用酶切的方法筛选出阳性重组质粒,并进行测序鉴定。结果:酶切鉴定证明已将BMP2和TGFβ3两个基因连入载体中,测序结果完全正确。结论:成功构建PIRES-BMP2/TGFβ3双基因真核表达载体。     

野生大豆种子cDNA文库的构建与分析

为了分离与鉴定野生大豆优良基因,以双高型优质野生大豆的近成熟种子为材料,采用裂解法提取了总RNA;以Oligo（dT）为引物,经SA—PMPS法分离出mRNA,反转录酶催化合成cDNA,并以cDNA第一链为模板在DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成cDNA第二链,双链cDNA经加接头等步骤,成功构建了野生大豆cDNA文库。文库的重组率约为93．7％,PCR检测重组克隆的插入片段平均大于1000bp,测序片断大于500bp,表明构建的近成熟种子cDNA文库质量较高,为进一步进行EST测序和全长克隆打下了基础。     

AM真菌DNA的提取与PCR-DGGE分析

分别从丛枝菌根(AM)真菌的单孢、宿主植物根系及土壤样品中提取DNA,对AM真菌的18SrDNA中NS31/Glol区进行Nested PCR特异性扩增,表明Nested PCR能很好地以微量DNA为模板扩增出目标产物;对扩增产物进行DGGE电泳,3种样品表现出不同的DGGE指纹图谱特征。本文认为,将Nested PCR与DGGE技术相结合,可以成为AM真菌分子生态学研究的有效途径。     

单分子PCR技术及其应用

常规PCR技术大都以大量DNA分子(一般为105个以上)为模板进行DNA扩增。新近发展起来的单分子PCR技术是一种以极少量DNA分子(1、5或10个分子)为模板进行扩增的技术。在高保真度DNA聚合酶作用下,单分子PCR技术能扩增出高度一致的DNA;在低保真度DNA聚合酶作用下,单分子PCR技术又能构建出含有大量突变基因的DNA库。该将介绍单分子PCR的基本原理、实验步骤、特点及其应用。     

大乳头水螅RACE cDNA文库的构建

目的:为筛选和克隆大乳头水螅发育调控相关基因的全长cDNA,构建大乳头水螅RACE cDNA文库.方法:提取大乳头水螅总RNA后从其中分离mRNA,运用SMART技术构建RACE cDNA文库.为鉴定所构建文库的质量,根据GenBank中大乳头水螅actin基因cDNA序列设计5'RACE和3'RACE的引物及用于扩增actin基因编码区全长序列的引物.结果:琼脂糖凝胶电泳结果表明,RACE cDNA文库中全长cDNA的长度集中在500-2 000bp之间.5'RACE、3'RACE PCR及扩增actin基因编码区全长序列时均以本文构建的大乳头水螅RACE cDNA文库为模板,这3个PCR反应均能扩增出产物,产物大小与目标片段预计大小相似.PCR产物分别经T/A克隆及测序后证明为大乳头水螅actin基因cDNA的相应序列.结论:RACE cDNA文库的成功构建为通过RACE方法获得大乳头水螅功能基因cDNA全长序列奠定了基础.     

基于数字PCR的单分子DNA定量技术研究进展

数字PCR是一项针对单分子目标DNA的绝对定量技术．该技术是将含有DNA模板的反应溶液分配到大量独立的反应室中并且发生扩增反应,通过统计反应室中的阳性信号来定量DNA的拷贝数．DNA样品在反应室中随机和独立分布是单分子成功扩增和准确定量DNA拷贝数的关键因素．本文综述了数字PCR的发展历史、数字PCR与实时荧光定量PCR的区别,以及数字PCR在临床诊断、转基因成分定量、单细胞基因表达、环境微生物检测和下一代测序等方面的最新进展,并展望了该技术的应用前景．     

