毕赤酵母醇氧化酶1启动子突变体的分离与鉴定

目的：通过醇氧化酶1启动子突变,筛选毕赤酵母高水平表达菌株。方法：通过致错PCR构建醇氧化酶1启动子突变体,经酶切连接到改造过的质粒HSA-pPIC9上,转化毕赤酵母GS115感受态细胞,摇瓶培养表达筛选人血清白蛋白（HSA）高表达突变体菌株。结果：克隆测序结果表明,突变的醇氧化酶1启动子-910和-569位点处共2个碱基发生了T→C突变;获得一株高表达菌株,摇瓶中HSA的表达量由200mg／L提高到335mg／L。结论：通过醇氧化酶1启动子突变成功构建了HSA高表达菌株。     

CRISPR/Cas9系统介导敲除CSN2基因奶山羊胎儿成纤维突变细胞的制备

旨在研究β-酪蛋白(β-casein,CSN2)对奶山羊泌乳性能的影响,利用CRISPR/Cas9系统敲除奶山羊胎儿成纤维细胞(GFFs)CSN2基因,为转基因动物模型构建提供核供体。针对CSN2第二号、八号外显子设计5个靶向CSN2基因sg RNA(T1、T2、T3、E1和E2),与PX330-e GFP载体连接,构建PX330-e GFP-sg RNA敲除表达载体,经T7E I酶切实验评估敲除效率;选择第八号外显子敲除效率最高sg RNA,构建PX330-Neo-sg RNA敲除载体,将PX330-e GFP-sg RNA T及PX330-e GFP-sgRNAE与PX330-Neo-sgRNAE组合转染细胞,经流式分选、G418药筛获得敲除CSN2基因细胞。Western blot测定转染细胞CSN2表达情况。测序结果表明各sgRNA均正确连入PX330表达载体中,T7E 1酶切实验表明sg RNA T1、sgRNAE2敲除效率最高达34.9%和25.9%;经荧光定量PCR及免疫荧光检测结果表明,eGFP+Neo转染组CSN2敲除细胞比例显著高于e GFP+e GFP转染组(P0.05)。综上表明,CRISPR/Cas9系统可有效应用于奶山羊胎儿成纤维细胞基因编辑,产生的突变细胞为制备CSN2基因敲除奶山羊提供核供体材料。     

CRISPR/Cas9系统介导的miR-155基因敲除细胞的制备

为研究miR-155基因在猪肺泡巨噬细胞系(3D4/21)中的功能,采用CRISPR/Cas9系统构建miR-155敲除的猪肺泡巨噬细胞系。首先,采用sgRNA-cas9程序,设计4个靶向miR-155的特异性sgRNA引物序列。然后构建sgRNA表达载体,与pEGFP-C1-cas9载体共转染3D4/21细胞,进行流式分选并富集表达绿色荧光蛋白GFP的细胞。最后,采用T7E I酶酶切、Sanger测序、实时荧光定量PCR(qPCR)、western blot等方法检测敲除效率,发现miR-155基因可以被以上4个sgRNA编辑,其中sgRNA39的敲除效率最高,T7E I酶酶切检测流式分选后的敲除效率有42%;Sanger测序显示sgRNA39细胞系敲除31个碱基;RT-qPCR结果显示miR-155-5p/3p表达量均有下降;western blot结果表明miR-155靶基因SHIP1的蛋白表达量升高。成功构建miR-155敲除的3D4/21细胞为进一步探讨miR-155在巨噬细胞发挥的调控功能研究提供细胞模型。     

猪链球菌2型ABC转运蛋白gene0910敲除突变体的构建及活性分析

目的:构建猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2)强毒株05ZYH3389K毒力岛上的ABC转运蛋白gene0910敲除突变体,并初步分析其活性,为进一步研究猪链球菌假想毒力因子在致病中的作用提供实验基础。方法:以猪链球菌2型05ZYH33基因组为模板,扩增gene0910两侧各约500bp左右的片段为上下游同源臂,以pSET1质粒为模板,扩增氯霉素抗性基因Cm为中间片段,采用重叠PCR方法搭建三个片段,并克隆到自杀载体pSET4S上,构建基因敲除的载体。电转化05ZYH33感受态细胞,经30℃双交换和40℃质粒丢失,最后点板法筛选出基因敲除突变体△0910。对突变株和野生株的生物学活性及小鼠的致病性进行了初步比较。结果:PCR分析和测序结果均显示gene0910完全被氯霉素抗性基因Cm所替代,基因敲除突变体构建成功。结论:突变株的生物学活性和对小鼠的致病性与野生株相比差异不显著。     

