蔗糖浓度对三裂叶野葛毛状根生长及其次生物质产生的影响

本文研究了蔗糖浓度对发根农杆菌ATCC15834诱导产生的三裂叶野葛毛状根生长及其葛根素和异黄酮类化合物产生的影响以及液体培养基中蔗糖的消耗变化.结果表明毛状根在含5%、4%、3%和2%蔗糖的MS培养基中培养16天后的干重增殖倍数分别为11.7、11.9、10.1和5.9;其中尤以3%的蔗糖浓度最有利于毛状根中异黄酮类化合物及葛根素的积累;培养12天后,毛状根的葛根素含量达到最高,约5.147mg/g DW;而其异黄酮类化合物的含量则在培养16天后达到最高,约27.76mg/g DW.在毛状根液体培养过程中培养基的蔗糖浓度随着毛状根的生长而降低,其消耗速率与毛状根的生长速度及其可溶性总糖含量成正比.毛状根的可溶性总糖含量在培养12天时达到最高,而培养16天后培养基中的蔗糖消耗完毕.     

蔗糖浓度对三裂叶野葛毛状根生长及其次生物质产生的影响

本文研究了蔗糖浓度对发根农杆菌ATCC15834诱导产生的三裂叶野葛毛状根生长及其葛根素和异黄酮类化合物产生的影响以及液体培养基中蔗糖的消耗变化。结果表明：毛状根在含5％、4％、3％和2％蔗糖的MS培养基中培养16天后的干重增殖倍数分别为11．7、11．9、10．1和5．9;其中尤以3％的蔗糖浓度最有利于毛状根中异黄酮类化合物及葛根素的积累;培养12天后,毛状根的葛根素含量达到最高,约5．147mg／gDW;而其异黄酮类化合物的含量则在培养16天后达到最高,约27．76mg／gDW。在毛状根液体培养过程中培养基的蔗糖浓度随着毛状根的生长而降低,其消耗速率与毛状根的生长速度及其可溶性总糖含量成正比。毛状根的可溶性总糖含量在培养12天时达到最高,而培养16天后培养基中的蔗糖消耗完毕。     

南美蟛蜞菊毛状根诱导及其离体培养

为了探讨利用南美蟛蜞菊毛状根来改良其观赏性状和生产次生物质,研究了南美蟛蜞菊Wedelia trilobata(L.)A.S.Hitche毛状根的诱导及其离体培养过程中培养基N源、碳源、磷和钙的消耗变化。结果表明,发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes ATCC15834感染南美蟛蜞菊幼嫩叶片外植体7d后从其叶片切口中脉处产生毛状根。毛状根能在无外源激素的培养基上自主生长。PCR扩增结果显示发根农杆菌Ri质粒的rol B和rol C基因已在南美蟛蜞菊毛状根基因组中插入、整合并得到表达。毛状根液体培养0~7d内处于生长迟滞期、7~21d为快速生长期、21d后进入生长平台期。在毛状根液体培养过程中培养基的蔗糖、硝态氮、PO43?、Ca2+被逐渐吸收和消耗,培养至7d时,蔗糖被消耗近50%;硝态氮含量只剩下起始硝态氮含量的5.8%;至35d时,蔗糖和硝态氮含量分别约为其起始浓度的3.39%和1.82%。与Ca2+浓度变化不同的是,培养基的无机磷被快速消耗,培养至7d时其浓度约为其起始浓度的1.76%;但培养至35d时培养基中仍残存有占起始浓度约61.3%的Ca2+。该结果为今后利用南美蟛蜞菊毛状根来改良其观赏性状和设计合适的培养基来规模培养生产其次生物质提供了可能性。     

