马铃薯甲虫热激蛋白基因Ld-HSP60的克隆、序列分析及温度胁迫下的表达

【目的】马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata是一种世界性检疫害虫,对温度胁迫具有极强的适应性,为进一步明确其对温度胁迫适应性的分子机制,研究了热激蛋白HSP60在马铃薯甲虫温度胁迫应答过程中的作用。【方法】采用RT-PCR及RACE技术克隆马铃薯甲虫热激蛋白HSP60基因的cDNA全长序列;利用生物信息学软件分析该基因及其编码蛋白质的序列特性;运用实时荧光定量PCR技术分析该基因在温度胁迫下的表达模式。【结果】克隆得到马铃薯甲虫热激蛋白HSP60基因,命名为Ld-HSP60(Gen Bank登录号:KC556801),其cDNA全长2 234 bp,开放阅读框(ORF)长1 731 bp,编码576个氨基酸,相对分子量约为61.27 kD,理论等电点为5.51,5'端非翻译区(UTR)长101 bp,3'UTR长402 bp。氨基酸序列中含有HSP60家族典型的特征序列。实时荧光定量PCR结果表明,低温胁迫(-10和0℃)下未检测到马铃薯甲虫雌雄成虫中Ld-HSP60的诱导表达;高温胁迫(38和44℃)诱导马铃薯甲虫雄成虫Ld-HSP60上调表达,随着胁迫温度的升高LdHSP60表达量呈现先升高后降低的趋势,38℃高温胁迫下表达量最高,胁迫时间越长Ld-HSP60表达量也越高。【结论】相比其他热激蛋白,HSP60对温度敏感性较低,推测HSP60可能在马铃薯甲虫雄成虫抵御高温胁迫中发挥作用。     

异色瓢虫HSP67B2基因的克隆及诱导表达分析

小分子热激蛋白是一种重要的分子伴侣,可以在环境胁迫下帮助蛋白质折叠和转运。本研究在转录组获得异色瓢虫 Harmonia axyridis HSP67B2基因部分序列的基础上,通过RACE技术克隆得到了 HSP67B2 基因的 cDNA 全长序列（基因登录号：KJ155728）,全长626 bp,其中编码140个氨基酸,3′非翻译区为 81 bp,5′非翻译区为122 bp,软件分析预测显示该基因编码蛋白的分子量为1597 kD,理论等电点为661。采用荧光定量 PCR 技术对异色瓢虫 HSP67B2基因在不同发育阶段、低温诱导条件和饥饿处理下的表达进行了研究,结果表明：HSP67B2 基因在幼虫期的表达量最高;在低温诱导和饥饿处理下,HSP67B2 基因出现上调表达并且表达效率显著提高,表明HSP67B2 基因可以通过调控小分子热激蛋白的合成使异色瓢虫适应环境变化。      

褐飞虱热胁迫下内参基因的筛选及热激蛋白基因表达分析（英文）

【目的】褐飞虱Nilaparvata lugens(Stl)是为害水稻的重要害虫之一,温度是影响其暴发、迁飞的主要环境因子之一。本研究旨在探讨研究褐飞虱对高温胁迫适应性的热激蛋白基因表达调控模式。【方法】分别以不同的高温(30℃~40℃)处理褐飞虱雌、雄虫1 h和2 h,利用荧光定量PCR技术检测其体内的β-actin 1,β-actin2,β-actin3,28S rRNA,18S rRNA和α-2-tubulin 6个内参基因的表达量,用geN orm和BestK eeper软件分析确定最稳定表达的内参基因,并检测热胁迫后hsp70和hsp90基因在处理褐飞虱成虫体内的表达模式。【结果】geN orm软件分析结果表明,热胁迫后褐飞虱内参基因稳定性在雌虫体内为:β-actin1=β-actin328S rRNAα-2-tubulin18S rRNAβ-actin2;在雄虫体内为:β-actin1=β-actin3α-2-tubulin28S rRNA18S rRNAβ-actin2。BestK eeper软件分析结果显示,在热胁迫的雌、雄虫体内β-actin1均最稳定,18S rRNA次之,β-actin2最不稳定。两种软件分析结果基本一致。以β-actin1为校正内参基因,荧光定量PCR分析hsp70和hsp90在不同热胁迫条件下的表达模式,结果表明,各高温处理下hsp70表达量与对照26℃下的表达量没有显著性差异;而hsp90基因表达模式表现为被高温诱导上调表达,在雌、雄虫体内表达量达到最高的处理条件分别为40℃和38℃处理2 h。【结论】β-actin1基因可以作为热胁迫下褐飞虱雌雄虫体内基因表达模式分析的校正内参基因使用。褐飞虱hsp90基因能被高温诱导表达,该基因可能在褐飞虱适应热胁迫过程中起着重要的作用。     

