液质连用分析重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂肽图

目的：建立高效液相系统肽图分析法,用于重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂（rExendin-4）的质量控制。方法：应用高效液相系统摸索最佳胰蛋白酶切和色谱条件,并采用液质联用系统分析肽段的精确相对分子量和氨基酸序列。结果：根据酶切条件摸索,确定酶切条件为：rExendin-4原液与胰蛋白酶按照质量比为100：1混匀,37℃酶切4小时,根据肽段的色谱保留时间、相对分子质量及对其碰撞诱导解离质谱的解析结果,归属出肽图中各肽段所在的色谱峰,与理论值完全一致。结论：本法精确度高、重复性好、自动化程度高,能够用于rExendin-4原液肽图分析。     

重组人睫状神经营养因子肽图分析

建立重组人睫状神经营养因子(recombinant human ciliary neurotrophic factor,rhCNTF)的肽图分析方法,用于rh-CNTF的质量控制。胰蛋白酶对rhCNTF进行酶切后,利用RP-HPLC方法对酶切液进行分析,以获得胰蛋白酶切最佳条件及色谱条件,并对连续3批样品进行分析。rhCNTF的胰蛋白酶最佳酶切条件为37℃酶切24h,以A(0.1%TFA-H2O)、B(0.1%TFA-CH3CN)为流动相,采用梯度洗脱的方法对酶切液进行分析,结果连续3批rhCNTF制备产品的肽图完全一致,且其检出峰数目与理论推测值相符。3批产品肽图的一致性为rhCNTF产品的结构同一性提供了有利证据,同时,建立了rhCNTF产品质量控制的一项指标。     

测序级胰蛋白酶的制备工艺与质量检测

目的:制备高纯度、酶解效率高、酶切位点专一的测序级胰蛋白酶,应用于蛋白组学研究的蛋白质鉴定与分析中。方法:取实验室自制的猪胰蛋白酶粗酶,经硼氢化钠、甲醛还原甲基化修饰抑制胰蛋白酶自水解,采用高效液相色谱仪15RPC反相柱纯化,收集对应的甲基化胰蛋白酶峰组分,冷冻干燥;甲基化修饰的胰蛋白酶进一步经甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮(TPCK)修饰,以抑制糜蛋白酶等非特异性酶切活性,并经反相色谱柱再纯化,获得终产物即质谱测序级胰蛋白酶;自制的测序级胰蛋白酶经SDS-PAGE、HPLC反相色谱分析、酶比活力测定,并应用于胶内蛋白质酶切质谱鉴定氨基酸序列等,检测其纯度、酶水解效率及酶切位点特异性。结果:自制甲基化TPCK修饰的测序级胰蛋白酶纯度大于95%,酶比活力为200 U/mgP(TAME)以上,质谱分析酶切特异性好;且酶的制备工艺流程稳定,可应用于测序级胰蛋白酶产品的生产与开发中。结论:制备的测序级胰蛋白酶纯度高、酶解效率优、酶切特异性强,可广泛应用于实验室中蛋白质和肽段测序鉴定、HPLC肽段谱图分析等蛋白组学研究分析中。     

测序级胰蛋白酶的制备工艺与质量检测简

目的：制备高纯度、酶解效率高、酶切位点专一的测序级胰蛋白酶,应用于蛋白组学研究的蛋白质鉴定与分析中。方法：取实验室自制的猪胰蛋白酶粗酶,经硼氢化钠、甲醛还原甲基化修饰抑制胰蛋白酶自水解,采用高效液相色谱仪15RPC反相柱纯化,收集对应的甲基化胰蛋白酶峰组分,冷冻干燥;甲基化修饰的胰蛋白酶进一步经甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮（TPCK）修饰,以抑制糜蛋白酶等非特异性酶切活性,并经反相色谱柱再纯化,获得终产物即质谱测序级胰蛋白酶;自制的测序级胰蛋白酶经SDS-PAGE、HPLC反相色谱分析、酶比活力测定,并应用于胶内蛋白质酶切质谱鉴定氨基酸序列等,检测其纯度、酶水解效率及酶切位点特异性。结果：自制甲基化TPCK修饰的测序级胰蛋白酶纯度大于95％,酶比活力为200U/mgP（TAME）以上,质谱分析酶切特异性好;且酶的制备工艺流程稳定,可应用于测序级胰蛋白酶产品的生产与开发中。结论：制备的测序级胰蛋白酶纯度高、酶解效率优、酶切特异性强,可广泛应用于实验室中蛋白质和肽段测序鉴定、HPLC肽段谱图分析等蛋白组学研究分析中。     