美洲商陆毛状根诱导及其离体培养的影响因素

为了探讨利用美洲商陆毛状根生产其药用成分的可能性,研究了美洲商陆毛状根诱导及其离体培养的影响因素。结果表明,美洲商陆叶片外植体被发根农杆菌ATCC 15834感染约18 d后,从其叶片外植体形态学下端叶脉切口处产生毛状根,其中以预培养1 d,农杆菌感染20 min,共培养4 d时的毛状根诱导率最高,达到70%。PCR扩增和硅胶薄层层析结果显示,发根农杆菌Ri质粒的rol C基因以及冠瘿碱合成酶基因已在美洲商陆毛状根基因组中整合和表达。所获得的美洲商陆毛状根系都能在无外源激素的MS固体培养基上快速自主生长;其中以毛状根根系2的生长速度最快、分生侧根能力最强和根表面的根毛密度最高;毛状根根表面呈紫红色或呈白色。在供试的MS、1/2MS、B5和6,7-V液体培养基中,以无外源激素的MS培养基最适合美洲商陆毛状根根系生长。与无外源激素的MS培养基相比,6,7-V培养基更有利于毛状根中商陆皂苷甲的合成与积累。本文所建立的美洲商陆毛状根诱导及其离体培养的适宜条件为今后利用其毛状根株系的规模培养来生产其药用有效成分商陆皂苷甲奠定了实验和技术基础。     

黄瓜毛状根的诱导及细胞分裂素6-BA对其生长和形态的影响

含农杆碱型Ri质粒pRiA4b的发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)ATCC15834感染黄瓜子叶外植体5d后产生毛状根,毛状根可直接从叶片外植体叶脉处产生。感染10d后,约90%的子叶外植体产生毛状根。毛状根能在无外源生长调节剂的MS固体和液体培养基上自主生长。PCR扩增结果证实,发根农杆菌Ri质粒的rolB和rolC基因已在黄瓜毛状根基因组中整合并得到表达。挑选一无菌黄瓜毛状根系置于含不同浓度6-BA的MS培养基中悬浮培养来探讨细胞分裂素6-BA对黄瓜毛状根生长及其形态变化的影响。结果表明,细胞分裂素6-BA能促进黄瓜毛状根的生长及改变其生长形态。随着培养基中6-BA浓度的升高,黄瓜毛状根变得越来越短而粗,更少分枝。与对照相比,培养基中添加0·1~3·0mg/L6-BA能推迟毛状根最大生长峰的出现,降低其可溶性蛋白含量、SOD和POD酶活性;而黄瓜毛状根的乙烯释放高峰比其最大生长峰和SOD和POD酶活性高峰提前5天,但6-BA处理能降低毛状根的内源乙烯释放量。该结果表明细胞分裂素6-BA可能通过对乙烯生成和释放的调节来影响黄瓜毛状根的生长和形态并延缓毛状根的衰老。     

褐脉少花龙葵毛状根的诱导、培养及其澳洲茄胺的产生

利用发根农杆茵的遗传转化和液体培养技术,研究了褐脉少花龙葵(solanum nigrum L.Var.Dauciforum)毛状根的诱导和离体培养及其澳洲茄胺的产生以及液体培养过程中培养基中N源和钙的消耗变化.结果表明.发根农杆菌ATCC15834感染褐脉少花龙葵叶片外植体5 d后产生毛状根.感染25d后,约90%的叶片外植体产生毛状根.毛状根能在无外源生长调节剂的MS固体和体培养基上自主生长.PCR扩增结果显示发根农杆菌Ri质粒的rilB和rolC基因已在少花龙葵毛状根基因组中整合并得到表达.所产生的毛状根能产生药用次生物质澳洲茄胺,其含量约为非转化植株根的1.3倍,达到582.05μg/g干重.少花龙葵毛状根液体培养0-5 d内处于生长迟滞期、5-15 d为快速生长期、15d后进入生长平台期.培养基的硝态氮和铵态氮在毛状根液体培养过程中被逐渐吸收和消耗,至培养15 d时铵态氮被消耗殆尽.而硝态氮仍剩余44.7%;培养基中钙的浓度在培养过程中虽逐渐降低,但在培养25d时仍未被完全消耗,其浓度约为起始浓度的43.5%.该结果为今后设计合适的培养基来规模培养褐脉少花龙葵毛状根生产药用次生物质澳洲茄胺提供了可能性.     

