芒果胶孢炭疽病菌应答菌丝机械损伤产生无性孢子的分子机制

胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)是引发芒果(Mangifera indica)炭疽病的主要病原体。室内平板培养胶孢炭疽菌不产生或产生很少分生孢子的情况时有发生, 但菌丝在机械损伤后24-48小时会产生大量分生孢子。胶孢炭疽菌应答机械损伤诱导产孢的核心基因及关键代谢通路尚未见报道。基于转录组测序(RNA-seq)技术检测了芒果胶孢炭疽菌菌丝在机械损伤处理后2小时内5个时间点的基因表达变化, 对差异表达基因进行GO富集和KEGG代谢通路富集分析, 并对菌丝响应胁迫的基因动态表达数据进行分析。基于常微分方程ODE模型结合变量选择技术, 构建了动态基因调控网络。结果表明, 有417个差异表达基因参与应答胶孢炭疽菌菌丝机械损伤, 分属12个聚类模块, 有4条通路存在显著富集, 分别是丙酮酸代谢、硫代谢、黄曲霉素合成途径和二萜合成途径。结合功能注释筛选出12个应答菌丝损伤胁迫的核心基因。研究结果为后续深入开展芒果胶孢炭疽菌产孢和致病机理研究奠定了重要基础。     

胶孢炭疽菌热休克蛋白基因Cghsp90的RNAi突变体获得与功能分析

为揭示胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)热休克蛋白基因Cghsp90在抗逆境胁迫中的功能,利用RNAi技术结合PEG介导的原生质体转化方法,获得了Cghsp90的RNAi突变体菌株,经实时荧光定量PCR (qRT-PCR)对野生型菌株和突变体菌株间Cghsp90基因差异表达分析以及NaCl、H_2O_2、SDS、Congo Red、18℃(Cold)和33℃(Hot)等非生物胁迫条件下野生型菌株和突变体菌株的胁迫耐受性分析。通过特异性引物检测鉴定、qRT-PCR分析,获得Cghsp90的RNAi突变体pSilent-1:Cghsp90-1和pSilent-1:Cghsp90-2;与野生型菌株相比,侵染过程中Cghsp90基因的表达量显著低于野生型菌株,8个致病相关基因显著下调表达;突变体菌株的产孢量下降、分生孢子畸形、萌发率下降;在非生物胁迫条件下,突变体菌株较野生型菌株更为敏感;在胶孢炭疽菌的分生孢子中研究Cghsp90基因的形态建成与萌发,对应变逆境胁迫以及调控致病相关基因等方面发挥重要的作用。     

橡胶树胶孢炭疽菌NADPH氧化酶功能研究

由病原真菌胶孢炭疽菌引起的炭疽病害是造成海南省橡胶减产的主要原因之一。研究橡胶树胶孢炭疽菌致病力的分子机制能为其病害防治提供理论依据。采用同源重组原理、运用原生质体转化法构建了橡胶树胶孢炭疽菌NADPH氧化酶编码基因的敲除突变株,并对其生长发育及致病力等生理表型进行分析。结果表明,在橡胶树胶孢炭疽菌中,存在3个编码NADPH氧化酶的基因CgNoxA、CgNoxB、CgNoxC,以及一个编码NADPH氧化酶调节蛋白的基因CgNoxR。PCR分析表明成功构建了这4个基因的敲除突变株。与野生型菌株相比,这4个敲除突变株的产孢能力、致病力均有不同程度的变化。其中CgNoxA敲除突变株的产孢能力严重受损;CgNoxR敲除突变株的孢子萌发过程明显异常;CgNoxB敲除突变株对橡胶树叶片的致病力显著下降。染色观察表明,CgNoxA和CgNoxB参与调控胶孢炭疽菌菌丝中超氧阴离子代谢过程。上述结果表明,NADPH氧化酶在调控胶孢炭疽菌的孢子萌发及致病力过程中起着重要作用。     

芒果炭疽菌研究进展

芒果炭疽病是芒果生长期和采后贮藏期的主要病害之一,严重影响芒果的产量和品质。本文从芒果炭疽病的症状、病原菌分类鉴定、生物学特性、侵染特性及致病机理等方面进行综述;针对芒果炭疽病症状复杂、我国芒果炭疽病病原菌未获详细而系统的研究,指出全面了解我国芒果炭疽病的病原菌种类及优势种群,明确我国芒果炭疽菌的致病力强弱,有助于研究该病的发生流行规律,为抗病材料的选育和抗病品种在田间的合理布局提供参考。提出对我国芒果炭疽菌的抗药性进行系统监测分析,可防止或减缓芒果炭疽菌对杀菌剂抗药性的产生,从而有效减少化学农药的用量,为研究芒果炭疽病绿色防控新策略、新方法和新药剂奠定基础。     