重组单抗药物的肽图分析

建立了重组单抗药物的肽图分析方法。在变性条件下向抗体溶液加入还原剂,打开抗体内部所有交联的二硫键,再加入烷基化试剂封闭所有的自由巯基,使抗体分子在溶液中以游离伸展肽链的形式存在。加入胰蛋白酶,将充分伸展的肽链酶解成小的肽段。用反相高效液相色谱层析分析肽图谱。对连续3批中试产品及理化测定对照品进行肽图分析,各样品均能酶解完全,批间肽图谱一致。该方法实用有效,适于进行重组单抗等结构复杂的大分子蛋白药物的肽图检查分析。     

重组人源性抗HBsAg Fab抗体的肽质量图谱分析

重组人源性抗HBsAg Fab抗体具有较好的特异性和抗原结合活性,为了更好的阐明毕赤 酵母表达的重组人源性抗HBsAg Fab抗体的性质,用基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI- TOF-MS)对重组Fab抗体的分子质量和肽质量图谱进行了分析。结果显示,毕赤酵母表达的重组 人源性抗HBsAg Fab抗体的分子质量为50678．49Da,与根据其一级结构计算的理论分子质量相 比多2763．84 Da,显示酵母表达的重组Fab抗体为糖蛋白。用胰蛋白酶酶解重组Fab抗体后进行 MALDI-TOF-MS分析显示,大部分的酶解肽段均能检测出来。结果表明毕赤酵母表达的重组Fab 抗体与预期的结构一致。     

阳离子交换高效液相色谱检测重组人源化抗CD52单克隆抗体的电荷异质性

目的建立阳离子交换高效液相色谱检测重组人源化抗CD52单克隆抗体(monoclonal antibody,m Ab)电荷异质性的方法,并对其进行验证。方法基于m Ab等电点呈弱碱性,且因为抗体所带电荷的不同导致其与色谱柱结合力的不同,采用"PropacTMWCX-10"弱阳离子交换柱,利用盐梯度洗脱的方法依次洗脱出m Ab的酸性电荷变异体、中性电荷变异体及碱性电荷变异体;对方法的专属性、线性、准确性、精密度和耐用性进行验证。结果阳离子交换高效液相色谱分析重组人源化抗CD52 m Ab各电荷变异体的保留时间在14~21 min之间,其中酸性电荷变异体的保留时间在14~17 min,中性电荷变异体的保留时间在17~18 min,碱性电荷变异体的保留时间在18~21 min之间。专属性验证显示空白辅料对照色谱图在样品出峰位置无干扰。线性验证显示酸性电荷变异体、中性电荷变异体和碱性电荷变异体相关系数R2均0.99。准确性验证显示酸性电荷变异体、中性电荷变异体和碱性电荷变异体回收率分别为99.3%~99.9%、99.8%~100.4%和99.3%~99.7%。仪器重复性、样品重复性和中间精密度验证中,各电荷变异体的RSD均5%。耐用性验证中,流动相p H在8.0±0.1、流动相中盐浓度为100 mmol/L±5 mmol/L、柱温在(30±2)℃变化时各电荷变异体的RSD均5%。结论阳离子交换高效液相色谱可以有效分离重组人源化抗CD52 m Ab的酸性电荷变异体、中性电荷变异体和碱性电荷变异体,且该方法具有良好的专属性、线性、准确性、精密度和耐用性。     

抗CD52单克隆抗体ADCC转基因测活方法的建立

目的 建立转基因细胞法测定抗CD52单克隆抗体(单抗)的抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity,ADCC)生物学活性检测方法。方法 ①以Ramos细胞系作为靶细胞,以Jurkat-hFcγRⅢa/FcεRIγ-NFAT转基因细胞系作为效应细胞,通过荧光素酶检测系统(Bright-GloTM luciferase Assay System)建立抗CD52单抗的ADCC生物学活性检测方法;②对靶细胞、量效范围、效靶比及诱导时间进行优化并进行方法学验证;③研究建立的方法应用于对不同抗CD52单抗的ADCC生物学活性检测。结果 建立抗CD52单抗的ADCC生物学活性检测方法,抗CD52单抗在该方法中存在量效关系,符合四参数方程:y=(A-D)/[1+(x/C)B]+D;经优化后确定抗体量效范围为起始质量浓度360μg/mL,4倍系列稀释9个稀释度;效靶比为3∶1,诱导时间为6.0h;该方法具有良好的专属性;4个不同稀释组回收率样品经3次测定,相对效价分别为(45.58±4.67)%、(71.61±9.45)%、(122.92±7.92)%和(149.94±14.58)%;对应的回收率分别为(91.16±9.34)%、(95.49±12.60)%、(98.34±6.34)%和(99.96±9.72)%,上述结果的变异系数(coefficientofvariation,CV)均小于15%;且该方法也适用于不同抗CD52单抗的ADCC效应评价。结论 利用转基因细胞法成功建立了抗CD52单抗ADCC生物学活性检测方法,该方法专属性强、准确性高、重复性好,可用于评价抗CD52单抗的ADCC生物学活性。     