外植体龄和蔗糖浓度对黄瓜子叶产生毛状根的影响

研究了外植体龄和蔗糖浓度对发根农杆菌 R160 1介导黄瓜子叶产生毛状根的影响。结果表明 :以 10 d龄子叶外植体产生毛状根的能力最强 ,外植体的毛状根诱导率为 88.89% ;2 0 d龄子叶外植体的毛状根诱导率比 10 d龄子叶外植体降低 52 .86% ;30 d龄子叶外植体感染发根农杆菌R160 1后不产生毛状根。感染发根农杆菌 R160 1的黄瓜子叶外植体在不加或加 1%蔗糖的 MS培养基上的毛状根诱导率极低 ,子叶外植体逐渐变黄 ,腐烂 ;而培养基中添加 2 % ,3%或 4 %的蔗糖可显著提高子叶外植体的毛状根诱导率。黄瓜毛状根能在无外源植物激素的 MS液体培养基中自主生长。冠瘿碱的高压纸电泳检测表明毛状根已被 Ri T- DNA转化     

三裂叶野葛毛状根的诱导及其固体培养和液体培养

发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）ATCC15834感染三裂叶野葛(Pueraria phaseoloides)叶片外植体20 d后产生毛状根,毛状根可直接从叶片外植体叶脉处或从叶脉处产生的愈伤组织上产生。感染35d后,约85%的叶片外植体产生毛状根。毛状根能在无外源生长调节剂的 MS固体和液体培养基上自主生长。PCR扩增结果表明,发根农杆菌Ri质粒的rolB和rolC基因已在三裂叶野葛毛状根基因组中整合并得到表达。与固体培养的毛状根相比,在液体培养基中培养的毛状根不仅生长迅速,也不会形成愈伤组织。在无外源生长调节剂的液体MS培养基中培养15d的三裂叶野葛毛状根的鲜重、干重、可溶性总糖含量及细胞内活性氧(ROS)含量分别为固体培养毛状根的1.59倍、1.18倍、5.25倍和1.16倍。     

4种发根农杆菌对朱砂根组培无菌叶片毛状根诱导的影响

以朱砂根(Ardisia crenata Sims)组培无菌叶片为材料,用4种发根农杆菌菌株(A4、ATCC15834、LBA9402和R1601)分别侵染进行毛状根诱导,比较朱砂根叶片毛状根诱导的最适培养基种类、预培养时间、侵染方式、共培养时间以及不同发根农杆菌的致根能力。研究表明:(1)朱砂根无菌叶片毛状根诱导最适培养基为1/2MS培养基,预培养2d、共培养2d,毛状根诱导率最高(31.87%)。(2)最佳侵染方式以剪好的幼叶和活化好的菌液(100mg/L AS)一起在28℃、180r/min黑暗条件下共振荡8~15min。(3)4种发根农杆菌均能诱导朱砂根叶片毛状根产生,但A4、ATCC15834效果最好,其致根能力大小顺序依次为ATCC15834A4LBA9402R1601。(4)PCR分子鉴定表明,发根农杆菌Ri质粒T-DNA已成功整合到宿主细胞核基因组中。     