利用GFP表达系统检测球孢白僵菌侵染昆虫过程

绿色荧光蛋白(GFP)作为一种重要的报告基因,在病原菌和寄主之间的互作研究中具有良好的应用前景。利用草丁膦抗性基因bar为筛选标记,构建了组成性表达绿色荧光蛋白基因egfp的载体pBG,并转入球孢白僵菌获得成功表达。将转化子接种菜青虫进行生物测定表明,组成性表达egfp不影响球孢白僵菌的毒力。进一步利用冰冻切片和荧光显微观察技术监测球孢白僵菌侵染寄主行为,结果显示,通过荧光观察可清楚的检测到病原菌在昆虫体表的附着、菌丝穿透体壁以及菌丝从寄主体内长出等侵染过程。由此表明,GFP可有效用于球孢白僵菌的遗传标记,进行病原菌的鉴别、侵染致病机理及相关功能基因的表达模式研究。     

玫烟色棒束孢(Isaria fumosorosea)侵染小菜蛾的表达谱分析

【背景】昆虫病原真菌对寄主的侵染是一个十分复杂的过程,是多基因共同作用的结果。玫烟色棒束孢(Isaria fumosorosea) IFCF01菌株对小菜蛾具有很高的致病力,然而有关玫烟色棒束孢对小菜蛾致病的相关基因少见报道。【目的】筛选玫烟色棒束孢侵染小菜蛾相关基因,为更好地利用玫烟色棒束孢防治小菜蛾提供基因靶点。【方法】采用第二代高通量测序技术RNA-Seq,对玫烟色棒束孢侵染小菜蛾2–3龄幼虫4、8、12、16、24、30、36 h的虫菌混合样品(处理组)及纯培养玫烟色棒束孢(对照组)进行测序分析并筛选差异表达基因,结合生物信息学方法分析差异基因涉及的功能模块和信号通路。【结果】玫烟色棒束孢侵染小菜蛾混合样品与纯培养玫烟色棒束孢对照组对比分析共获得28 384个差异基因,其中显著差异表达基因274个,上调表达118个,下调表达156个。筛选获得的显著差异表达基因,特别是上调表达基因可能与玫烟色棒束孢对小菜蛾的侵染有关。GO二级分类显示,差异表达基因能够注释到36个GO条目中,包含18个生物学过程、9个细胞组分和9个分子功能。KEGG通路分析显示共有171个差异表达基因(differentially expressed gene,DEG)注释到132个通路中,其中有66个DEG显著富集在14个通路中。这些显著差异表达基因中大部分为玫烟色棒束孢侵染过程中潜在致病毒力相关基因。【结论】本研究为筛选玫烟色棒束孢侵染小菜蛾致病相关基因提供重要数据库,也为阐明玫烟色棒束孢对小菜蛾的侵染机制提供基础。     

胶孢炭疽菌的种内遗传多样性研究*

应用RAPD分析对广东不同果树上的胶孢炭疽菌的种内遗传多样性进行研究。结果表明:除部分芒果上的菌株外,20个来源于不同果树上的胶孢炭疽菌都以较高的相似系数聚为一个大群(群I)。说明尽管胶孢炭疽菌具有复合种的性质,但在一定的地理范围内,其遗传背景还是相近的,表现出种的典型特征。6个芒果菌株组成3个小群,且与群I的亲缘关系较远,其分类地位有待进一步明确。     

灰葡萄孢菌致病机理研究进展

灰葡萄孢菌能引起多种双子叶植物感染灰霉病,导致农作物减产,带来巨大的经济损失。通过对灰葡萄孢菌各种致病因子的研究,为灰霉病的有效防治提供科学依据。该文阐述了灰葡萄孢菌的重要致病因子,并分析了致病因子的致病机制。灰葡萄孢菌能以菌丝、分生孢子及菌核多种感染模式侵染植物,寄主范围十分广泛。该病原菌在侵染过程中通过信号转导途径调控与致病相关的基因和蛋白表达,产生毒素,分泌胞外水解酶,共同协同作用完成致病过程。     

酚类物质对两种潜伏炭疽菌生长和繁殖的影响

通过测定丹宁、间苯二酚、邻苯二酚、绿原酸和咖啡因,作者对潜伏侵染在香蕉果实中的芭蕉炭疽菌Colletotrichum musae(Berk & Curt)Arx和芒果果实中的胶孢炭疽菌C.gloeosporioides Penz.的分生孢子萌发,附着胞和分生孢子的形成,以及菌丝体生长的影响进行了研究。结果表明,这几种酚类物质,在一定浓度下,可抑制两种炭疽菌的生长和发育,其中邻苯二酚对芭蕉炭疽菌的作用浓度最低,而间苯二酚对胶孢炭疽菌的作用浓度最低,丹宁则对两种菌的作用浓度最高,在一定浓度下影响着附着胞的形成。     