PCR—SSCP与测序技术相结合检测小麦耐盐突变体

根据位于小麦第四同源群上与耐盐有关的gf-2.8基因的编码区序列设计1对引物,分别以两个耐盐突变体及其亲本的总DNA为模板进行PCR扩增,在5个供试材料中均扩增出1条约685bp的目的条带,SSCP电泳显示突变体974915与其他供试材料之间存在差异。测序表明冀麦24和其耐盐突变体8901-17的扩增产物序列与gf-2.8基因的发表序列相同,这表明突变体8901-17的突变位点不在该基因上,而另一耐盐突变体974915的序列中则至少存在2个单碱基突变,有一处突变导致了氨基酸的变化,该突变位点位于gf-2.8基因的保守区域内。     

快速构建多重sgRNA载体利用CRISPR/Cas9技术敲除拟南芥IAA2基因

IAA2(Indole Acetic Acid 2)是拟南芥Aux/IAA生长素响应基因大家族中的一员,目前还没有它的突变体的报道,阻碍了对其功能和作用机制的深入研究。在CRISPR/Cas9基因组编辑技术中,1个sgRNA只能靶向基因的1个位点,有时基因敲除的效率并不高。为了提高敲除效率,本文在Golden-Gate克隆技术的基础上,通过两轮PCR扩增,将每3个sgRNA串联到同1个入门载体中,再将入门载体与含Cas9表达框的目标载体LR反应,获得最终的表达载体。结果表明,设计的6个sgRNA有4个发挥了作用,产生了碱基插入突变和大片段缺失突变等多种可遗传的突变。与单个sgRNA相比,多重sgRNA的基因敲除效率高、种系突变多;与其他构建多重sgRNA载体的方法相比,本方法具有快速、高效等优点。本文所得到的5个突变体为后续的IAA2功能研究提供了良好的材料。     

鸭梨PPO与GFP融合基因的烟草转化及亚细胞定位观察

将鸭梨PPO基因与绿色萤光蛋白GFP基因相融合共同进行遗传转化的方式,对鸭梨多酚氧化酶开展细胞定位研究。通过克隆该酶基因除终止密码子TAA外长度为1 779bp的CDS序列,与绿色荧光蛋白基因重组构建了荧光表达载体pBI121-PPO-GFP,借助农杆菌转化烟草,转基因烟草叶片细胞经激光扫描共聚焦显微镜观察,绿色荧光蛋白荧光与叶绿体自发荧光相重合。结果表明鸭梨多酚氧化酶为叶绿体蛋白质。     

smc5基因敲除斑马鱼肝脏转录组学分析

摘要 目的：探讨smc5基因敲除对斑马鱼肝脏基因表达谱的影响,进一步明确smc5突变对斑马鱼代谢的影响。方法：用CRISPR/Cas9技术构建smc5基因敲除斑马鱼模型,取3个月的smc5^-/-和野生型斑马鱼肝脏进行转录组测序,创建基因表达谱文库,观察smc5基因敲除后斑马鱼肝脏基因表达谱的变化,将筛选出的差异表达基因进行功能富集,并运用荧光定量PCR对KEGG通路中显著的差异表达基因进行验证。结果：成功构建出7号外显子上2碱基缺失造成移码突变的smc5基因敲除斑马鱼模型。RNA-seq发现smc5^-/-斑马鱼的肝脏基因表达谱变化显著,包含p53的多个通路激活,如细胞周期和凋亡。糖酵解、脂肪酸降解与代谢、丙酮酸代谢等相关通路显著下调。荧光定量PCR结果与RNA-seq结果一致。结论：smc5基因敲除下调斑马鱼肝脏糖脂代谢。本研究结果为进一步研究SMC5基因在糖脂代谢调控中的潜在机制奠定基础。     