HBV YIDD变异株真核表达载体的构建及鉴定

构建HBV C基因型YIDD拉米夫定耐药株的全基因真核表达载体,为进一步深入探讨乙型肝炎病毒拉米夫定耐药的分子机制,寻求耐药后的有效治疗奠定基础。以重组质粒PMD18T-HBV-C为模板,采用PCR扩增HBV C基因型YIDD变异株的全基因组DNA,并将其定向克隆于真核表达载体PcDNA3.1( )中。获得的真核表达重组质粒PcDNA3.1( )-HBV-C(YIDD)通过酶切后电泳及测序进行鉴定。琼脂糖电泳结果证实PCR产物大小约为3.2 kb,与预期相同。酶切及测序结果证实,HBV C基因型YIDD拉米夫定耐药株全基因真核表达载体PcDNA3.1( )-HBV-C(YIDD)构建成功。     

一种新的线粒体基因组DNA捕获探针的制备及初步应用

目的:建立新的线粒体基因组DNA杂交捕获探针制备方法并用进行初步应用。方法:通过PCR技术扩增特异线粒体DNA片段,并与生物素偶联,最后与标记磁珠的亲和素混合获得捕获探针。并自行制备的线粒体基因组DNA文库捕获探针与肝癌全基因组测序文库进行液相杂交。分离捕获产物后PCR扩增并进行测序分析。结果:成功建立了线粒体基因组杂交捕获探针制备方法并成功分离线粒体基因组DNA;对测序数据的分析显示:90%以上测序数据来自线粒体基因组DNA,且覆盖率达到100%,且均一性良好。检测到的同质性变异位点数量和异质性变异位点数量与全基因组测序数据产生的结果接近(P=0.9152,P=0.8409)。结论:新方法制备的线粒体基因组DNA杂交捕获探针可以从全基因组文库中高效捕获线粒体基因组DNA测序文库。     

ITS作为粒毛盘菌属DNA条形码的探索

以种内与种间差异以及PCR扩增和测序成功率为评价DNA条形码的重要指标,探索ITS序列作为粒毛盘菌属DNA条形码的可行性。结果表明,ITS成功区分了研究涉及的22个种,其PCR扩增和测序成功率为100%,该片段有望成为该属区分物种的DNA条形码。     

Sparc基因的克隆及其在HEK293细胞中的表达

目的：为探讨SPARC（secreted protein acidic and rich in cysteine）在人恶性肿瘤发生、发展中的作用及其分子机制,进一步明确SPARC发挥作用的方式及其与肿瘤发生类型的关系。方法：我们首先提取了人乳腺癌细胞系MCF-7的总RNA,在对总RNA进行纯度与定量检测后,利用RT-PCR的方法,以该总RNA为模板,将其反转录为cDNA;再设计引物,以该cDNA为模板,利用PCR扩增出包含Sparc编码区的DNA片段,将该产物纯化后通过T-A克隆连接入pMD20-T载体,利用菌落PCR及DNA测序进行鉴定。以pMD20-T-Sparc为模板,我们设计了特异的针对Sparc全长编码区的引物,并在引物5＇端分别加入BamHI、HindIII酶切位点,通过PCR将Sparc编码区扩增出来,经纯化及双酶切后与真核表达载体pcDNA3.1myc-his（-）相连,再经菌落PCR和DNA测序进行鉴定。通过瞬时转染的方法,利用脂质体将所构建的重组SPARC真核表达载体转染HEK293细胞,48h后裂解所培养的细胞,使用western blot检测有无SPARC的表达。结果：测序证实所克隆的Sparc编码区cDNA正确地插入pcDNA3.1myc-his（-）中,western blot检测证实其在HEK293细胞中得到表达,而空载体转染的细胞则无表达,说明所构建的pcDNA3.1myc-his（-）-Sparc能够成功表达。结论：我们成功克隆了人Sparc cDNA,构建了其真核表达载体,并在HEK293细胞中得到有效表达,从而为进一步研究人SPARC的功能及其与肿瘤的关系奠定了基础。