牛病毒性腹泻病毒E2抗原表位表达及验证

[目的]获得高效表达的重组牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhoea virus,BVDV)E2免疫抗原蛋白。[方法]应用软件分析BVDV-E2蛋白抗原表位,将富含抗原表位基因片段连接表达载体p GEX-4T-1,并转化至大肠杆菌(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western Blot检测诱导表达蛋白,经镍柱分离纯化;以纯化蛋白为包被抗原,用间接ELISA检测抗原对免疫血清的反应性。[结果]成功克隆BVDV-E2抗原表位基因,并在大肠杆菌中高效表达,Western Blot和ELISA证实表达重组蛋白对BVDV阳性血清具有反应原性。[结论]获得大小为49.5 k Da的BVDV-E2抗原表位蛋白,并且该抗原稀释度在1:40,抗体稀释度在1:20时结合效果最佳。可用于后续的纳米抗体筛选的研究。     

犬瘟热病毒N基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达及应用

目的:为检测犬瘟热抗体提供诊断抗原,应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)N蛋白。方法:采用RT-PCR克隆CDV-N基因,构建重组杆粒BacmidCDV-N,并将其转染Sf9昆虫细胞。通过Western blot和间接免疫荧光检测N蛋白的表达。以表达的CDV N蛋白为包被抗原,建立了检测犬瘟热抗体的间接ELISA方法。结果:成功表达了CDV N蛋白。间接ELISA(iELISA)方法中,犬血清最佳稀释度1∶80,N蛋白稀释度1∶40(6.3μg/100μl)。应用该方法共检测了36份犬血清,与中和试验检测方法相比较,其特异性为81.8%,灵敏度为96.0%,符合率为91.7%。结论:表达的CDV-N蛋白具有良好反应原性,建立了快速检测CDV阳性血清的iELISA方法。     

狂犬病病毒N蛋白主要抗原区的表达及SPA-ELISA抗体检测方法的建立

为有效监测免疫狂犬病疫苗后的抗体水平,以狂犬病病毒N蛋白的主要抗原表位所在区域N1蛋白为包被抗原,建立了SPA-ELISA抗体检测方法。用RT-PCR方法分别扩增出狂犬病病毒Flury LEP株N基因及其N1区域 (1 000~1 353 bp),将二者分别克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中,并将重组的表达载体分别转化至大肠杆菌BL21(DE3) 中,经1 mmol/L IPTG诱导后进行免疫印迹分析。结果表明,重组的RV N和RV N1均以包涵体形式表达。与表达全长RV N相比,RV N1的表达量显著高于前者,且该重组蛋白同样具有良好的反应原性。用纯化的重组RV N1作为诊断抗原建立了检测犬RV抗体的间接ELISA方法。通过优化反应条件,确定抗原最佳包被量是2 mg/L,血清的最佳稀释度为1∶100,Protein A-HRP的稀释度为1∶4 000。用建立的ELISA方法对102份临床血清样品进行检测,与商品化试剂盒相比,二者的符合率为94.1％。试验结果表明基于主要抗原表位所在区域N1蛋白的SPA-ELISA方法可有效用于犬RV抗体水平的检测,为检测RV免疫抗体的ELISA试剂盒的研制奠定了基础。     

猪细小病毒NS1抗原表位的真核表达及ELISA方法的建立

以猪细小病毒NS1抗原表位的真核表达及ELISA建立为目的,以猪细小病毒基因组DNA为模板,扩增获得PPVNS1主要抗原表位基因,将其插入到真核表达载体pPICZα-A中,获得重组质粒pPICZα-A-NS1。电转化后将重组毕赤酵母菌株诱导表达,SDS-PAGE检测证实重组蛋白获得了高效表达,Western blot实验表明表达产物具有良好的反应原性。将纯化后的重组蛋白包被酶标板,经棋盘法优化,初步建立了检测猪细小病毒特异性抗体的间接ELISA方法。结果表明,抗原最佳包被浓度为1.9μg/mL,血清最佳稀释度为1∶80,阳性判断标准定为OD待检血清>0.4且OD待检血清/OD标准阴性值>2.0。用该方法对猪血清样品进行检测,结果显示本方法与HI试验的符合率达91.2%,与国外同类试剂盒的符合率为92.1%,该间接ELISA方法特异性强、敏感性高,可用于猪细小病毒病感染抗体的检测。     

