对鳞翅目害虫高毒力的Bt cry1Aa基因的分离克隆及表达

Bt菌Ly30株是我国自行分离的对多种害虫具有高毒力的苏云金芽孢杆菌,经CAPS(cleaved amplified polymorphic sequences)系统鉴定,它含有cry1Aa基因。以全长基因PCR产物的粘端定向克隆的方法, 设计一对特异引物,分别引入NcoⅠ和BamHⅠ/NcoⅠ酶切位点。以Ly30质粒DNA为模板扩增cry1Aa全长基因,与表达载体Pkk233-2相应酶切产物连接,转化大肠杆菌,获得含有cry1Aa基因重组质粒pKKLy1Aa。完成了该基因的亚克隆和序列测定,结果表明,该基因的编码区为3 531 bp,编码蛋白分子量为133.2kD,含1.176个氨基酸,等电点Pi为4.99。该基因序列已在GenBank中登记注册,登录号为AF384211,并被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为cry1Aa12。对重组菌KKLy1Aa进行诱导表达研究。在0.6 mmol/L IPTG、37℃、8 h培养条件下,该基因获得高效表达,SDS-PAGE电泳检测到明显的133.2 kD蛋白带。室内生测结果表明,Cry1Aa蛋白对不同的小菜蛾品系均有较高的杀虫活性,其LC₅₀值分别为0.203 μg/mL和0.554 μg/mL。     

脱落酸人工抗原合成及多克隆抗体制备

目的:为了对植物细胞中的脱落酸(ABA)进行定量和定位分析,研究了脱落酸人工抗原的合成以及多克隆抗体的制备。方法:用重氮化法将ABA分别与牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)联结,得到ABA的免疫抗原和包被抗原,并采用紫外全波长扫描和SDS-PAGE对合成的抗原进行了鉴定。以经过鉴定的抗原免疫白兔,制备出ABA的多克隆抗体;采用间接酶联免疫法(ELISA)对抗血清进行效价检测,通过离子交换层析法获得纯化的抗体。结果:ABA与BSA的平均偶联比为5.3∶1,抗血清效价为1∶16000。结论:人工抗原和多克隆抗体制备成功,为采用ELISA和免疫胶体金技术(ICG)检测ABA提供了有效工具。     

spindlin1基因的原核表达及多克隆抗体制备

目的:明确人新基因spindlin1的组织表达谱、相互作用蛋白。方法与结果:应用PCR技术获得spindlin1的开放读框,并将其插入原核表达载体pGEX-2T,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,融合蛋白GST-Spindlin1获得了可溶性表达。用SDS-PAGE胶上的目的条带做抗原制备了多克隆抗体,进行了抗体纯化。结论:spindlin1在OVCar3细胞中可能以二聚体形式存在,这一现象还有待于进一步研究。     

单增李斯特菌CdaA的抗原表位分析及抗体的制备

生物信息学分析结果显示单增李斯特菌腺苷酸环化酶CdaA具有良好的种内保守性、种间特异性和抗原表位结构,本研究对该蛋白的免疫原性进行验证并制备单克隆抗体,拟以CdaA为检测靶标检测单增李斯特菌。考虑到跨膜区可能会阻碍CdaA的表达,因而构建pET30a-Δ300cdaA并诱导表达Δ100CdaA。以纯化的Δ100CdaA制备的多克隆抗体效价可达1∶128 000。Western-blotting分析表明多抗能够识别从单增李斯特菌中提取的CdaA。另外,筛选得到一株单克隆抗体,3F8,单抗效价可达1∶512 000。Western blotting分析可知该单抗能够与9株单增李斯特菌和2株非致病李斯特菌的提取蛋白结合,并且与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等7株其他菌种的提取蛋白不结合,表明该单抗具有良好的特异性。利用生物信息学筛选检测靶标并分析抗原表位结构,最后成功制备多克隆抗体和单克隆抗体。     

HIV-1 Gag多表位嵌合基因的构建及表达蛋白的抗体制备

旨在通过构建Gag的抗原多表位融合基因及在原核系统的高表达,为HIV诊断及可能的疫苗制备提供试验基础。选定HIV-1 Gag基因中3个片段包含较多抗原表位的区域,设计带有酶切位点的引物,用PCR的方法从HIV-1HXB2全基因扩增编码这3个片段的基因序列,通过质粒提取、酶切、测序方法鉴定基因片段的正确性,SDS-PAGE和Western blotting测定融合蛋白的表达,并免疫动物制备相应抗体。结果显示,构建的HIV-1 Gag多表位嵌合基因的原核表达质粒,酶切和测序结果表明基因序列正确,基因全长576bp。在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达的重组蛋白分子量为27kD,以包涵体的形式存在。纯化目的蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体IgG。ELISA和免疫荧光方法检测显示制备的多克隆抗体能具有特异性反应。成功构建和高表达了HIV-1 Gag多表位融合蛋白,纯化蛋白制备的抗体与HIV-1Gag有特异性结合。为进一步研究HIV-1奠定了试验基础。     