不结球白菜BcHSP70-1基因的克隆与进化及其表达分析

利用已报导的拟南芥和甘蓝型油菜同源基因序列设计克隆引物,从不结球白菜中克隆了BcHSP70-1基因。在BcHSP70-1基因测序后,对该基因编码蛋白质的理化性质、亚细胞定位和跨膜结构域等生物信息学分析结果表明,BcHSP70-1编码的蛋白质是亲水蛋白,定位在细胞质中,该基因ORF全长1 950bp,编码649个氨基酸,有1个内含子和2个外显子,内含子为324bp;对BcHSP70-1直系同源基因外显子和内含子比对分析显示,内含子的差异更显著。实时定量PCR表达分析表明,BcHSP70-1的表达量在不同耐热性的栽培种中有较大差异,在不耐热的不结球白菜品种(NHCC002)中未见该基因组成性表达;与38℃高温胁迫相比,4℃低温胁迫下诱导的BcHSP70-1表达量更高。     

马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)Pm-HSP70基因的克隆及其对温度胁迫的响应

本实验利用RACE技术克隆获得了马氏珠母贝HSP70 (Pm-HSP70)基因,并对其基因和氨基酸序列结构特征进行了生物信息学分析,同时采用荧光定量PCR技术分析了该基因在不同组织的表达模式及不同温度下的时序表达模式。序列分析表明,Pm-HSP70 cDNA序列全长为2 215 bp,其中开放式阅读框1 899 bp,5'UTR 107 bp,3'UTR 209 bp,编码632个氨基酸,理论蛋白分子量为69.44 kD,理论等电点为5.61。该蛋白具有HSP70家族典型的结构域HSP70,以及ATP结合位点、细胞质特征性保守序列和3个HSP70家族标签。多序列比对结果表明Pm-HSP70与菲律宾蛤仔HSP70同源性最高,为80%;系统进化分析发现,Pm-HSP70与菲律宾蛤仔等贝类HSP70聚为一支。组织表达定量分析结果显示,Pm-HSP70在马氏珠母贝多个组织中均有表达,在肝胰腺中表达量最高,其次是性腺;对不同温度下鳃组织中Pm-HSP70的时序表达分析发现,在处理后各时间点高温组(32℃)基因表达水平最高,且均显著高于对照组(22℃)和低温组(17℃)。以上结果表明Pm-HSP70可能参与马氏珠母贝的高温胁迫响应。该研究为进一步探索Pm-HSP70在马氏珠母贝温度适应性中的作用提供了基础资料。     

刺山柑70 kD热休克蛋白基因克隆及原核表达

以干旱区特有的抗逆性植物刺山柑为材料,利用RT-PCR结合cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)方法,克隆了一个HSP70基因,将该基因进行原核表达,通过对大肠杆菌进行温度胁迫实验,并计算存活率来验证该基因对细胞的保护作用.结果表明:该基因全长2 202 bp,开放阅读框共1 950 bp,编码649个氨基酸,表达产物分子量为71.044 6 kD;序列分析表明,该基因属于HSP70基因家族,将该基因命名为CsHSP70,并提交到GenBank,登录号为EU574936.构建了CsHSP70基因的原核表达载体,并使重组质粒pGEX-4T-2-CsHSP70在大肠杆菌中异源表达,对大肠杆菌进行温度胁迫实验结果显示,在高温(50℃)和低温(4℃)条件下,转重组质粒的大肠杆菌在两种胁迫下存活率均高于对照,说明在温度胁迫下CsHSP70对大肠杆菌细胞具有保护作用.     