抗CD52单克隆抗体中残留蛋白AELISA定量检测方法的验证

目的验证抗CD52单克隆抗体(单抗)中残留蛋白A(Protein A,Pro A)ELISA定量检测方法。方法使用Cygnus公司的Mix-N-Go Protein A检测试剂盒,对抗CD52单抗中的Pro A残留量进行检测,并验证该方法的专属性、准确度、精密度、线性及定量限。结果亲和填料(Mab Select SuRe)稀释1 000倍后仍检测到含有Pro A 1.9 ng/m L;制剂及抗CD52单抗细胞发酵液中未检出Pro A;3种不同Pro A加标质量浓度6次试验的加标回收率均在80%~120%之间;3种不同Pro A加标质量浓度重复性检测结果及中间精密度检测结果 RSD均<20%;分别对3次Pro A残余检测结果绘制的四参数标准曲线,R2均>0.990;定量限为0.16 ng/m L。结论经验证,抗CD52单抗中Pro A残留量的ELISA定量检测方法专属性好,准确度、精密度高且线性良好。     

甘精胰岛素肽图分析方法研究

目的:探索并确定甘精胰岛素的最佳酶解条件,建立酶解更完全、特异性更强的甘精胰岛素肽图分析方法。方法:采用0.4 mol/L Tris-HCl(pH9.0)溶液作为酶解缓冲液,V8蛋白酶与甘精胰岛素之比为1 U∶10μg,于37℃反应1 h后加入磷酸终止反应,采用RP-HPLC分离目标肽段,采用液相色谱-质谱联用(LC-MS)方法鉴定酶解产生的肽段。结果:甘精胰岛素基本完全酶解,未消化的主成分较《欧洲药典》9.5版(EP9.5)方法大幅减少,时间缩短了1/2,酶解的完全性与有效性大幅提高。产生的4个目标肽段可通过RP-HPLC清晰呈现并有效分离,肽段Ⅱ和Ⅲ的分离度大于25.0,拖尾因子均小于1.5,且各肽段与对照品的相对保留时间在1.00±0.01范围内。4个目标肽段和2个非特异肽段均由质谱鉴定出。较好地克服了现行EP9.5甘精胰岛素分析方法酶解反应的完全性较差、非特异酶解肽段含量较高、理论目标肽段Ⅳ及Ⅰ含量过低等不利于表征目标肽段并确证其氨基酸序列正确性的缺陷。选取B32脱精氨酸甘精胰岛素评价方法的专属性,证实本方法专属性良好;6次重复测定各肽段的保留时间及峰面积的RSD为0.05%～0.20%,考察不同实验人员在不同时间处理样品得到结果的变异程度,RSD为0.01%～0.36%,表明方法的中间精密度较好。V8酶量为15～25 U、柱温为38～42℃、采用3个不同厂家的色谱柱时测定的相对保留时间的RSD为0.12%～0.26%,表明方法的耐用性较好。酶解后的样品于6℃存放24 h及-20℃储存7 d,稳定性较好。结论:实现了甘精胰岛素主成分的高效特异酶解及目标肽段的有效分离,该方法专属性、重复性、中间精密度及耐用性均表现良好,可用于甘精胰岛素的结构确证及专属性鉴别。     

重组人源化抗CD52单克隆抗体N-糖糖型的分析方法的验证

目的 对重组人源化抗CD52单克隆抗体N-糖糖型的分析方法亲水相互作用液相色谱法进行方法学验证,并根据多批次产品的检测结果制定质量标准。方法 参考《中华人民共和国药典》2020版(三部)通则9101中相关要求及重组人源化抗CD52单克隆抗体的制造与检定规程,对单克隆抗体N-糖糖型的分析方法进行方法学验证,验证项目包括专属性、线性、准确度、精密度、范围和耐用性。对多批次重组人源化抗CD52单克隆抗体产品(≥15批)的N-糖糖型的检测结果进行分析,计算非岩藻糖及半乳糖的相对含量,确定质量标准。结果 空白对照、阴性对照对重组人源化抗CD52单克隆抗体N-糖糖型的分析无干扰;在60～300μg的抗体含量范围内线性良好,r²≥0.99;高、中、低3种抗体含量的回收率均在96%～106%;仪器进样重复性、样品制备重复性及中间精密度均良好,峰面积百分比及保留时间的RSD均≤5%;耐用性考察时各条件下的峰面积百分比及保留时间的RSD均≤5%。对多批次重组人源化抗CD52单克隆抗体的检定结果进行统计分析,确定N-糖糖型分析的质量标准为非岩藻糖相对含量4%～20%,半乳糖相对含量≥2...     