斑马鱼tbx2b调控心脏房室间隔发育的功能研究*

tbx2是早期心脏发育的关键基因。为进一步探究其对房室间隔(AVC)发育的影响,研究利用CRISPR/Cas9介导的基因敲除技术,成功构建了斑马鱼tbx2b突变体。通过T7E1酶切对其F₀进行敲除效率检测,结果显示平均敲除效率约为57.5%。F₁进一步筛选获得tbx2b杂合突变体,测序结果显示突变类型为11 bp碱基缺失的移码突变。tbx2b杂合子内交获得纯合子,tbx2b纯合突变体在5 dpf死亡并出现早期心脏环化异常表型。斑马鱼整胚原位杂交实验显示在3 dpf tbx2b纯合突变体中, 心脏腔室分化特异性标志基因nppa、nppb表达上调并异位表达在AVC,而AVC发育关键基因has2的表达消失。高效构建tbx2b突变体并初探其对下游基因的影响,为后续深入研究tbx2b对心脏AVC发育的作用奠定了基础,同时加深了人们对早期心脏调控网络的认识。     

CRISPR/Cas9技术编辑OsRhoGDI2基因导致水稻半矮化

OsRhoGDI2是通过酵母双杂交从水稻幼穗中分离的一个与Rho蛋白家族成员OsRacD相互作用蛋白的编码基因,但功能尚不明确。本研究利用CRISPR/Cas9技术创制水稻OsRhoGDI2基因敲除突变体。检测结果表明,转基因水稻T0代获得2种纯合突变体,T1代获得8种纯合突变体。序列分析显示,在敲除水稻中,该基因的编辑靶点附近发生了碱基的替换或缺失,预期生成丧失RhoGDI保守结构域的截短蛋白。表型比对分析发现,敲除水稻与对照相比,株高显著降低,统计学分析结果显示,敲除水稻株高降低源于第Ⅱ和第Ⅲ茎节的缩短,提示OsRhoGDI2基因可能与水稻株高控制相关。     

禾谷镰刀菌中FgPDE1基因的敲除及其功能的研究

目的:旨在敲除禾谷镰刀菌Fusarium graminearum Fg PDE1基因,确定其缺失突变体表型,从而分析该基因的生物学功能。方法:应用Split-marker技术构建含有潮霉素基因敲除盒,通过PEG介导原生质体转化,PCR筛查抗潮霉素转化子以获得缺失突变体ΔFg PDE1,根据突变体表型变化及致病性的检测对Fg PDE1基因的功能进行分析。结果:采用Split-marker技术,成功构建了Fg PDE1基因敲除盒;PEG介导转化禾谷镰刀菌原生质体后成功获得转化子。经PCR筛查,得到3个PCR确认的敲除突变体;表型观察发现,ΔFg PDE1菌落的外型及菌落生长速度与野生型没有明显差异。孢子侵染西红柿果实实验证明:以西红柿为侵染宿主,相对于野生型,突变体致病性没有明显减弱;但突变体分生孢子产量显著下降。结论:Fg PDE1基因可能与禾谷镰刀菌分生孢子的形成有关。     

CRISPR/Cas9介导的荔枝霜疫霉基因组编辑系统的建立

参考大豆疫霉的CRISPR/Cas9基因组编辑技术体系,针对荔枝霜疫霉RXLR效应蛋白编码基因Pl Avh133设计了20 bp的sgRNA靶向序列,结合同源替换的方式对该基因进行敲除。利用聚乙二醇(PEG)介导的原生质体转化,共获得了58个具有G418抗性的转化子,通过PCR和测序分析证明其中5个转化子的Pl Avh133基因被敲除,敲除效率约为8.6%。荧光定量PCR分析证实Pl Avh133敲除突变体中该基因不表达。本研究结果为荔枝霜疫霉的基因功能研究提供了重要的技术基础。     

应用CRISPR/Cas9系统构建MTHFD1基因敲除的HEK-293细胞系

目的:利用成簇的、规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)基因编辑技术构建亚甲基四氢叶酸脱氢酶1(methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 1, MTHFD1))基因敲除人胚肾(HEK-293)稳定细胞系。方法:利用在线软件筛选出评分最高的3条针对MTHFD1基因的单向导RNA (sg RNA),然后合成sg RNA序列并将其插入到含有GFP标签的质粒中;重组质粒转染HEK-293细胞后通过流式细胞仪分选出已被转入sg RNA的单细胞,通过测序确认单克隆细胞系中MTHFD1的DNA序列突变状态;最后应用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(real-time quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-q PCR)和蛋白质印迹(Western blot)方法检测单克隆细胞中MTHFD1的m RNA和蛋白表达水平。结果:重组载体中含有正确的sg RNA序列;测序结果显示该细胞系中MTHFD1基因发生了单个碱基插入突变和6个碱基的缺失突变;RT-qPCR结果显示单克隆细胞系中MTHFD1在m RNA水平显著降低;Western blot检测成功构建MTHFD1蛋白缺失的HEK-293细胞。结论:本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建的MTHFD1敲除HEK-293细胞系。     