甜菜夜蛾HSP90基因克隆及高温胁迫下其表达量的变化

为阐明热激蛋白90（heat shock protein 90, HSP90）在甜菜夜蛾Spodoptera exigua (Hübner)幼虫抵抗高温过程中的作用, 克隆了其HSP90基因cDNA全长序列, 并检测了在系列高温胁迫下不同龄期幼虫体内其相对表达量。根据已报道的热激蛋白90基因序列同源性设计简并引物, 利用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）结合cDNA末端快速扩增（RACE）技术成功克隆了甜菜夜蛾HSP90基因全长cDNA（GenBank登录号FJ862050）。该cDNA序列开放阅读框长2 154 bp, 编码717个氨基酸, 预测的相对分子量和等电点分别为82.6 kD和5.0。该序列具有HSP90家族的典型特征和特殊的功能结构域, 并且与多种生物的HSP90基因序列有较高的同源性。为了研究HSP90抵抗高温的作用, 构建荧光定量RT-PCR体系, 检测了37, 39, 41, 43和45℃胁迫下甜菜夜蛾不同龄期幼虫体内HSP90表达量的变化。结果表明, 高温胁迫对甜菜夜蛾幼虫体内的HSP90表达具有明显的诱导作用。幼虫体内HSP90表达量随着温度升高呈增加的趋势。43℃和45℃胁迫下, 各龄幼虫体内HSP90的表达量均显著高于常温（P< 0.05）, 但不同龄期之间没有显著差异。这说明HSP90在甜菜夜蛾幼虫抗高温中起到重要作用。     

温度和病菌感染对大黄鱼HSP67B2基因表达的影响

热激蛋白普遍存在于生物体内,是进化上非常保守的蛋白家族,可作为分子伴侣,并抑制细胞凋亡,提高生物体的耐热性.克隆了大黄鱼HSP67B2基因,并分析了温度和病菌对其表达的影响.获得的大黄鱼HSP67B2序列全长2325 bp,包括4个外显子和3个内含子,其中开放阅读框为525 bp,编码174个氨基酸.随着温度的改变,大黄鱼不同组织HSP67B2基因的表达呈现出不同的变化.24℃时HSP67B2在肌肉和肝组织中表达量最高,29℃时在肠和眼表达量最高.用恶臭假单胞菌感染大黄鱼,48 h时HSP67B2在肠和脾中表达量明显升高;而感染7 d后,肝、肠和脑中表达量明显升高.     

灰飞虱热激蛋白Hsp90基因的克隆、序列分析与表达模式

【目的】灰飞虱Laodelphax striatellus (Fallén)是水稻上的重要害虫,它严重影响了水稻的产量和品质,特别由其传播的水稻条纹叶枯病毒对水稻的危害甚至更为严重。灰飞虱分布广,对环境有很强的适应性。本研究旨在探讨灰飞虱对温度胁迫适应的分子机制进行了初步的探讨。【方法】本研究采用RT-PCR与RACE技术克隆了热激蛋白Hsp90基因的全长,利用各种生物信息方法分析了该热激蛋白的特征,实时荧光定量PCR技术用于研究Hsp90基因在不同生长发育阶段和不同温度条件下表达变化规律。【结果】我们获得一条Hsp90 基因的cDNA全长序列,命名为LsHsp90（GenBank登录号为KF660250）。 LsHsp90全长为2 740 bp,编码729个氨基酸,等电点为5.0,分子量为83.7 kDa。氨基酸序列中含有 Hsp90蛋白家族的5个签名序列及胞质特征序列 MEEVD。结构预测表明LsHsp90具有Hsp90蛋白家族典型的结构特征。系统进化关系分析表明它与多种昆虫的Hsp90序列有较高的同源性。不同发育阶段的灰飞虱体内LsHsp90表达水平处于动态的变化过程中,并在4龄若虫期达到最大值,最低表达量在其雌成虫阶段。不同性别的灰飞虱成虫体内LsHsp90表达量有显著差异（P =0.008）。高温和低温胁迫都可以诱导灰飞虱体内LsHsp90的表达,最大的表达量分别在 40℃和-9℃。在40℃下处理不同时间后发现,LsHsp90的表达水平在处理后0.5 h时最高,但随着时间的延长,LsHsp90的表达水平逐渐降低。而在-4℃下,LsHsp90的表达水平在处理后1 h时达到最大值。【结论】灰飞虱体内的LsHsp90可以响应温度的诱导,它可能在灰飞虱温度胁迫适应过程中起到重要的作用。     

