表达猪细小病毒VP2蛋白的重组猪伪狂犬病毒在小鼠体内的免疫反应

为了研制出能够同时预防猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)和猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)的二联活疫苗,本研究将PPV VP2基因克隆到伪狂犬病毒通用转移质粒pG中,构建重组伪狂犬转移质粒pGVP2。利用脂质体转染法将重组质粒pGVP2和PRV HB98弱毒株DNA共转染至猪睾丸(ST)细胞,使其在ST细胞内发生同源重组,经5次绿色荧光空斑纯化重组病毒rPRV-VP2。分别用重组病毒rPRV-VP2、亲本PRV HB98弱毒株、商品化PPV灭活苗和DMEM细胞培养液免疫6周龄雌性昆明小鼠,2周后进行二免。一免后第7周用PRV强毒NY株对小鼠进行攻毒。结果获得表达VP2基因的重组病毒rPRV-VP2,经ELISA试验、血清中和试验(SN)、血凝抑制试验(HI)和流式细胞检测发现,重组病毒rPRV-VP2株可有效刺激小鼠机体产生抗PPV和PRV抗体,同时具有增强小鼠机体细胞免疫反应的能力,且对PRV强毒攻击具有保护作用。结果表明,重组病毒rPRV-VP2可作为同时预防PPV和PRV感染的重组疫苗候选株。     

新培斯病毒介导的病原体疫苗研制现状

新培斯病毒引起的新培斯热是一种自然疫原性疾病。该病毒可诱导感染的宿主产生细胞、体液和黏膜免疫应答,通过分子生物学技术可改造为理想的疫苗载体,从而表达病毒、寄生虫和细菌等病原体的多种蛋白抗原。这些病原体包括汉城病毒、拉克罗斯病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、风疹病毒、狂犬病毒、伪狂犬病毒、口蹄疫病毒、丙型肝炎病毒、麻疹病毒、Ⅰ型人类免疫缺陷病毒、日本脑炎病毒、传染性胃肠炎病毒、单纯疱疹病毒1型、刚地弓形虫、约氏疟原虫、埃及伊蚊、结核分枝杆菌和炭疽杆菌等。本文简要综述新培斯病毒介导的病原体疫苗研制现状。     

伪狂犬病毒神经传导研究

伪狂犬病毒对神经系统的传导具有跨突触传导、自我复制和宿主范围广等特性,自20世纪70年代起,便开始运用于神经解剖学研究领域。四十年的应用实践使伪狂犬病毒神经传导有了许多新的进展,无论是在病毒神经传导机理上,还是在传导应用中。伪狂犬病毒神经传导机理,着重于阐释病毒对初级神经细胞的侵染过程和对次级神经细胞的传导方向;传导应用则着重于探索新的神经传导毒株和对病毒传导技术进行革新。目前,伪狂犬病毒神经传导理论和应用尚有许多未知的领域需要研究,结合分子生物学技术的探索会使神经传导研究事半功倍。     

伪狂犬病毒跨突触示踪视觉系统神经网络的研究进展

伪狂犬病毒（PRV）作为一种亲神经性的病毒,它以其自我复制、跨突触、特异性传递的三大优势在揭示神经系统中功能性神经元之间的连接发挥着重大的作用。经基因重组后的伪狂犬病毒不但继承了原有病毒的优势,同时还延伸出其他特异性的功能,如重组后加入了荧光蛋白的伪狂犬病毒在视觉系统神经通路的研究中发挥了重要作用。本文就目前伪狂犬病毒跨突触示踪视觉系统神经网络中的研究做一综述。     

猪2型圆环病毒ORF1与ORF2基因和伪狂犬病毒基因的重组与表达的研究

根据GenBank发布的猪2型圆环病毒(PCV2 )序列(AY0 35 82 0 ) ,设计两对特异性引物,采用PCR方法,分别扩增了猪2型圆环病毒ORF1和ORF2基因。将ORF1和ORF2基因的PCR产物回收并酶切后,依次插入到伪狂犬病毒gE gI双缺失通用转移载体pIECMV中,构建了猪2型圆环病毒_伪狂犬病毒重组中间转移质粒pIEORF1-ORF2。采用脂质体介导法,将重组中间转移质粒pIEORF1_ORF2与伪狂犬病毒TK^- gE^- LacZ⁺ 基因组共转染IBRS_2细胞,待发生细胞病变后收集病毒液进行空斑纯化,利用检测PCV2ORF1基因和ORF2基因的PCR方法筛选重组病毒TK^- gE^- gI^- ORF1-ORF2⁺ ,用Southernblotting鉴定重组病毒,并用Westernblotting检测ORF1_ORF2融合蛋白的表达情况,在此基础上也测定了重组病毒在不同细胞上的增殖滴度。结果表明,外源基因ORF1和ORF2已成功插入到TK^- gE^- LacZ⁺ 亲本株的基因组中,并获得了表达,表达的蛋白可与PCV2阳性血清发生反应。同时发现ORF1和ORF2基因的插入不影响重组病毒的增殖特性,其毒力与亲本株相当。     