猪瘟病毒E2蛋白主要抗原域的高效表达及间接ELISA方法的初步建立

重组质粒pET-2e转化宿主菌BL21(DE3),以IPTG进行诱导表达,比较不同诱导条件下目的蛋白的表达量,确定其最佳表达条件,使外源基因获得了较高水平的表达,可达茵体蛋白总量的36．6％。Western-blot检测表明表达产物具有良好的免疫反应原性。将收集的纯培养物进行超声波裂解后以镍亲和层析柱纯化回收目的蛋白,再以纯化后的目的蛋白作为包被抗原进行方阵滴定试验,确定了目的蛋白作为包被抗原的最佳稀释度,初步建立了检测CSF血清抗体水平的间接ELISA方法。以此方法建立的间接ELISA方法对收集的约120头份血清样品进行检测,结果显示：使用囊素与疫苗共同免疫猪的血清抗体水平明显高于未加囊素组猪的血清抗体水平,与以往的报道一致,为以CSFV重组蛋白作为抗原建立的间接ELISA方法的标准化奠定基础。     

检测牛冠状病毒抗体间接ELISA方法的建立与应用

[背景]牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCoV)是引起新生犊牛死亡的主要病原之一,有效的检测手段是防治该病的前提。目前BCoV ELISA检测方法存在敏感性低、不稳定等缺陷。[目的]对原有BCoV ELISA方法进行改进,建立间接ELISA检测方法。[方法]应用我国BCoV流行毒株CD株n基因为模板,预测N蛋白抗原表位,通过原核表达制备可溶性的重组N蛋白作为抗原,建立间接ELISA方法,应用该方法对黑龙江省2010-2017年的BCoV感染进行血清流行病学调查。[结果]该ELISA方法最佳工作条件为:用50 mmol/LpH 9.6碳酸盐作为包被液,抗原包被浓度2.5μg/mL;用PBST作为样本稀释液,稀释浓度1:50,37℃孵育1.5 h;HRP-羊抗牛IgG稀释浓度1:7 500,37℃孵育1.0 h;用1%明胶37℃封闭30 min。阴阳性临界值为0.225。该方法与BRV、BRSV、BVDV、IBRV、BPIV3和E.coli阳性血清均无交叉反应。批内和批间变异系数均小于10%,与病毒中和试验的符合率高达93.5%。对黑龙江省部分地区共603份奶牛血清样品检测结果显示,BCoV抗体阳性率为98.84%。[结论]建立的ELISA方法特异性强、敏感性高、稳定性好,为进一步研发ELISA试剂盒提供了技术基础。     

家兔支气管败血波氏杆菌重组百日咳杆菌粘附素（PRN）蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立

目的表达支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica,Bb）PRN蛋白,并以此建立检测Bb抗体的间接ELISA方法。方法参照GenBank公布的猪源支气管败血波氏杆菌prn基因序列（AY376325）设计了一对特异性引物,PCR扩增出相应的核苷酸片段。将PCR扩增产物连接至原核表达载体pGEX-4T-1中,以E.coli BL21（DE3）为表达菌株进行诱导表达,以纯化重组蛋白PRN作为诊断抗原,通过探索最佳抗原包被量和抗体血清稀释倍数等,建立检测支气管败血波氏杆菌抗体的间接ELISA方法。结果成功克隆了prn全基因序列,并在E.coliBL21（DE3）中获得高效表达,经SDS-PAGE、Western blot分析显示重组蛋白PRN具有良好的抗原性。应用重组蛋白PRN为抗原建立了检测Bb血清抗体的间接ELISA诊断方法。试验确定重组蛋白PRN抗原的包被浓度为500ng/mL,最适血清稀释度为1∶40。结论建立的ELISA检测方法,不仅为Bb抗体检测提供了实用的血清学检测手段,也为进一步开发Bb检测试剂盒奠定了基础。     