幽门螺旋杆菌重组抗原表位肽C-CagAL构建及其多克隆抗体特异性分析

[目的]制备幽门螺旋杆菌重组抗原表位肽C-CagAL,并分析其多克隆抗血清的特异性。[方法]用分子克隆技术构建重组表达质粒p ETC-CagAL,将其转入大肠杆菌中表达,利用Ni-Agarose亲和层析纯化目的蛋白C-CagAL;免疫BALB/c小鼠,制备抗C-CagAL多克隆抗血清,通过ELISA方法分析抗血清的特异性。[结果]DNAstar等软件表明C-CagAL具有较好的抗原性,Linker易形成转角或β-折叠,为柔性结构;重组抗原C-CagAL经大肠杆菌表达,约56 k Da,占菌体总蛋白的19. 82%,经Ni-Agarose亲和层析纯化,获得纯度为97. 5%的重组抗原C-CagAL;抗CCagAL多克隆抗血清能够特异性识别CagA和CagL。[结论]获得了一种能够激发抗CagA和CagL特异性抗体的重组抗原表位肽C-CagAL,为进一步研究其预防幽门螺旋杆菌感染的免疫效果奠定了基础。     

斑马鱼ANF基因的克隆及多克隆抗体的制备

心房钠尿肽ANF是钠尿肽家族中的一员,是心肌细胞分泌的一种循环激素,主要在心房组织分泌。生物信息学分析表明,斑马鱼ANF基因开放阅读框全长321bp,编码106个氨基酸,PCR扩增获得斑马鱼ANF基因全长。将所得的PCR片段插入原核表达载体pGEX-4T-1中,并将重组质粒(pGEX-4T-1-ANF)转化大肠杆菌BL21。通过IPTG诱导表达GST-ANF融合蛋白,经GST亲和层析法纯化后,免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体,Western blotting分析表明,制备的抗体具有良好的高效价性和特异性。     

结核分枝杆菌多表位诊断抗原的制备

将结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)多个B细胞预测表位串联表达(命名为B102),并初步评价其作为诊断抗原的血清学诊断价值。将MtbPstS1、ESAT6、CFP10、Ag85B、Ag85A及PPE54等6个蛋白的11个B细胞预测表位串联,加入合适的连接臂后全基因合成;将多表位片段插入带有TRX标签的表达质粒中,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并利用Ni~(2+)-Chelating亲和层析和DEAE阴离子交换层析纯化目的蛋白;利用Western blotting (WB)技术对目的蛋白抗原性进行鉴定,并建立Mtb抗体检测竞争法ELISA技术,初步评价此方法对阴阳血清样本的鉴别能力。目的蛋白以包涵体形式存在,其表达量约占菌体总蛋白的31.25%,经纯化及复性后蛋白B102可溶性存在,浓度为3.124mg/mL,纯度为96.71%;WB实验表明目的蛋白能与Mtb阳性血清相应抗体发生反应。对60份Mtb阳性血清及60份Mtb阴性血清进行检测得出其灵敏度为90.00%,特异性为93.33%,阳性预测值为93.10%,阴性预测值为90.32%,符合率为91.67%,McNemer检验的结果提示与"金标准"诊断结果无差异,Kappa=0.833,提示两种方法诊断结果一致性优异。原核表达与层析纯化可以获取抗原性优异的Mtb多表位诊断抗原,作为诊断抗原可以应用于Mtb的血清学检测中。     

人突触相关蛋白抗原表位分析、抗体制备及表达研究

突触相关蛋白家族成员的功能与神经突触膜上的谷氨酸酯受体和钾离子通道的定位和功能有关,参与神经递质的释放、神经的生长、发育及修复.为分析一个新的人突触相关蛋白基因（FRG4）的抗原表位和该蛋白质在血管细胞的表达,从人胎肝文库PCR扩增获得FRG4基因全长cDNA序列.通过生物信息学分析,预测FRG4编码氨基酸序列的二级结构、抗原决定簇和功能结构域;选取抗原13肽PKLVKEEVFWRNY,采用固相多肽合成法合成了FRG4抗原多肽,免疫新西兰白兔获得兔抗人FRG4多抗;免疫组化检测该蛋白质在人血管细胞中的表达.高效液相色谱检测显示制备的兔抗人FRG4多克隆抗体纯度达82.79%,抗体滴度为1∶16 000,蛋白质印迹证实该抗体具有较好的反应性和特异性,免疫组化证实,其主要在平滑肌细胞和内皮细胞的胞浆中表达.结果表明,成功制备了兔抗人FRG4抗体,FRG4蛋白主要在细胞胞浆中表达,与生物信息学分析结果一致.     