基于马尔科夫链的胰蛋白酶肽段蛋白酶切位点概率预测

在基于质谱技术的蛋白质鉴定过程中,数据库搜索是主要的方法。漏切位点和酶切规则决定了图谱候选肽段的范围,是数据库搜索算法的重要参数。对于常用的胰蛋白酶切来说,除了局部构象、三维结构、实验条件,以及其它偶然因素会影响赖氨酸K或者精氨酸R后的位点能否被酶切外,该位点附近的其它氨基酸也会影响蛋白水解酶的酶切效果。从质谱图谱中时常会鉴定出包含漏切位点的肽段,因此,预测蛋白质的酶切位点能够为数据库搜索算法提供更为可靠的模型,也能够为了解和分析蛋白质的酶切规律提供依据。本文提出了一种基于马尔科夫(Markov)链的预测方法,能够利用蛋白质的序列信息来预测候选酶切位点的酶切概率,在蛋白酶切过程中,预测肽段的覆盖率可以达到85%以上。     

胶原蛋白降解物高效液相色谱/质谱联用分析

利用高效液相色谱／质谱联用技术分析了胶原蛋白Ⅱ和Ⅰ经变性和酶解处理得到的多肽混合物,比较研究了两种类型胶原蛋白降解物之间的区别,利用液相色谱质谱连用技术识别出了不同类型胶原蛋白中的特征肽段。胶原蛋白在50℃处理3h可溶解于盐溶液,凝胶过滤分析结果表明,热变性的胶原蛋白分子量在10万以上,因此在热变性过程中胶原蛋白的三螺旋结构被破坏但没有明显的随机降解。利用胰蛋白酶对胶原蛋白进行了酶切处理,在酶用量为2％,pH 8.1~8.2,温度37℃条件下,处理20h后胶原蛋白降解较完全,多肽混合物的平均分子量在1万以下。利用液质联用技术研究Ⅱ型和Ⅰ型胶原蛋白降解物中的多肽,通过多级质谱分析了胶原蛋白降解物多肽的序列。结果表明,不同类型的胶原蛋白酶解后的多肽混合物中存在特定序列的特征肽段,利用特征肽段进行胶原蛋白类型识别是可行的。     

花蚬酶解物清除羟自由基作用研究

探讨了不同蛋白酶酶解花蚬蛋白所得酶解物对Fenton体系产生的羟自由基(.OH)的清除效果,然后进行Sephadex G-25凝胶柱分离酶解产物中的抗氧化活性肽,并测定活性肽相对分子质量分布。结果表明:木瓜蛋白酶在50℃、酶解30 min、pH=7.5、酶质量分数0.15%、m(底物)∶m(水)=1∶2的水解条件下,酶解物对羟自由基的清除效果最佳,清除率为86.9%;胰蛋白酶在温度55℃、酶解时间85 min、pH=8.0、酶质量分数0.30%、m(底物)∶m(水)=1∶2的水解条件下,酶解物对羟自由基清除效果最佳,清除率为89.5%。木瓜蛋白酶酶解物在最大洗脱峰时,清除率为84.73%,在最大峰处酶解物中活性肽的相对分子质量为5.68×103;胰蛋白酶酶解物有两个洗脱峰,在最大洗脱峰处分离组分对羟自由基的清除率很低,在较小洗脱峰处,其清除率为88.49%,该峰处活性肽的相对分子质量为1.165×104。     

重组双功能水蛭素质量标准研究

以生色底物法测定抗凝血酶活性,比浊法测定抗血小板聚集活性,还原型SDS-PAGE测定分子量,SDS-PAGE和反相高效液相色谱测定纯度,毛细管电泳法测定等电点,胰蛋白酶酶切后进行肽图分析,其余检测项目按《中国药典》2005版三部规定进行。结果显示,用建立的方法对原液和成品进行了检定,各项指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和《中国药典》2005版三部的要求。建立的质控方法和质量标准具有保证产品安全、有效、质量可控的特点,可用于重组双功能水蛭素产品的常规检定。     