甘菊ClHSP70与ClHSP90基因的克隆及表达分析

该研究以甘菊(Chrysanthemum lavandulifolium)为实验材料,通过RT-PCR方法从甘菊转录组数据中分离出热激蛋白合成相关基因,命名为ClHSP70和ClHSP90。序列分析表明,ClHSP70基因ORF全长为2 559bp,编码852个氨基酸,蛋白功能区预测表明含有典型的HSP70蛋白NBD和SBD保守结构域;ClHSP90基因ORF全长为2 094bp,编码697个氨基酸,含有HATPase结构域和HSP90保守结构域。生物信息学分析表明,甘菊ClHSP70与大豆(Glycine max)和烟草(Nicotiana tomentosiformis)HSP70蛋白有较高的一致性,ClHSP90基因编码的氨基酸序列与紫茎泽兰(Ageratina adenophora)HSP90高度相似;实时荧光定量表达分析表明,在42℃处理不同时间,甘菊叶片中ClHSP70和ClHSP90基因表达均在0.5h时显著增加,1h达到最大值,2h后缓慢下降;不同组织表达分析表明,甘菊在42℃处理1h后,ClHSP70在成熟叶中的表达量显著高于嫩叶和根等其他组织;ClHSP90在成熟茎中的表达量最高。研究说明,ClHSP70和ClHSP90基因具有热激蛋白特征,参与了甘菊热胁迫应答过程,该研究结果为以后深入研究其基因功能奠定了基础。     

两种入侵粉虱热激基因Hsp70的克隆及温度胁迫下的种间差异表达

为了检测B型烟粉虱和温室白粉虱在受到温度胁迫时热激基因Hsp70的差异表达谱,克隆了2种粉虱Hsp70基因的全长cDNA序列,并用实时定量PCR的方法分析了在不同温度条件下该基因的表达谱。结果表明:B型烟粉虱和温室白粉虱的Hsp70基因BTH-sp70和TVHsp70(GenBank登录号分别为DQ093385和EU861391),在5’-非编码区(UTR)中有类似TATA-box样元件;在3’-UTR中有poly(A)信号AATAA和富含A-T区;根据基因开放阅读框序列(ORF)推导的氨基酸序列均含有全部3个Hsp70蛋白家族高度保守的基序。在整个检测的温度范围内(-19℃～46℃),诱导温室白粉虱Hsp70表达的起始温度(Ton)或最大温度(Tmax)要比B型烟粉虱低2.5℃～7.5℃。这些结果表明,所克隆的基因属于有功能的温度诱导型Hsp70基因;在基因表达水平上,温室白粉虱比B型烟粉虱更耐冷,而后者更耐热;Hsp70的Ton(或者Tmax)能代表这2种粉虱的温度耐受能力。本研究结果在一定程度上解释了自然界中这2种粉虱种群地理分布和季节发生差异的原因。     

褐飞虱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Nlserpin4的克隆及表达模式分析

摘要: 【目的】克隆和分析褐飞虱Nilaparvata lugens丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Nlserpin4,并探明其时空表达谱和病原真菌诱导表达模式。【方法】基于褐飞虱转录组和全基因组序列数据,利用PCR技术克隆得到褐飞虱Nlserpin4基因的全长cDNA序列;利用生物信息学手段分析其核苷酸和蛋白质序列特征;通过qRT-PCR技术检测其在褐飞虱不同发育时期(卵、1-5龄若虫和初羽化雌雄成虫)和5龄若虫不同组织(脂肪体、肠道、血淋巴和剩余虫体)中的时空表达谱,以及金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae注射感染褐飞虱5龄若虫不同时间后的诱导表达模式。【结果】克隆获得褐飞虱Nlserpin4基因全长cDNA序列(GenBank登录号: MN822802),其开放阅读框长1 227 bp,编码408个氨基酸,蛋白的相对分子质量和等电点分别为45.91 kD和6.23。氨基酸序列分析表明,Nlserpin4蛋白无糖基化位点,N端包含一段由23个氨基酸残基组成的信号肽,C端具有serpin蛋白家族典型的RCL区,且含有能被靶标蛋白酶识别的活性裂解位点。系统发育分析表明,Nlserpin4与半翅目其他昆虫的serpin亲缘关系较近,其中与蔗黄伪毛蚜Sipha flava serpin4的亲缘关系最近。qRT-PCR分析表明,Nlserpin4基因表达具有明显的时空特异性,其在成虫中的表达量显著高于在其他龄期的,且在雄成虫中表达量最高;Nlserpin4基因在褐飞虱5龄若虫脂肪体、肠道、血淋巴和剩余虫体中均有表达,且在剩余虫体组织中表达量最高;病原真菌金龟子绿僵菌诱导48 h内Nlserpin4表达量均显著下调,但随着诱导时间的增加,Nlserpin4表达量呈回升趋势。【结论】褐飞虱Nlserpin4基因在褐飞虱不同发育阶段、不同组织以及病原真菌金龟子绿僵菌诱导不同时间下差异表达。研究结果为深入研究Nlserpin4在褐飞虱生长发育和免疫调节中的功能奠定了基础。     