家兔支气管败血波氏杆菌重组蛋白DNT1的原核表达及其间接ELISA方法的建立

目的表达支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica,Bb）DNT蛋白,并以此建立检测Bb抗体的间接ELISA方法。方法参照GenBank公布的猪源支气管败血波氏杆菌dnt基因序列（AB020025）针对其N-端设计了一对特异性引物,PCR扩增出相应的核苷酸片段。将PCR扩增产物连接至原核表达载体pET-28a（＋）载体中,以E.coli BL21（DE3）为表达菌株进行诱导表达,以纯化重组蛋白DNT1作为诊断抗原,通过探索最佳抗原包被量和抗体血清稀释倍数,建立检测支气管败血波氏杆菌重组蛋白DNT1抗体的ELISA方法。结果成功克隆了dntN-端的基因序列,并在E.coli BL21（DE3）中获得高效表达,经SDS-PAGE、Western blot分析显示重组蛋白DNT1具有良好的抗原性。应用重组蛋白DNT1为抗原建立了检测Bb血清抗体的间接ELISA诊断方法。试验确定重组蛋白DNT1抗原的包被浓度为6.25μg/mL,最适血清稀释度为1∶100。结论建立的ELISA检测方法,不仅为Bb抗体检测提供了一种比较实用的血清学检测手段,也为进一步开发Bb检测试剂盒奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒S蛋白主要抗原表位区的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

【目的】建立一种快速、特异、敏感的检测血清中猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗体的方法。【方法】利用生物学软件对PEDV S蛋白进行抗原位点分析,选择S蛋白的主要抗原表位区进行原核表达。采用SDS-PAGE和Western-blot对重组蛋白进行鉴定及抗原性分析。用纯化的重组蛋白作为包被抗原,经过条件优化、特异性和重复性试验,建立一种针对血清中PEDV抗体的间接ELISA检测方法。【结果】表达了重组S蛋白,重组的S蛋白能与PEDV阳性血清发生特异性反应,并建立一种基于重组S蛋白的间接ELISA检测方法。组内及组间变异系数均小于10%,重复性较好。建立的间接ELISA检测方法分别与商品化PEDV抗体检测试剂盒和Western-blot鉴定结果相比,两者符合率分别为86.67%和88.89%。【结论】建立的间接ELISA方法可以用于PEDV抗体的检测。     

猪嵴病毒结构蛋白VP0与VP1原核表达及间接ELISA方法的建立

分别建立基于猪嵴病毒(PKV)结构蛋白VP0与VP1的间接ELISA检测方法。对PKV结构蛋白VP0与VP1的基因进行合成并连接至原核表达载体pET-32a后,转入感受态细胞BL21中,用IPTG诱导表达的重组蛋白经Ni柱纯化后,分别以重组蛋白pET-32a-VP0与pET-32a-VP1作为包被抗原,采用棋盘滴定法建立两种间接ELISA检测方法,并进行重复性、敏感性、特异性实验和临床检测。结果显示重组蛋白pET-32a-VP0与pET-32a-VP1抗原的最佳包被浓度分别为2 mg/mL和2.5 mg/mL,反应条件均为37℃、1 h;封闭液最佳条件为5%脱脂乳,37℃、2 h;血清最佳孵育条件为1∶200,37℃、1 h;二抗最佳孵育条件分别为1∶20 000和1∶15 000,37℃、1 h;最佳显色时间为10 min,两种间接ELISA检测方法临界值分别为0.306和0.277。试验结果表明本研究成功建立了能够有效检测PKV血清特异性抗体的间接ELISA方法,且方法具有重复性好、敏感性高、特异性强、稳定性好等特点,对今后PKV的临床诊断及抗体检测试剂盒的开发奠定了重要基础。     