三裂叶野葛毛状根的培养及其葛根素的产生

发根农杆菌ATCC15834感染三裂叶野葛叶片外植体20天后,从其切口叶脉处产生的愈伤组织上产生毛状根。感染35天后约85%的叶片外植体产生毛状根。毛状根能在无外源生长调节剂的MS固体和液体培养基上自主生长,但在液体培养基中培养的毛状根生长更迅速,也不会形成愈伤组织。毛状根线粒体膜电势的荧光染色结果表明,液体培养的毛状根细胞线粒体的膜电势比固体培养的毛状根高11.8倍。PCR结果证实,发根农杆菌Ri质粒的rolB和rolC基因已在三裂叶野葛毛状根基因组中整合并得到表达。HPLC测定结果表明,三裂叶野葛毛状根中的葛根素含量约为对照根(种子萌发产生的幼苗根)的2.5倍,达1.190 mg/g.dry.wt;并比多年生葛根生药片的葛根素含量高6.7%。     

蔗糖和光对三裂叶野葛毛状根生长及次生物质产生的影响

研究了蔗糖浓度和光对固体培养的三裂叶野葛毛状根生长及其总异黄酮和葛根素产生的影响。结果表明：在供试的分别添加1%、3%、5%、7%和9%蔗糖的MS固体培养基中,3%蔗糖能促进三裂叶野葛毛状根的生长及其异黄酮类化合物和葛根素的积累;培养20d后,其生物量达到0.48g(DW,干重)/瓶,总异黄酮和葛根素含量分别为25.44mg/g(DW)和11.64mg/g(DW)。与添加3%蔗糖的MS培养基培养的三裂叶野葛毛状根相比,含5%蔗糖的培养基培养的毛状根干重增殖倍数提高了7.0％,而含1％、7％和9％蔗糖的培养基培养的毛状根干重增殖倍数分别下降62.4％、42.8％和65.3％;其总异黄酮含量分别降低574％、13％和33.4％,葛根素含量分别下降47.9％、15.8％和35.1％,但其毛状根培养物的可溶性糖含量则分别增加了0.52、1.45和1.54倍。暗培养30d的毛状根的生物量达到0.83g(DW)/瓶,分别比蓝光和白光培养的毛状根提高37.1%和23.3%。在蓝光和白光下培养的部分毛状根的表面呈淡绿色;但白光处理的毛状根中总异黄酮含量比蓝光和暗培养处理的分别提高了14.7%和19.2%;蓝光抑制毛状根中葛根素含量的积累,白光和暗培养的毛状根培养物中的葛根素含量分别是蓝光处理的1.61倍和1.52倍。     

新疆紫草毛状根的诱导及培养

将处于对数生长期(A600为0.5)的发根农杆菌MSU440、A4、R1000、15834、1025和R1601与新疆紫草子叶外植体共培养.结果表明:(1)发根农杆菌不同菌种对转化率有显著影响,供试6个菌种中只有MSU440菌株获得转化株.PCR及序列分析表明发根农杆菌Ri质粒的rolC基因已在新疆紫草毛状根基因组中整合并得到表达,转化率达4.5%.(2)子叶较真叶的不定根发生率高,且生根持续时间长.(3)在B5无铵无激素固体培养基上,毛状根分支多且根较长,达2~3 cm,毛状根鲜重月平均增殖达7~9倍,是固体培养毛状根的适宜培养基.(4)毛状根在MS无铵无激素液体培养基中培养12 d时,毛状根鲜重平均增殖达12倍,MS无铵液体培养基有利于毛状根的扩大生产.首次获得了激素自主、快速伸长生长、多分支、多根毛的新疆紫草毛状根株系,初步建立了新疆紫草毛状根诱导体系,为大规模培养、生产紫草素奠定了基础.     