褐飞虱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Nlserpin4的克隆及表达模式分析

【目的】克隆和分析褐飞虱Nilaparvata lugens丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Nlserpin4,并探明其时空表达谱和病原真菌诱导表达模式。【方法】基于褐飞虱转录组和全基因组序列数据,利用PCR技术克隆得到褐飞虱Nlserpin4基因的全长cDNA序列;利用生物信息学手段分析其核苷酸和蛋白质序列特征;通过qRT-PCR技术检测其在褐飞虱不同发育时期(卵、1-5龄若虫和初羽化雌雄成虫)和5龄若虫不同组织(脂肪体、肠道、血淋巴和剩余虫体)中的时空表达谱,以及金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae注射感染褐飞虱5龄若虫不同时间后的诱导表达模式。【结果】克隆获得褐飞虱Nlserpin4基因全长cDNA序列(GenBank登录号:MN822802),其开放阅读框长1 227 bp,编码408个氨基酸,蛋白的相对分子质量和等电点分别为45.91 kD和6.23。氨基酸序列分析表明,Nlserpin4蛋白无糖基化位点,N端包含一段由23个氨基酸残基组成的信号肽,C端具有serpin蛋白家族典型的RCL区,且含有能被靶标蛋白酶识别的活性裂解位点。系统发育分析表明,Nlserpin4与半翅目其他昆虫的serpin亲缘关系较近,其中与蔗黄伪毛蚜Sipha flava serpin4的亲缘关系最近。qRT-PCR分析表明,Nlserpin4基因表达具有明显的时空特异性,其在成虫中的表达量显著高于在其他龄期的,且在雄成虫中表达量最高;Nlserpin4基因在褐飞虱5龄若虫脂肪体、肠道、血淋巴和剩余虫体中均有表达,且在剩余虫体组织中表达量最高;病原真菌金龟子绿僵菌诱导48 h内Nlserpin4表达量均显著下调,但随着诱导时间的增加,Nlserpin4表达量呈回升趋势。【结论】褐飞虱Nlserpin4基因在褐飞虱不同发育阶段、不同组织以及病原真菌金龟子绿僵菌诱导不同时间下差异表达。研究结果为深入研究Nlserpin4在褐飞虱生长发育和免疫调节中的功能奠定了基础。     

一种新的昆虫热诱导型HSP70基因的克隆与表达分析

【目的】西花蓟马Frankliniella occidentalis(Pergande)是一种重要的外来有害生物,已在我国多个省份发现危害,且有向南北两端继续扩张的趋势。HSP70是热激蛋白家族中最重要的一类成员,在昆虫温度耐受性中发挥重要的作用。本研究旨在明确不同性别的西花蓟马成虫在受到高低温胁迫时其HSP70家族的表达差异,进一步探讨西花蓟马对环境适应的分子机理,为其防控提供理论依据。【方法】首先,应用RT-PCR及RACE技术从西花蓟马中克隆得到HSP70基因;其次,对该基因组进行验证,得到基因组序列,并分析内含子的位置及大小;最后,通过实时定量PCR技术分析得到的西花蓟马HSP70的表达模式。【结果】本研究克隆得到的西花蓟马HSP70基因命名为Fohsp703(GenBank登录号:KY914546),该基因全长2106bp,开放阅读框2040bp,编码679个氨基酸,推测分子量为73.6ku。FoHSP703的氨基酸序列中含有3个HSP70家族签名序列,说明它是热激蛋白家族成员;但是,FoHSP703的蛋白序列以APAA结尾,而且多序列比对与系统发育分析均表明,FoHSP703不同于现在已鉴定出的其它昆虫的HSP70。基因组结构分析发现,Fohsp703不含有内含子,在高低温胁迫下能够被诱导并且显著表达,而且雌虫的表达量高于雄虫,分别在37℃和-12℃达到最大值。【结论】本研究的西花蓟马HSP70(FoHSP703)是一种新的昆虫热诱导型HSP70,在西花蓟马温度耐受性中起着重要的作用。     