猪圆环病毒2型－细小病毒－伪狂犬重组病毒免疫小鼠试验研究

为了研究表达猪2型圆环病毒ORF2基因和猪细小病毒VP2基因的重组伪狂犬病毒疫苗株SA215(D)的疫苗价值,对该病毒株安全性、免疫原性、保护力及对PRV Fa株定值进行了研究。研究结果表明重组病毒SA215（D）毒力显著低于PRV Fa强毒株,可以抵御伪狂犬病强毒Fa株的攻击,并能抵御其在小鼠体内的定植;抗体检测显示SA215（D）免疫小鼠后第2周抗PRV、PCV2和PPV的抗体水平均很低,加强免疫后第4周抗体水平大幅上升,且显著高于阴性对照组,而与阳性对照组无明显差异,表明SA215（D）可诱导小鼠产生体液免疫反应。淋巴细胞增殖试验显示SA215（D）可诱导小鼠产生较强的淋巴细胞增殖反应,与亲本株SA215组相比,差异显著(0.01     

斑点免疫金渗滤法同时检测猪瘟和猪繁殖与呼吸综合征抗体的研究

在猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征单重斑点免疫金渗滤法的基础上,建立能同时检测HC和PRRS的双重斑点免疫金渗滤法。将提纯的HC和PRRS抗原同时包被在硝酸纤维膜上,利用胶体金标记SPA显色,当猪血清中含有HC、PRRS抗体时,则相应的点会显现红色(呈红色斑点),结果易于判断。且操作简单,耗时短,与猪细小病毒、口蹄疫和猪伪狂犬病毒阳性血清不发生交叉反应。     

快速检测伪狂犬病毒荧光定量PCR技术建立及应用

以伪狂犬病毒(PRV)保守的gE基因序列为参考,设计、优化出一对特异的PCR引物和一条TaqMan荧光探针,结合RotorGene检测系统,建立一种快速定量检测伪狂犬病毒的荧光定量PCR技术。该方法线形范围为1.0×102-1.0×107拷贝/μL,灵敏度达102拷贝/μLDNA,比常规PCR高10倍。检测的特异性明显高于常规PCR,同时避免了常规PCR因电泳造成的污染。应用该技术检测66例猪组织或鼻咽拭子样品,阳性42份,阳性检出率为63.6%(42/66)。与病毒分离培养、常规PCR相比较结果显示,该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好和能定量检测等优点,该方法可用于猪场PRV感染的快速定量检测和肉类食品进出口检疫。     

快速检测伪狂犬病毒荧光定量PCR技术建立及应用

以伪狂犬病毒(PRV)保守的gE基因序列为参考,设计、优化出一对特异的PCR引物和一条TaqMan荧光探针,结合RotorGene检测系统,建立一种快速定量检测伪狂犬病毒的荧光定量PCR技术.该方法线形范围为1.0×102-1.0×107拷贝/μL,灵敏度达102拷贝/μLDNA,比常规PCR高10倍.检测的特异性明显高于常规PCR,同时避免了常规PCR因电泳造成的污染.应用该技术检测66例猪组织或鼻咽拭子样品,阳性42份,阳性检出率为63.6%(42/66).与病毒分离培养、常规PCR相比较结果显示,该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好和能定量检测等优点,该方法可用于猪场PRV感染的快速定量检测和肉类食品进出口检疫.     