胶孢炭疽菌寡肽转运蛋白CgOPT2的生物学功能

胶孢炭疽菌是一种病原菌,它可以引起炭疽病进而侵扰多种农作物,造成相当严重的经济损失。因此为了进一步地了解这个病菌的分子致病的机理,本研究从胶孢炭疽菌当中克隆出一个新的寡肽转运蛋白基因,并将它命名为CgOPT2,通过对生物信息学的分析我们发现这个基因编码一个990个氨基酸的蛋白,含有15个跨膜区,共同地组成了OPT结构域。为了得到此基因的敲除突变体,我们就可以采用同源重组的办法,通过把突变体还有野生型的各项进行表格的对比处理,一般来说,突变体具体表现为生长缓慢,菌丝比较稀疏而且它的疏水性增强,孢的产量低,对H_2O_2和SDS更为敏感,致病力更为减弱。通过上述的结果可以发现,CgOPT2主要参与对胶孢炭疽菌的营养发育调控,分生孢子的产生、致病性还有氧化应激反应等。     

胶孢炭疽菌C2H2型转录因子CgGcp1的生物学功能

【背景】胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)可以寄生于多种植物,侵染方式多样,能够引起严重的农业危害。在胶孢炭疽菌中,CgGcp1是一个C2H2型的转录因子,关于其生物学功能的研究未见报道。【目的】明确CgGcp1的生物学功能,为深入解析该病菌的致病机制奠定一定的理论依据。【方法】构建CgGCP1基因的敲除载体,利用同源重组得到敲除突变体。通过表型分析,包括营养生长、胁迫响应、孢子产生、附着胞形成及致病性分析等,明确该基因的生物学功能。【结果】CgGCP1基因敲除突变体生长速率较野生型减慢,对SDS、刚果红、NaCl和甘油更加敏感,孢子产量显著降低,附着胞的形成率降低且侵入能力减弱,在橡胶叶片上的致病力明显下降。【结论】CgGcp1参与调控胶孢炭疽菌营养生长、细胞壁完整性、分生孢子产生、附着胞形成与侵入和致病性。     

基于PEG介导原生质体转化构建粉红聚端孢荧光标记

粉红聚端孢是多种植物的重要病原菌。本研究通过酶解粉红聚端孢幼嫩菌丝细胞壁获得原生质体,用PEG介导原生质体转化将携带GFP基因和博来霉素抗性基因的外源DNA随机插入粉红聚端孢基因组,共获得博来霉素抗性菌株90株,转化效率达18个/μg。选取22株转化子荧光观察,发现均可表达荧光,菌株间荧光强度不同,其中10株转化子荧光表达较强。与野生型相比,突变菌株TR45的菌落生长、产孢量和致病力等生物学特性均未改变,在不含博来霉素的培养皿中继代培养10代荧光仍能稳定表达。本研究构建的高效原生质体制备和PEG介导粉红聚端孢遗传转化方法,可用于该菌基因功能研究,绿色荧光标记菌株可用于病菌侵入、田间监测、侵染循环等发生规律研究。     

胶孢炭疽菌CgRGS2基因的克隆及生物学功能

【目的】G蛋白信号调控因子(Regulators of G-protein signaling,RGS)是G蛋白的一类负调控因子,在植物病原菌生长发育及致病过程中发挥着重要的作用,然而目前还未有关于胶孢炭疽菌RGS蛋白生物学功能的研究。本试验的目的是克隆胶孢炭疽菌的一个RGS基因CgRGS2,并分析其生物学功能。【方法】利用PCR技术扩增CgRGS2的基因并进行生物信息学分析,利用同源重组的方法获得CgRGS2基因的敲除突变体,并在突变体的基础上获得互补株,通过表型分析确定该基因的生物学功能。【结果】通过PCR扩增获得了CgRGS2的基因,其编码一个574个氨基酸的蛋白,在N末端含有一个RGS功能域。该基因敲除突变体同野生型相比,表现为营养生长缓慢,气生菌丝浓密,分生孢子产量降低且孢子呈多端萌发,对氧化压力及SDS敏感,致病性减弱等。【结论】CgRGS2蛋白参与调控胶孢炭疽菌的营养生长,分生孢子产量及萌发,氧化应激反应及细胞壁完整性,对其致病性也具有一定的影响。     