棉花HSP70基因的克隆与原核表达

以抗旱性较强的棉花品种‘KK1543’为材料,采用RT-PCR技术克隆了1个棉花HSP70基因,命名为GhHSP70。研究结果表明:GhHSP70基因开放阅读框长1 997bp,编码648个氨基酸,GhHSP70蛋白相对分子量为70.94kD,等电点为4.83。氨基酸序列比对和系统进化树分析发现,GhHSP70与欧洲大叶杨HSP70的亲缘关系最近,氨基酸序列一致性达到96.4%。为进一步分析基因的功能,构建原核表达载体pGEX-4T-1-GhHSP70,并在大肠杆菌中异源表达。SDS-PAGE分析表明所表达蛋白与预期蛋白大小一致,重组蛋白在37℃,0.2mmol/L IPTG诱导2h时表达量最大。研究为进一步研究棉花HSP70基因功能奠定基础。     

朱砂叶螨热激蛋白HSP70基因TCHSP70-4的克隆与表达

为了研究朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus(Boisduval)热激蛋白HSP70的表达与其适应高温和低温胁迫的关系,我们利用物种的同源性及RACE 技术,获得朱砂叶螨热激蛋白HSP70基因1个,命名为TCHSP70-4（GenBank 登录号为EU977182）。该基因全长2 182 bp,包含1 959 bp的开放阅读框,编码653个氨基酸,理论分子量为70.9 kDa,等电点为5.4,含有HSP70家族高度保守的基序。运用real-time PCR分析冷激（4℃）和热激（40℃）1 h后TCHSP70-4在朱砂叶螨体内的表达量。结果显示冷激后TCHSP70-4表达量明显下降,而热激后TCHSP70-4表达量却明显上升。这些结果一方面表明该基因属于诱导型HSP70基因,另一方面揭示了朱砂叶螨分别受到冷和热胁迫后体内TCHSP70-4的表达及所起的保护作用是不同的。     

二化螟热休克蛋白70基因的克隆及热胁迫下的表达分析

热休克蛋白70是已知热休克蛋白家族中最重要的一种, 它在细胞内的大量表达可以明显改善细胞的生存能力, 提高对环境胁迫的耐受性。为探讨热胁迫对二化螟Chilo suppressalis幼虫热休克蛋白70表达的影响, 采用RT-PCR及RACE技术从二化螟血淋巴细胞中克隆了热休克蛋白70基因全长cDNA序列。该基因全长2 102 bp, 开放阅读框 (open reading frame, ORF)为1 959 bp, 编码652个氨基酸; 5′非编码区（untranslated region, UTR)为81 bp, 3′UTR为62 bp。从该基因推导的氨基酸序列与其他昆虫的同源序列比较有很高的相似性（73%~97%)。实时定量PCR显示二化螟HSP70基因能被热胁迫诱导表达, 幼虫血淋巴细胞的HSP70基因在36℃时表达量最高。流式细胞术研究发现HSP70在蛋白质水平上的表达变化与在mRNA水平上高度一致, 说明二化螟HSP70基因在转录及翻译水平上受到热应激的调节。     