鸭病毒性肝炎病毒VP1基因表达及其抗体检测ELISA方法的建立

[目的]研究DHV VP1基因在大肠杆菌中的表达,并以纯化的重组蛋白为抗原建立鸭病毒性肝炎抗体检测ELISA方法.[方法]采用RT-PCR技术,扩增VP1基因,与Pmd18-T载体进行连接,构建DHV VP1基因克隆重组质粒.然后定向插入到Pet-32a( )表达载体,筛选原核表达载体Pet-32a-VP1,进行ITPG诱导表达分析.以纯化的重组蛋白为抗原建立间接ELISA方法并初步应用于临床.[结果]DHV VP1基因可在大肠杆菌中稳定、高效地表达.Western blot检测表明,表达的重组蛋白能与鸭肝炎阳性血清发生特异性反应.确定间接ELISA方法的抗原最佳包被浓度为5 ug/孔,血清最佳稀释度为1:100,临界值为OD450值≥0.302,建立的ELISA方法具有较好的敏感性、特异性和重复性.通过对80份血清样品的检测表明,该方法与中和试验的符合率为97.5%,初步临床应用结果表明该方法可用于雏鸭母源抗体和免疫后抗体的消长变化的检测.[结论]以大肠杆菌表达的DHV VP1重组蛋白为抗原建立的间接ELISA方法可用于鸭病毒性肝炎抗体的检测.     

非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测方法的建立

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是一种急性、热性、高度接触性动物传染病,其病原为非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV),临床上以高热、网状内皮系统出血和高死亡率为特征,易感猪群病死率高达100%。为了建立一种基于合成肽技术的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)抗体血清学检测方法。本研究根据ASFV p30、p54和p72三种重要抗原设计3条合成肽,以此为包被抗原建立了ASFV间接ELISA抗体检测方法,并验证其敏感性、特异性、稳定性以及与进口试剂盒的符合率。结果显示,建立的间接ELISA方法的敏感性为91.4%,特异性为98.1%,批内和批间变异系数分别为3.7%～10.1%和4.7%～14.9%。与进口试剂盒比较,符合率为92.9%。结果表明该方法检测结果准确性高、且稳定性好,可检测ASFV特异性抗体。     

肺炎衣原体ompA基因VD2-VD3区重组蛋白在血清学诊断中的初步应用

应用聚合酶联反应(PCR)技术,从肺炎衣原体Chlamydia pneumoniae的主要外膜蛋白(Major Outer Membrane Protein,MOMP)编码基因(ompA)上扩增出抗原优势表位VD2-VD3区基因,构建原核表达系统并诱导表达重组蛋白,经Ni-NTA亲和层析法纯化表达产物。间接酶联免疫吸附试验(Enzyme link immunosorbent assay,ELISA)检测人血清中特异性IgG抗体。试验表明,转化入BL21大肠杆菌的重组质粒,能表达并纯化出相对分子质量(Mr)为24KD的重组蛋白。Western blot证实重组蛋白只与Cpn MOMP mAb发生特异性反应;重组蛋白用作ELISA包被抗原检测Cpn阴阳性参比血清,特异性和灵敏度均为100%;对126位冠心病患者血清进行的检测中,该间接ELISA法与晶美公司Cpn IgG ELISA诊断试剂盒的检测结果相比,符合率达到96.3%。结果证实,制备的重组蛋白MOMPVD2-VD3具有良好的免疫活性,在Cpn血清学诊断的应用中具有较大的利用价值。     