恶性疟多抗原表位融合基因在不同载体中的克隆与表达

通过PCR方法扩增并分析了恶性疟原虫多抗原表位融合基因awte序列,再分别克隆于温度诱导型融合表达载体pEX31b和IPTG诱导型融合型表达载体pGEMEX1中,并进行了诱导表达,并对表达产物MS2－AWTE和T7φ10－AWTE融合蛋白进行间接ELISA检测,证实MS2－AWTE和T7φ10－AWTE都具有免疫学活性。另外,同样将awte基因分别克隆于温度诱导型和IPTG诱导型非融合表达载体pBV200、pKEN中并进行诱导表达,但在SDS－PAGE中并未检测到可见的AWTE表达带。     

风疹病毒多表位诊断抗原的制备与评价

原核表达与层析纯化获取风疹病毒(Rubella Virus,RV)多表位诊断抗原,并初步评价其抗原性。将RV衣壳蛋白C aa 3~29、aa 96~123以及包膜糖蛋白E1aa208~247三个主要免疫显性表位串联,密码子优化后全基因合成;利用基因重组技术将多表位串联片段插入带有GST标签的表达质粒中,在大肠杆菌中进行表达,并利用亲和层析和离子交换层析纯化目的蛋白;利用Western Blot(WB)技术对目的蛋白抗原性进行鉴定,并建立RV-IgM抗体检测ELISA技术,初步评价此方法对阴阳血清样本的鉴别能力。获取高度均质的RV多表位诊断抗原,WB实验表明目的蛋白不但可以被anti-GST单克隆抗体识别,还可以被anti-RV多克隆抗体、RV-IgM阳性血清相应抗体所识别。分别对48份RV急性感染病例的阳性血清、阴性血清和健康人血清进行检测,发现一致性优异。原核表达与层析纯化可以获取抗原性良好的RV多表位诊断抗原,偶联HRP后可以作为检测抗原应用于RV-IgM ELISA血清学检测中。     

棉铃虫β-actin基因的克隆、表达及多克隆抗体制备

克隆获得了棉铃虫β-actin基因,生物信息学分析表明,基因序列长1 131 bp,编码376个氨基酸,理论分子量为41.77 k D,理论等电点5.16。氨基酸序列与其他物种肌动蛋白比较有98%-99%的一致性,与鳞翅目的家蚕具有99%的一致性。分析棉铃虫β-actin和小家鼠β-actin的抗原决定簇位点,发现两者抗原表位有70.63%的一致性。同时原核表达、纯化了棉铃虫β-actin蛋白,Western-blot结果表明表达正确。将纯化后的蛋白免疫ICR小鼠4次后,小鼠抗血清效价最高可达388 800,并且能与天然棉铃虫蛋白特异性结合。     

小鼠DEAF1多克隆抗体的制备及应用

为研究DEAF1在小鼠胰淋巴结中的内源性表达及调控外周组织抗原基因表达的机制,将DEAF1的原核表达质粒转化至E.coli BL21中,诱导获得重组DEAF1蛋白;经尿素梯度裂解包涵体纯化获得的重组DEAF1蛋白分期免疫Balb/C小鼠,获取鼠抗DEAF1的多克隆抗血清;采用ELISA、Western blot、免疫荧光、免疫沉淀分别鉴定其效价、特异性、敏感性和亲和力。结果表明,抗血清可与抗原发生特异性的免疫反应,可用于检测DEAF1的表达及荧光定位,抗血清与抗原有较高的亲和力。结果证明所制备的多克隆抗血清具有较高的特异性、敏感性和亲和力。     

斑马鱼Foxp4基因多克隆抗体的制备及检测

Foxp4为Fox基因家族的一员,目前研究发现其与肺、肠、心脏以及中枢神经系统的发育有关.为了在斑马鱼模型中进一步研究该基因的功能,有必要制备其多克隆抗体.按照巢式PCR原理,经过两次PCR扩增出亲水性和特异性均好的斑马鱼Foxp4基因片段,将其克隆人表达载体pGEX4T-1,转化至大肠杆菌BL21中,再通过1PTG进...     