德国小蠊两个海藻糖合成酶基因的克隆、组织分布及温度诱导表达分析

【目的】海藻糖合成酶（trehalose-6-phosphate synthase, TPS）是参与昆虫血糖-海藻糖合成的关键酶。本研究旨在克隆德国小蠊 Blattella germanica TPS基因,研究TPS基因在德国小蠊不同组织中的表达模式及在不同温度处理下的表达情况。【方法】通过RACE技术克隆德国小蠊TPS基因全长序列,利用荧光定量PCR的方法检测TPS基因在德国小蠊5龄幼虫不同组织中的表达模式及在高温(40℃和46℃处理30 min)及低温(0℃和10℃处理1 h)逆境下的表达量变化。【结果】从德国小蠊中克隆获得2个TPS基因,分别命名为 BgTPS1 (GenBank登录号：KR050213) 和 BgTPS2 (GenBank登录号：KR050214)。其中,BgTPS1基因cDNA序列全长2 987 bp,开放阅读框 (ORF) 2 502 bp,编码833个氨基酸;BgTPS2基因cDNA序列全长3 212 bp,开放阅读框2 469 bp,编码822个氨基酸。BgTPS1和BgTPS2基因都主要在5龄幼虫脂肪体中表达,且BgTPS2基因的表达量为BgTPS1基因表达量的3.9倍。在两种不同极端温度诱导下,BgTPS1和BgTPS2基因mRNA均上调表达。其中,BgTPS2 的表达量始终显著高于 BgTPS1。在0℃时,BgTPS1和BgTPS2的表达量最高。【结论】德国小蠊5龄幼虫中存在2个TPS基因。两个TPS基因均在脂肪体中高表达,且BgTPS2基因的表达量显著高于BgTPS1基因;低温和高温诱导下均能促进两个基因的表达量上升。该结果为进一步明确昆虫海藻糖的合成途径及其在昆虫对温度逆境的反应中的作用研究奠定了基础。     

褐飞虱ABCB基因的克隆与表达分析

三磷酸腺苷结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette,ABC)广泛分布于各种生物体中,是最大的膜蛋白家族之一。在昆虫中,ABC转运子不仅在分子转运过程中有重要的功能,同时在杀虫剂抗性、代谢和发育中都起到重要的作用。本研究克隆和鉴定了褐飞虱Nilaparvata lugens St l ABCB基因(NlABCB),结果表明NlABCB基因全长1468 bp,含有一个长度为459 bp的开放阅读框,编码153个氨基酸。利用定量PCR检测NlABCB基因在褐飞虱体内的表达,发现NlABCB转录本在褐飞虱的所有发育阶段都有表达,在1龄若虫中表达量最低,随着生长发育表达量逐渐升高。NlABCB在褐飞虱5龄若虫的中肠中表达量最高。研究发现该基因与褐飞虱的生理活动有关。构建NlABCB-dsRNA载体,转化大肠杆菌Escherichia coli HT115后,经IPTG诱导,形成NlABCB-dsRNA,喂养褐飞虱取食含NlABCB-dsRNA人工饲料,发现褐飞虱的存活率明显降低。因此该基因的克隆和功能鉴定,对于作物的抗虫育种,尤其对水稻害虫的生物防治将起到重要的促进作用。     

大螟HSC70基因克隆及表达模式分析

【目的】近年来,大螟Sesamia inferens (Walker)对水稻的为害逐渐加重并成为水稻的重要害虫之一。随着全球气候变暖,大螟的分布区域也在逐渐向北延伸。HSP70家族作为分子伴侣参与生物生长发育并对外界刺激产生响应,对生物功能蛋白质的正确折叠及其转运有着重要意义。本研究旨在明确HSP70家族HSC70基因在大螟不同组织、不同发育阶段以及低温胁迫下的表达差异,初步探讨大螟对环境适应的分子机理。【方法】应用RT-PCR及RACE技术从大螟5龄幼虫中克隆得到HSC70基因;进行基因组验证,得到其基因组序列,分析内含子的位置及大小;应用实时定量PCR技术分析大螟HSC70基因的表达模式。【结果】大螟HSC70基因长2 160 bp,命名为Sihsc70（GenBank登录号：KJ639908）,开放阅读框长1 962 bp,编码653个氨基酸,推测分子量为71.6 kDa。其氨基酸序列中含有3个HSP70家族保守序列,在C-末端存在细胞质定位信号,说明大螟HSC70是细胞质热激蛋白家族成员。大螟HSC70基因组序列长度为3 522 bp（GenBank登录号：KJ639909）,含有2个内含子,长度分别为685 bp（位于编码区上游）和803 bp（位于编码区内）。在大螟5龄幼虫的不同组织中Sihsc70表达量差异不显著（P＞0.05）,其中在中肠、后肠和体壁中的表达量较高,在唾腺中的表达量最低;在大螟不同发育阶段中,Sihsc70的表达量在雌成虫最低,较高的3个阶段依次为卵、2龄幼虫和5龄幼虫,分别为雌成虫表达量的6.33,3.21和1.86倍;相对于对照组（27℃）,低温胁迫对大螟5龄幼虫HSC70基因表达的影响差异不显著（P＞0.05）。【结论】结果说明,大螟HSC70基因在不同发育阶段和幼虫不同组织中具有不同的表达水平,而低温胁迫不能诱导该基因大量表达。