CRISPR/Cas9介导的水稻OsRhoGAP2基因的敲除

OsRhoGAP2是通过酵母双杂交从水稻幼穗组织分离的一种Rho GTP酶激活蛋白质编码基因,其功能尚不明确。为鉴定该基因的功能,本研究采用CRISPR/Cas9技术构建了OsRhoGAP2基因单靶标敲除载体,并转化日本晴水稻。对转基因水稻的筛选以及编辑靶点扩增和测序结果表明,在T_0代获得3种杂合突变体,在T_1代获得2种纯合突变体,命名为株系1和株系16。2个纯合敲除株系在OsRhoGAP2编辑靶点分别缺失2个和1个碱基,均导致该基因的移码突变并最终造成无义突变。序列分析显示,突变体中预期生成的OsRhoGAP2截短蛋白质丧失了保守的RhoGAP结构域及CRIB基序。抽穗期水稻的叶片扫描电镜观察结果显示,株系1的叶片表皮毛大量缺失;对抽穗期水稻的剑叶进行光合指标测量,发现突变体与野生型在净光合速率与气孔导度上存在显著差异。其中,株系1和株系16的净光合速率分别上升17.79%和7.70%,气孔导度分别上升113.10%和64.50%,提示OsRhoGAP2基因的功能可能涉及这些生物学过程。     

应用CRISPR/Cas9技术在杨树中高效敲除多个靶基因

CRISPR/Cas9系统是一种广泛应用于细菌、酵母、动物和植物中的基因组定点编辑技术。本课题组在前期工作中利用该系统在毛白杨(Populus tomentosa Carr.)中率先实现了对内源基因—八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene dehydrogenase, PDS)基因的定点敲除。为研究靶点的设计和选择对该系统介导的杨树内源基因敲除效率的影响,本文分析了不同单向导RNA(Single-guide RNA, sgRNA)结合毛白杨PDS(PtPDS)靶基因DNA序列后对突变效率的影响。结果发现sgRNA与靶基因间的碱基错配会导致突变的效率降低,甚至不能突变,其中3′端的碱基配对更为重要。进一步测序分析发现,该系统能同时敲除杨树基因组上两个同源的PDS编码基因(PtPDS1和PtPDS2),突变率分别达86.4%和50%。研究证明该系统可快速高效地敲除两个以上的内源基因,获得多重突变体杨树株系。利用该技术,本课题组已获得多个杨树转录因子及结构基因的敲除突变体株系,为将来开展基因功能研究和杨树遗传改良奠定了基础。     

一种改进的快速PCR定点突变技术

在基因工程与蛋白质工程研究中常常用到基因突变技术制备突变体,用于研究基因调控、蛋白质的结构与功能。本项研究在快速PCR定点突变技术的基础上,改进实验方法,简化实验步骤,以适用蛋白质结构改造研究的需要。建立的突变技术仅需一次PCR反应即可完成基因的定点突变,突变效率为79.6%左右。该法对1～3个连续碱基的突变和对间隔4个甚至多达15个碱基的数个密码子突变效果都很好。     

转拟南芥AtKup1基因高含钾量烟草获得

提取拟南芥幼根总RNA,进行RTPCR逆转录,产物测序,将其构建到含Km(带内含子)筛选标记的植物双元表达载体上,根癌农杆菌介导法将AtKup1基因导入烟草,对转化子进行PCR扩增、GUS染色、Southern杂交和AtKup1基因mRNA荧光定量PCR分析,并进行烟叶内在成分化验分析。PCR获得2100bp左右扩增产物,测序结果证实扩增产物序列与拟南芥AtKup1基因(GenbankNo:AF029876)一致;得到GUS染色阳性的AtKup1基因转化烟草材料29株。经PCR扩增、分子杂交检测证实AtKup1基因已整合到转基因烟草的基因组,荧光定量PCR分析可以在幼根中检测到AtKup1基因的mRNA转录。烟叶含钾量化验结果表明导入的AtKup1基因在转化材料中成功表达,使烟叶含钾量提高约45%。     