共表达PCV2 ORF2和猪IL-18基因的重组猪伪狂犬病毒对小鼠的免疫原性

【目的】研制猪伪狂犬病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的二联活疫苗,并用猪IL-18作为免疫佐剂。【方法】将猪IL-18基因插入到质粒p GO中,获得的重组转移质粒p GO18与猪PRV弱毒HB98株DNA共转染ST细胞,并进行空斑筛选和纯化;RT-PCR和Western blot分别从转录和蛋白水平鉴定其表达情况。将重组病毒PGO18和PGO、PRV弱毒株HB98、PCV2灭活商品苗和1640细胞培养基分别免疫6周龄雌性昆明小鼠,4周后二次免疫,二免后4周用PCV2 DF强毒和PRV Min/A强毒接种小鼠。通过ELISA、血清中和试验和流式细胞术及攻毒保护试验评价重组病毒的免疫原性。【结果】获得了重组病毒PGO18,并且可在ST细胞内表达;PGO18可诱导小鼠机体产生PCV2的ELISA和PRV的中和抗体水平,刺激CD3+、CD4+、CD8+T细胞亚群的增殖,且能有效抵抗PCV2和PRV强毒攻击。【结论】IL-18基因可增强重组病毒的免疫效果,使重组病毒具有良好的免疫原性,有望成为防治PCV2和PRV的候选疫苗株。     

猪细小病毒LDR-PCR检测方法的建立和应用

为准确特异灵敏地检测猪细小病毒(PPV),建立一种新的LDR-PCR方法。首先在病毒的保守区内设计一对LDR探针,LDR探针两端各连有一段引物对应序列,以连接产物为模板进行PCR,琼脂糖凝胶电泳检测结果。以标准质粒为模板,通过对LDR反应的退火温度、连接酶浓度及探针浓度等反应条件进行优化,确定了LDR最佳的反应体系,并建立了LDR-PCR方法。结果表明,可以特异地检测PPV,与猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)无交叉反应;最低检测限为102个拷贝。利用建立的方法对41例临床样本进行检测,14份样品PPV阳性,与普通PCR检测结果符合率为97.6%。     

应用生物素标记DNA探针检测伪狂犬病病毒的研究

应用生物素标记ＤＮＡ探针检测伪狂犬病病毒的研究王琴,郭万柱,阴文奇（四川农业大学动物科技学院,四川雅安,６２５５０１４）关键词伪狂犬病毒,核酸,杂交,检测核酸杂交技术已广泛用于检测畜禽疱疹病毒和其它动物病毒,已报道ＰＲＶ－ＤＮＡ的探针方法有ＲＮＡ－Ｄ...     

猪圆环病毒2型的PCR检测方法应用

本研究登录Genbank对猪圆环病毒2型基因的序列进行分析,用Primer 5.0设计了ORF2基因的扩增引物,试图选择一种比较合理的PCR方法检查PCV2感染的病原,以期这种PCR方法可以有效分析猪综合征障碍病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒的扩增(HCV)、猪伪狂犬病毒(PRV)等比较常见的病原。研究结果表明,在PCV2进行扩增阳性样品检测中,发现一条异常447 bp的DNA条带,对产物测序结果进行扩增分析,证明其是PCV ORF2基因序列。敏感性检验分析表明检测样本DNA浓度时达到了9.8×10^-4ng/μL。PCR实验具有良好的稳定性和重复性。根据对66例临床病猪的分析表明,在PCV2的检测中阳性感染率是27.26%,这可能受到HCV、PRRSV、PRV、PPV等多种病毒的感染,其中混合感染的比例达到了72.23%。     

口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及检测应用

用纯化的口蹄疫病毒(Footandmouthdiseasevirus,FMDV)免疫BALB/C小鼠,将免疫鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,采用有限稀释法进行克隆,经筛选获得多株能稳定分泌抗FMDV单抗的杂交瘤细胞株。选择其中一株(2G12)用于下列实验,其细胞培养上清液的效价是1:256,腹水效价是1:1280;以自行制备的兔抗FMDV高免血清IgG为捕获抗体包被酶联免疫吸附试验微量反应板,以单抗2G12为第二抗体,建立了快速检测FMDV抗原的双抗体夹心ELISA,该方法能检出90ng病毒,而且只与FMDV发生特异性反应,与猪瘟病毒(HCV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和乙脑病毒(JEV)均不发生反应。本研究为检测口蹄疫病毒抗原提供了灵敏和特异的方法。     

伪狂犬病毒固有免疫逃避机制

伪狂犬病毒能引起多种动物伪狂犬病,严重威胁养殖业发展。尤其自2011年新毒株在我国的大面积流行,使伪狂犬病的防控研究再次成为兽医学和病毒学的热点。其中,伪狂犬病毒介导的固有免疫逃避机制是其防控困难的重要原因,对于这一问题的探讨将有助于新疫苗和特效治疗药物的研发。因此,本文旨在对伪狂犬病毒固有免疫逃避机制的研究进展进行综述,为伪狂犬病的有效防控提供理论指导。     

美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光重组酶聚合酶扩增技术（RPA）检测方法的建立及其应用