猪细小病毒VP2蛋白主要抗原域间接ELISA方法的建立

将已获得的含猪细小病毒VP2蛋白主要抗原域编码基因VP2I重组酵母菌株在优化的条件下进行诱导表达,表达产物蛋白含量达227.6μg/ml,在此基础上以重组蛋白作为包被抗原初步建立了检测猪细小病毒抗体水平的间接ELISA方法,并对该方法进行了优化,结果表明抗原最佳包被浓度5.69μg/ml,而血清最佳稀释倍数为1∶80.阳性标准初步定为:OD待测样品＞0.5,且OD待测样品/OD阴性血清＞2.0.采用iVP2I-ELISA对猪血清样品进行检测,结果显示iVP2I-ELISA与HI试验的符合率为97.2%,与国外同类试剂盒的符合率达到91.2%.     

布鲁菌bp26基因的原核表达及间接ELISA方法的临床初步应用

构建诊断人布病的优势抗原BP26原核表达载体,并建立以该蛋白作为包被抗原的间接ELISA方法。人工合成bp26基因片段,构建原核表达载体pET30a-bp26,并转化入大肠埃希菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,Ni柱亲和纯化BP26重组蛋白,间接ELISA检测其抗原活性,并优化间接ELISA方法的各个参数,检测临床大量样本,对该方法性能进行评价。PCR鉴定及DNA测序证实pET30a-bp26重组质粒构建成功,并在0.8 mmol/L IPTG 20 ℃过夜诱导的条件下大量表达,经亲和纯化获得高纯度的可溶性BP26重组蛋白,间接ELISA结果显示该重组蛋白具有抗原活性,优化参数后,该方法的敏感度为70.00%,特异性为94.74%。成功获得高抗原活性的原核表达可溶性BP26重组蛋白,并建立用于临床特异性诊断人类布病的间接ELISA方法。     

猪细小病毒VP2蛋白的主要抗原表位基因的原核表达及检测应用

将构建好的重组质粒PET-VP2Ⅰ转化宿主菌BL21,利用IPTG(1mmol/L)诱导实现了PET-VP2Ⅰ蛋白主要抗原域VP2Ⅰ融合蛋白的高效表达。通过Western-blot检测证明表达的重组蛋白具有良好的免疫学活性。表达产物经HisBind层析柱纯化后作为诊断抗原初步建立了检测PPV抗体的间接ELISA方法。结果表明:抗原的最佳包被浓度为3.5μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶40,待检血清阳性标准初步定为OD490>0.51,且待检血清的OD490值与阴性血清的OD490值的比值大于2.1。     

结核分枝杆菌Rv3425特异性蛋白片段与CFP10-ESAT6融合蛋白在结核抗体检测中的应用价值

目的:对结核分枝杆菌Rv3425蛋白进行生物信息学分析及抗原表位预测,评价Rv342519-176重组蛋白与CFP10-ESAT6融合蛋白在结核抗体检测中的应用。方法:PCR扩增结核杆菌Rv3425蛋白19～176位的编码基因片段,原核表达并纯化Rv342519-176重组蛋白(rRv342519-176)和CFP10-ESAT6融合蛋白(rCFP10-ESAT6),建立以重组蛋白为抗原的ELISA方法,评价2种蛋白在结核抗体检测中的联合应用价值。结果:具有抗原表位的rRv342519-176与rCFP10-ESAT6在大肠杆菌中高效表达;ELISA结果显示,rRv342519-176的敏感性为39%,特异性为97.5%;rCFP10-ESAT6的敏感性为37%,特异性为95%;2种蛋白联合检测,敏感性提高到57%,特异性为95%。结论:生物信息学预测Rv3425的优势抗原表位,表达并纯化的rRv342519-176和rCFP10-ESAT6在结核抗体检测中具有一定的抗原互补性,在保持特异性的基础上可显著提高检测敏感性。     