兽疫链球菌中与透明质酸合成相关新基因的高通量筛选及克隆

【目的】兽疫链球菌(Streptococcus equi subsp. zooepidemicus)中透明质酸主要的生物合成途径和相关基因已经被研究得比较透彻,探究一种挖掘与透明质酸合成相关新基因的策略。【方法】利用自杀质粒pSET4s::sacB在宿主基因组中的随机整合作用,筛选具有表型差异突变菌株构建突变体库,进一步利用连接介导PCR (Ligation mediated PCR,LM-PCR)方法和全基因组重测序,检测质粒整合位点,通过基因无痕敲除和回补实验验证插入位点。【结果】构建了包含150株具有表型差异突变株的突变体库;以荚膜合成能力缺失的1号突变株(M1)作为基础研究对象,检测到自杀质粒整合到基因组458 960位点上,破坏了编码塔格糖-6-磷酸激酶的lacC基因;无痕敲除lacC基因得到ΔlacC,表型分析发现ΔlacC表现为粘性荚膜特性;进一步全基因组重测序发现,除了lacC基因位点存在插入突变,206 613位点存在碱基G缺失,导致编码透明质酸合成酶的hasA基因发生移码突变,且回补hasA基因后,M1恢复粘性荚膜合成能力。【结论】M1突变株粘性荚膜合成能力的缺失由hasA基因功能缺失引起,与lacC基因功能缺失无关。初步建立了兽疫链球菌中高通量筛选与透明质酸合成相关新基因的策略,为今后挖掘新基因奠定了基础。     

应用LNA-PCR法检测乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药位点基因突变

目的:建立简便、快速、灵敏的锁核酸(locked nucleic acid,LNA)探针实时荧光聚合酶链反应(PCR)检测方法,检测乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)阿德福韦酯(Adefovir dipivoxil,ADV)耐药相关位点(rtA181V、rtN236T)突变。方法:通过基因测序筛选阳性样本,进而构建ADV rt181和rt236位点野生株和突变株重组质粒,设计包含扩增阿德福韦酯rtA181V和rtN236T耐药位点在内的特异性引物和LNA荧光探针,以构建的重组质粒为标准品建立实时荧光PCR反应体系,并通过与基因测序平行检测血清样本以判断检测方法的可行性与准确性。结果:所建立的LNA-PCR法能够检测102copies/ml的HBV中ADV基因突变,同时具备较高的特异性。通过对89例ADV治疗一年后HBV阳性临床样本进行检测,有8例(8.98%)rtA181V突变、5例(5.61%)rtN236T突变、2例(2.24%)rtA181V和rtN236T混合突变,检测结果与测序结果一致。结论:所建立的LNA-PCR法是一种简便、快速、灵敏的基因突变检测方法,能有效的区分单碱基突变,对慢性乙型肝炎患者德福韦治疗过程中耐药突变的监控和抗病毒药物的调整具有指导意义。     

利用基于CRISPR-Cas9 的基因编辑技术对miR-29a在GT1-7 细胞中进 行基因敲除

目的:本文利用CRISPR-Cas9技术在GT1-7细胞中对miR-29a基因进行基因编辑,用于构建miR-29a基因敲除GT1-7细胞模型。方法:通过构建Cas9稳转的GT1-7细胞株并转染sgRNA质粒用于在靶向miR-29a基因区域引发突变。然后构建EGFP与sgRNA共表达质粒并转染Cas9稳转GT1-7细胞,利用流式细胞仪富集表达绿色荧光蛋白的阳性细胞和分选阳性单克隆细胞。最后利用实时荧光定量PCR(realtimefluorescencequantitativePCR)对富集细胞和单克隆细胞进行miR-29a表达量检测。结果:T7E1检测结果显示CRISPR-Cas9系统有效地在miR-29a基因区域引发了突变。荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,富集后阳性细胞miR-29a的表达量整体下降了50%左右(P0.05)。此外,通过流式筛选获得了一个纯合miR-29a基因敲除细胞克隆,与对照组相比,其miR-29a的表达量下降了75%左右(P0.05)。结论:本文建立了一种有效编辑GT1-7细胞基因的方法,并采用该方法构建了miR-29a稳定敲除细胞模型。