斑马鱼心脏发育候选基因Pygo1多克隆抗体的制备及检测

Pygo1是心脏发育候选基因,可能在斑马鱼心脏发育过程中起着重要的调控作用.利用生物信息学选择斑马鱼Pygo1基因抗原亲水区,将扩增出的PCR片段克隆到原核表达pGEMT-4T-1载体中,转入E.coli中后通过IPTG(Isopropylβ-D-thiogalactoside)分别诱导表达GST融合蛋白.蛋白经纯化分离后用于免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.用Western Blot检测抗体的效价和特异性.     

OGT 多克隆抗体的制备及特异性分析

目的:为了探讨O-GlcNAc糖基转移酶OGT的生理和病理作用,需制备能高效特异性检测OGT的抗体。方法:在NCBI数据库中,查找人源OGT基因序列,根据OGT的结构特点,选取OGT的C末端催化结构域中的一段多肽序列(464-949位点氨基酸)做抗原。首先,构建OGT的C末端催化结构域(464-949位点氨基酸)的重组表达载体pET30-a-OGT-C,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,IPTG诱导表达融合His标签的OGT-C蛋白,Ni+珠亲和层析法纯化提取OGT-C蛋白。再以OGT-C重组蛋白作为抗原,免疫Wistar大鼠制备多克隆抗体,并用间接ELISA法检测OGT抗体的效价,Western blotting鉴定抗体特异性。结果:多抗效价达1:80000;在免疫印迹实验中,此多抗可以高效的检测重组抗原,并可以特异性识别培养细胞内源表达的ncOGT和mOGT这2种OGT亚型。结论:实验结果表明,获得高效价、高特异性的OGT多克隆抗体,在OGT的生物学研究中可以用于检测ncOGT和mOGT的表达。     

斑马鱼基因ATF4多克隆抗体的制备

ATF4是含有bZIP结构域的ATF／CREB转录因子家族成员,对胚胎的发育以及细胞的增殖、分化有重要的调节作用。制备ATF4的多克隆抗体对于研究其在斑马鱼心脏发育过程中的作用有重要的意义。研究首先通过生物信息学方法,选择ATF4基因中特异性强、具亲水性的一段核苷酸序列（1017bp）,通过PCR扩增,将片段重组到原核表达载体pET-28a,然后转化入Rosetta菌株中。经测序鉴定正确后,用IPTG诱导表达融合蛋白,以该融合蛋白免疫小鼠,获得ATF4多克隆抗鼠血清。对该多抗血清抗体进行验证,具有很好特异性和较高效价,可以用作Western—blotting、免疫印迹等试验分析。     

MMP-9蛋白的抗原表位分析及单克隆抗体制备

利用生物信息学方法分析并预测MMP-9蛋白的抗原表位区,命名为Δmmp9。通过对Δmmp9的核苷酸序列进行分析,设计引物扩增目的片段,构建重组表达载体pET28α(+)-Δmmp9,并将其转化到BL21(DE3)中,诱导表达重组蛋白Δmmp9。纯化重组蛋白后,免疫BALB/c小鼠,筛选获得7株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,检测抗体效价均达1:240 000。利用生物信息学筛选抗原表位区,成功制备单克隆抗体,通过抗体配对实验,证明其有良好特异性,并筛选出3株捕获抗体及对应标记抗体。     

HCV C蛋白基因在大肠杆菌中的表达及其抗原表位分析

HCV是单股正链RNA病毒,不同分离株之间其基因组序列变异较大,不同区段变异程度也各不相同,相比之下C区(核衣壳蛋白)比较保守,推测可能具有重要的生物学功能。 利用各种不同的表达系统对HCV C蛋白的研究结果表明,初步加工产物为191个氨基酸,进一步的研究表明成熟的HCV C蛋白约为120个氨基酸。我们在基因克隆和序列分析基础上研究了不同区段C基因在大肠杆菌中的高效表达,制备了重组抗原,研制了单克隆抗     

基于B细胞表位制备抗肝细胞生成素的抗体

目的：基于B细胞表位制备抗肝细胞生成素（HPO）的抗体。方法：根据HPO的空间结构选择了2个候选B细胞表位,展示在T7噬菌体的表面,将提取的重组噬菌体免疫动物,采用ELISA法检测抗血清的效价,通过杂交瘤技术制备针对HPOC端表位的单克隆抗体。结果：2个候选B细胞表位KDGSCD和DGWKDGSC均能诱导抗相应表位多肽的多克隆抗体的产生,免疫6周后血清中抗体效价均达到1∶103,产生的抗体还能够特异识别HPO全蛋白;针对HPOC端表位KDGSCD的单克隆抗体也能识别HPO全蛋白,且具有良好的特异性。结论：基于T7噬菌体展示的B细胞表位可作为免疫原用于制备识别该B细胞表位来源的全蛋白质的抗体。