三裂叶野葛毛状根的培养及其葛根素的产生

发根农杆菌ATCC15834感染三裂叶野葛叶片外植体20天后,从其切口叶脉处产生的愈伤组织上产生毛状根。感染35天后约85％的叶片外植体产生毛状根。毛状根能在无外源生长调节剂的MS固体和液体培养基上自主生长,但在液体培养基中培养的毛状根生长更迅速,也不会形成愈伤组织。毛状根线粒体膜电势的荧光染色结果表明,液体培养的毛状根细胞线粒体的膜电势比固体培养的毛状根高11．8倍。PCR结果证实,发根农杆菌Ri质粒的rolB和rolC基因已在三裂叶野葛毛状根基因组中整合并得到表达。HPLC测定结果表明,三裂叶野葛毛状根中的葛根素含量约为对照根(种子萌发产生的幼苗根)的2．5倍,达1．190mg/g．dry．wt;并比多年生葛根生药片的葛根素含量高6．7％。     

香石竹毛状根诱导、离体培养及其植株再生

为了探讨利用发根农杆菌遗传转化所产生的毛状根来创新香石竹种质的可能性,本文采用叶盘法,建立了发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes对香石竹Dianthus caryophyllus L.叶片外植体的遗传转化及其植株再生体系。结果表明,发根农杆菌ATCC15834感染香石竹幼嫩叶片外植体12 d后,从叶片外植体切口中脉处产生白色毛状根,21 d后约90%的叶片外植体产生毛状根。所获得的无菌毛状根能在无外源激素的MS固体和液体培养基中快速自主生长。PCR扩增和硅胶薄层层析结果显示发根农杆菌Ri质粒的rol B和rol C基因以及冠瘿碱合成酶基因已在香石竹毛状根基因组中整合并得到表达。将毛状根置于MS+6-BA 1.0-3.0 mg/L+NAA 0.1-0.2 mg/L中培养15 d后产生淡黄绿色的疏松愈伤组织。愈伤组织不定芽分化的最适培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.02 mg/L,培养6周后不定芽分化率为100%;平均每个愈伤组织产生30-40个不定芽;将不定芽转至1/2 MS或1/2 MS+0.5 mg/L NAA的培养基中10 d后产生不定根,发育成再生植株。再生植株移植于栽培基质中20 d后,成活率达95%以上。     

烟草毛状根多倍体诱导及其植株再生

为了提高烟草的烟碱含量,采用发根农杆菌遗传转化和人工染色体加倍技术,进行了烟草毛状根及其多倍体诱导、植株再生及其烟碱含量测定。结果表明,发根农杆菌ATCC15834感染烟草叶片外植体8 d后产生白色毛状根,15 d后所有叶片外植体产生毛状根。毛状根能在无外源激素的MS固体和液体培养基上自主生长。PCR扩增结果显示发根农杆菌Ri质粒的rol B和rol C基因以及冠瘿碱合成酶基因已在烟草毛状根基因组中整合并得到表达。烟草毛状根多倍体诱导的最适条件为0.1%的秋水仙素溶液处理36 h,其多倍体诱导率为64.71%。经秋水仙素加倍的烟草毛状根多倍体植株再生的最适宜培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA0.2 mg/L。与对照(二倍体非转化植株)相比,烟草二倍体毛状根再生植株的顶端优势减弱,腋芽增多,叶片变窄;而烟草毛状根多倍体再生植株茎更粗,节间变短,叶色更深,叶片的宽度和厚度均较对照明显增大。根尖细胞染色体压片观察证实,所获得的烟草毛状根多倍体再生植株为四倍体,其根尖细胞染色体数约为4n=96。盆栽实验表明,烟草二倍体毛状根植株和多倍体毛状根再生植株比对照植株延迟约21 d开花。GC-MS检测表明,烟草毛状根多倍体再生植株的烟碱含量比对照及二倍体毛状根再生植株显著提高,分别约为对照及二倍体毛状根再生植株的6.90倍和4.57倍。     

培养条件对新疆紫草毛状根生长及紫草素含量的影响

以发根农杆菌诱导的新疆紫草毛状根为试验材料,采用二阶段液体培养法,首次建立了新疆紫草毛状根培养技术体系。结果显示:采用SH无铵培养基、pH 5.8时有利于毛状根的生长。培养12d时毛状根的增殖倍数达最高,平均10.26倍;毛状根生产的继代周期为25～30d;4种树脂吸附的紫草素及其衍生物含量均较对照(不添加树脂)高,以NKA-9所吸附的紫草素及其衍生物含量最高,为2.38%,较对照提高0.97倍。培养10d时添加NKA-9树脂,紫草素及其衍生物含量平均为3.64%,是对照的3.08倍。研究表明,生长阶段采用液体培养可以使新疆紫草毛状根快速增殖,生产阶段添加大孔吸附树脂能够提高紫草素及其衍生物含量。     