美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）在我国出现了多种基因亚型毒株混合流行和重组的复杂变化，其引起的猪繁殖与呼吸综合征（PorcineReproductiveand Respiratory Syndrome,PRRS）已成为危害程度仅次于非洲猪瘟的重要疫病。为建立一种快速而敏感性高的美洲型PRRSV检测方法，本研究分析了国内美洲型全基因组序列，利用重组酶聚合酶扩增技术（Recombinase Polymerase Amplification,RPA），设计合成特异性引物和探针，优化反应体系和条件，建立美洲型PRRSV实时荧光RPA检测方法，通过特异性、敏感性、重复性试验及田间样品的比对检测，评价该方法的检测能力，并测定和分析了田间阳性样品的ORF5基因序列。结果显示，该方法在42℃、20 min内即可完成检测，最低检测美洲型PRRSV载量为50拷贝/μL，且与欧洲型PRRSV、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、塞内卡病毒、非洲猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒、猪流行性腹泻病毒无交叉反应，特...     

伪狂犬病毒立即早期基因5’端特异性反义RNA对病毒增殖的影响

伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)属疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科,基因组为线状双链DNA,长约150kb,至少可编码70～100种蛋白质。根据伪狂犬病毒感染细胞后DNA转录、表达时间的先后可将PRV基因分为立即早期基因(Immediateearly gene),早期基因(Early gene)和晚期基因(Late gene),这三类基因依此以级联方式调节。     

猪细小病毒单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备猪细小病毒（PPV）杂交瘤细胞株,并对其分泌的PPV单克隆抗体进行鉴定。方法按常规方法制备并获得2株杂交瘤细胞。用染色体分析对杂交瘤细胞进行鉴定,用间接ELISA、免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）和间接免疫荧光试验（IFA）对其分泌的单克隆抗体进行效价测定、亚型鉴定和特异性鉴定。结果得到2株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株2H9、1F9,染色体数目介于90～110之间。细胞上清效价均达1∶1×104,腹水效价均达1∶1×107,其亚型分别为IgG1、IgM,均为kappa链。2H9、1F9单抗与猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒I型（PCV-1）、猪圆环病毒Ⅱ型（PCV-2）、乙脑病毒（JEV）等均无交叉反应。IPMA和IFA检测结果显示2H9、1F9单抗均能与接种于PK-15细胞的PPV发生特异性反应。结论成功制备了2株抗PPV杂交瘤细胞株,证实其产生的单克隆抗体具有良好的特异性和敏感性。     

西藏小型猪10种猪病血清学调查

目的对西藏小型猪进行10种猪病（猪瘟、伪狂犬病、篮耳病、猪流感、圆环病毒感染、细小病毒病、乙型脑炎、弓形体病、衣原体病和布氏杆菌病）的血清学调查。方法采用ELISA或凝集试验方法对10头已注射猪瘟疫苗的原代（F0代）母猪和40头20日龄乳猪、50头第一代（F1代）3～5月龄猪进行10种猪病的血清学检测。结果猪瘟病毒、细小病毒和乙型脑炎病毒抗体阳性率分别是母猪为80.0%、80.0%、70.0%;20日龄乳猪为45.0%、25.0%、45.0%;3～5月龄猪为4.0%、76.0%、80.0%。圆环病毒抗体阳性率母猪为60.0%,20日龄乳猪为5.0%。3～5月龄猪为0%;篮耳病病毒、伪狂犬病病毒、猪流感病毒、弓形体、衣原体、布氏杆菌在不同年龄西藏小型猪中抗体阳性率均为0%。结论不同年龄西藏小型猪未受篮耳病病毒、伪狂犬病病毒、猪流感病毒、弓形体病、衣原体病、布氏杆菌病感染。     

猪源胰酶中特异病毒和非特异病毒安全检测

目的:对猪源胰酶样品进行病毒检测,以评价其病毒安全性。方法:非特异性病毒检测采用致细胞病变、血凝吸附试验和形态学检测方法;特异性病毒检测包括猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)、猪口蹄疫病毒(FMDV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)特异性核酸检测,以及CSFV、PPV、PRV特定性抗原蛋白直接免疫荧光检测。结果:受检样品非特异性病毒检测中,未见可观察到的细胞病变产生和病毒粒子,对豚鼠、鸡和人的O型红细胞无凝集现象。特异性病毒检测中,PRRSV、CSFV、PCV、PPV、FMDV和PRV核酸检测均为阴性,CSFV、PPV、PRV免疫荧光检测均为阴性。结论:猪源胰酶样品经非特异性病毒检测和特异性病毒检测均无可检出的病毒存在。