牛流行热病毒G1抗原表位基因在大肠杆菌中的表达、纯化及抗原性鉴定

从包含牛流行热病毒G蛋白基因的质粒pMD-G中克隆G1抗原表位区基因,与表达载体pGEX-4T-1连接,成功构建重组质粒pGEX-G1。重组质粒转化BL21(DE3),以IPTG进行诱导,并确定了最佳表达条件的IPTG浓度为0.1mmol/L、反应温度为16℃、诱导时间为18h。可溶性表达的目的蛋白经Glutathione Sepharose TM4B介质纯化,纯度达80%;以包涵体形式存在的重组蛋白以2%的脱氧胆酸钠洗涤、0.5%的N-十二烷基肌氨酸钠溶解、透析复性、Glutathione Sepharose TM4B纯化后,纯度达85%以上。Western blot试验表明纯化的目的蛋白有良好的反应原性。经间接ELISA检测,测得牛流行热病毒12份阳性血清的OD490值平均为1.813±0.231,12份阴性血清的OD490值平均为0.359±0.032,差异极显著(P<0.01)。将重组蛋白作为抗原免疫兔子,试验兔均产生了高滴度的抗体,证实该蛋白有免疫原性。将目的蛋白作为包被抗原,测得8份狂犬病病毒阳性血清的OD490值平均为0.324±0.031,与所测12份阴性血清的OD490值接近,说明不存在交叉反应。以上结果均证实纯化后的重组蛋白有良好的生物学活性和特异性,可作为包被抗原,开发ELISA试剂盒。     

重组钩端螺旋体外膜蛋白酶联免疫吸附(ELISA)检测方法的建立

目的建立以重组外膜蛋白为基础的钩端螺旋体抗体间接ELISA检测方法。方法以基因重组技术获取重组钩端螺旋体外膜蛋白LipL32,以该蛋白为抗原,特异的钩体抗血清进行ELISA方阵滴定、交叉性试验、阻断试验,并对北京地区的70份犬血清使用建立的ELISA方法以及德国Virion公司的全菌体钩端螺旋体ELISA试剂盒进行相互验证。结果方阵滴定试验确立以100ng/孔为抗原包被浓度,1∶160为血清稀释度。交叉性试验具有广泛性、阻断试验标明该方法特异性强、灵敏度高。两种方法数据经χ2检验,两者检出率之间差异不显著。结论重组LipL32蛋白具有结合活性。初步建立了以重组LipL32蛋白为抗原的钩端螺旋体抗体间接ELISA检测方法。     

抗EGFRvⅢ单链抗体间接ELISA方法的建立及条件优化北大核心

[目的]以合成抗原EGFRvⅢ-BSA作为被检测物,建立检测抗EGFRvⅢ单链抗体的间接ELISA检测方法并优化其反应条件。[方法]利用N-马来酰亚胺甲基环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)将EGFRvⅢ与BSA偶联制备抗原。利用方阵滴定法对间接ELISA法的抗原包被浓度,单链抗体的稀释度、包被时间和温度、包被液、抗His-tag多抗稀释度和酶标抗体的稀释度进行优化,并对建立的间接ELISA方法的方法学进行验证。[结果]通过SDS-PAGE电泳和全波长紫外扫面显示EGFRvⅢ-BSA合成成功。用PBS于37℃包被1.25μg/m L的EGFRvⅢ-BSA 2 h,加入19.044μg/L的ChiMR1、1∶8 000的兔抗His-tag多抗和1∶10 000酶标抗体可获得最佳ELISA检测结果。应用优化后的条件检测4.761~152.35μg/L范围内的ChiMR1显示线性良好。线性方程为y=(A-D)/[1+(x/C)^B]+D(A:1.99706;B:-1.09760;C:35.54885;D:0.01558),R2=0.99923;60μg/L和20μg/L的质控品的检测精密度分别为7.142%和4.828%;准确度分别为91.8%和82.90%,准确度和精密度良好。[结论]建立的间接ELISA方法的线性、准确度和精密度良好,为临床疾病的检测奠定良好基础。