五寸石竹毛状根诱导及其植株再生

建立了五寸石竹(Dianthus chinensis)毛状根诱导及其植株再生体系。用含野生农杆碱型Ri质粒的发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)15834感染五寸石竹叶片外植体10天后,从其形态学下端产生白色不定根;30天后,叶片外植体的生根率为95%;所产生的毛状根能在无外源生长调节剂的固体和液体MS培养基上快速自主生长。遗传转化鉴定结果表明,发根农杆菌Ri质粒的生根基因(rol)已在毛状根基因组中整合并表达。五寸石竹毛状根的根段在成分为MS+2.0 mg·L~(–1)6-BA+0.2 mg·L~(–1) NAA的培养基中培养15天后产生浅绿色疏松愈伤组织;将愈伤组织转入成分为MS+1.0 mg·L~(–1) 6-BA+0.02 mg·L~(–1) NAA的培养基中培养30天后逐渐形成不定芽。盆栽的五寸石竹毛状根再生植株与非转化植株(对照)相比节间缩短,开花期提前18天。     

发根农杆菌转化大豆的研究

本文利用发根农杆菌感染大豆不同外植体,在成熟胚靠近子叶节部位诱导产生毛状根。经冠瘿碱检测表明,毛状根及由此产生的愈伤组织均有甘露碱存在,说明Ri质粒的T-DNA已整合到大豆的转化根及愈伤组织中。转化根再生实验表明,在含NAA和IAA8mg/L的MS培养基上得到不定根的分化,MS和B_3培养基及6％蔗糖对转化丛生芽的诱导有利。转化的丛生芽在MS基本培养基上进一步长成小植株。     

新疆雪莲毛状根的诱导及其植株再生体系的建立

利用发根农杆菌R1601、R1000、LBA9402感染新疆雪莲的叶片、叶柄和根段外植体,诱导产生毛状根。毛状根接种量为2.8 g/L(FW)时,20d生长量可达66.7 g/L,黄酮含量达到干重的10.23%。冠瘿碱的检测和rolB基因的PCR分析表明,Ri质粒中的T_DNA片段已经整合到毛状根细胞的基因组中。预培养时间、外植体类型以及发根农杆菌的菌株属性对毛状根诱导有着重要的影响。其中预培养2 d的新疆雪莲根段外植体,经过R1601感染后,毛状根的诱导率可达100%。诱导产生的毛状根在附加生长素的液体培养基中,有少量愈伤组织产生。由毛状根再生的植株与雪莲外植体再生的植株在形态上无明显区别,但前者的黄酮含量仅为后者的53%。     

冬凌草离体培养体系的建立及主要次生代谢产物的测定

以冬凌草叶片为外植体,研究不同浓度激素组合对冬凌草愈伤组织诱导及植株再生的影响,并对不同外植体(茎、叶)诱导愈伤、芽的分化能力及再生植株内主要次生代谢产物的含量进行了比较研究。结果表明:在MS 2.0 mg/L 6-BA 1.0 mg/L NAA培养基上诱导愈伤组织效果较好;在MS 2.0 mg/L 6-BA的培养基上诱导芽的效果较好;叶片和茎段在愈伤诱导培养基上均能产生大量的愈伤组织,但其再分化能力以茎段最好;再生苗生根培养基以0.3 mg/L IBA最好;以叶为外植体诱导的再生植株中冬凌草甲素、迷迭香酸的含量均高于以茎为外植体诱导的再生植株。