利用N糖苷酶F对单克隆抗体N糖酶解条件的优化

为了优化利用N糖苷酶F（PNGase F）酶解单克隆抗体中N糖的方法，应用本公司生产的单抗对PNGase F酶的酶解条件进行优化，包括缓冲液pH、酶种类、仪器、酶解程度、变性缓冲液及酶加入量等，总结酶解条件对N糖谱结果的影响。结果显示，置换缓冲液至1×PBS中可以避免某些单抗在低pH酶解时G0F转化为G0F-GN并可改善峰型；快速PNGase F和加入变性缓冲液能有效提高酶解效率；UPLC和1.7 μm粒径色谱柱能提高分离度；不完全酶解影响N糖含量结果。研究结果表明，采用优化的酶解条件可快速、有效的酶解单抗上的N糖，使N糖谱结果准确可靠，为细胞株筛选和单抗药物质量控制提供有效手段。     

应用CE-SDS测定抗CD52人源化单克隆抗体参比品单体纯度及非糖化重链比例

目的:测定抗CD52人源单克隆抗体参比品单体纯度及非糖基化重链比例。方法:采用PA800 plus毛细管电泳系统,非还原十二烷基苯硫酸钠-毛细管电泳(CE-SDS)测定抗CD52人源单克隆抗体单体纯度,以及用还原CE-SDS电泳测定非糖化重链比例。结果:非还原CE-SDS三次测定单体纯度平均值为93.57%,主峰的迁移时间及修正峰面积百分比RSD分别为0.16%和0.19%;还原CE-SDS电泳重链修正峰面积百分比平均值为66.89%,修正峰面积百分比及迁移时间RSD分别为0.09%和0%;轻链修正峰面积百分比平均值为32.30%;轻链修正峰面积及迁移时间RSD分别为0%和0%;非糖基化重链修正峰面积百分比平均值为0.87%,修正峰面积百分比及迁移时间RSD分别为6.66%和0.27%。结论:CE-SDS测定抗CD52人源单抗单体纯度及非糖化重链比例实验结果偏差较小,表明结果准确可靠。     

阿胶多肽的高分辨质谱鉴定及活性研究

建立了液相色谱-高分辨质谱分析阿胶中功能肽的方法,并进行了体外活性验证研究。阿胶经炖化、胰蛋白酶酶解,C_(18) SPE柱净化,以UPLC-Q-Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用仪检测,MaxQuant软件分析质谱结果,所得肽段在UniProt上进行BLAST序列对比鉴定。结果表明,3次重复分析得到的63条共有肽中,具有明确蛋白及种属来源的肽19条。根据多肽活性构效关系,选择9条可能具有活性的阿胶多肽进行抗氧化活性、抗凝血活性测定,结果显示9条多肽均具有不同程度的抗氧化活性,其中5条具有抗凝血活性。本文所建立的方法快速有效,为揭示阿胶多肽结构与活性的关系提供技术支持。     

固相化学辅助MALDI-TOF质谱源后衰变技术对2D-胶银染蛋白质点的鉴定

利用O 甲基异脲氢硫酸 (O methylisoureahydrogensulfate)修饰 2D 胶上胰蛋白酶原位酶切后产生的Lys 肽 ,使其具有Arg 肽的特性 ,提高质谱测定的灵敏度 ,然后用化学试剂 3 磺酸丙酸N 羟基琥珀酰胺酯 ( 3 sulfopropionicacidNHS ester)修饰Lys 肽及Arg 肽 ,修饰的产物在进行PSD测序时能得到单一的y 离子系列 ,有利于蛋白质酶解片段序列的从头解析 ,为 2D 胶上蛋白质点的准确鉴定提供有力的依据 ;该方法应用于鼻咽癌细胞 2D胶银染蛋白质点的鉴定取得可靠结果     

抗CD47胞外区骆驼多克隆抗体的制备及鉴定

验证人CD47蛋白能否在新疆双峰驼中产生高滴度抗体;为制备高亲和力的抗CD47纳米抗体提供实验依据。构建CD47胞外区原核表达载体,诱导表达及纯化CD47蛋白,免疫新疆双峰驼。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot分别检测骆驼多克隆抗体的效价及与CD47蛋白特异性结合活性。结果显示,成功构建CD47胞外区原核表达载体,获得纯度大于90%的CD47蛋白,表达纯化的CD47重组蛋白可与抗CD47单抗B6H12.2特异结合;ELISA测定CD47重组蛋白免疫骆驼7次后,抗CD47多克隆抗血清的效价至少达到1∶200 000,免疫印迹检测表明抗CD47骆驼抗血清与CD47重组蛋白、Jurkat和Raji细胞表面表达的CD47均能特异结合。重组人CD47蛋白可以在骆驼体内激发高滴度抗体反应。