尖孢镰孢菌果胶裂解酶基因家族鉴定及侵染表达模式分析

【背景】番茄枯萎病是番茄生产中常见的土传真菌病害。【目的】为鉴定番茄枯萎病基因组果胶裂解酶基因家族,明确该基因家族在侵染过程表达模式。【方法】采用生物信息学方法鉴定了番茄枯萎病尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum f. sp. Lycopersici)基因组内PEL基因家族,并分析了基因结构、染色体定位及三级结构,同时利用荧光定量PCR分析了FoPEL1-16基因在接种番茄根系的表达情况。【结果】番茄尖孢镰孢菌基因组内PEL基因家族成员有16个。氨基酸序列长度在163-548个氨基酸,信号肽长度在16-21个氨基酸。染色体定位分析表明16个基因在染色体上分布不均,分别定位在7条染色体上。根据基因结构和保守基序分析结果 16个基因可分为4类。进化分析表明该基因家族成员可聚成4支。三级结构预测结果显示同一家族存在相似结构域。荧光定量PCR分析结果表明Fo PEL基因在侵染过程表达水平明显上升。【结论】番茄尖孢镰孢菌基因组内果胶裂解酶以基因家族形式存在,其基因结构存在差异暗示了其功能多样性;FoPEL基因在侵染过程表达明显增强,说明其参与病原菌的致病性。本研究为解析尖孢镰孢菌致病基因功能分析及寄主病原互作提供了重要理论基础。     

斯氏按蚊中Toll受体参与抵抗微生物感染和调控肠道菌群稳态

【目的】Toll信号通路是昆虫天然免疫系统的重要组分,其中Toll受体在激活昆虫病原菌侵染免疫应答方面发挥了关键作用。本研究旨在探究斯氏按蚊Anopheles stephensi Toll受体基因在抵抗微生物侵染和维持肠道菌群稳态过程中的功能。【方法】根据冈比亚按蚊Anopheles gambiae Toll受体家族的蛋白氨基酸序列,通过序列同源比对鉴定斯氏按蚊中相应的Toll受体基因;运用荧光定量PCR检测Toll受体基因在未感染病原菌的斯氏按蚊脂肪体中的相对表达量,以及在真菌球孢白僵菌Beauveria bassiana和革兰氏阴性细菌胡萝卜软腐欧文氏菌Erwinia carotovora subsp. carotovora侵染斯氏按蚊过程中的表达变化;最后,在斯氏按蚊雌成蚊胸部显微注射AsToll1A和AsToll5A的双链RNA进行RNA干扰后,检测RNAi处理的斯氏按蚊受真菌侵染后的存活率、肠道细菌含量变化以及抗菌肽基因表达变化。【结果】在斯氏按蚊中共鉴定到8个Toll受体基因,即AsToll1A, AsToll5A, AsToll6, AsToll7, AsToll8, AsToll9, AsToll10和AsToll11。通过荧光定量PCR检测发现,未感染病原菌的斯氏按蚊雌成蚊脂肪体中AsToll5A表达量最高,AsToll1A表达量次之,其余Toll受体基因表达量极低。在球孢白僵菌和胡萝卜软腐欧文氏菌侵染过程中,与对照(注射PBS)比较,AsToll1A和AsToll5A在斯氏按蚊中的表达量显著升高,其余Toll受体基因表达变化不显著或降低。RNA干扰结果表明,AsToll1A或AsToll5A的表达受到抑制后,斯氏按蚊对球孢白僵菌的抵抗能力显著降低,肠道细菌总量与对照(dsGFP)比较显著增多。而且,抑制AsToll1A后抗菌肽基因DEF1和GAM1的表达受到显著抑制;抑制AsToll5A后仅有GAM1表达量下调。【结论】斯氏按蚊Toll受体在结构和功能上具有高度的保守性,其中AsToll1A和AsToll5A能响应病原真菌和革兰氏阴性细菌侵染并且影响肠道菌稳态。     

致病疫霉PiSAK1的生物学功能分析

【背景】致病疫霉是引起世界范围内马铃薯晚疫病的重要病原菌。Stress-activated protein kinases (SAPKs)是一类胁迫激活的mitogen-activated protein kinases (MAPKs)，研究表明真菌SAPKs在调控细胞应答外界胁迫等方面有重要作用。致病疫霉中存在一个SAPK，即PiSAK1，其生物学功能并不明确。【目的】探究PiSAK1在致病疫霉生长发育、抵抗外界胁迫及侵染马铃薯过程中发挥的生物学功能。【方法】利用生物信息学手段分析PiSAK1的特性，通过RT-qPCR分析明确致病疫霉PiSAK1在不同发育阶段及侵染马铃薯不同时期的表达量，最后构建PiSAK1沉默、过表达菌株并测定其各项生物学表型。【结果】PiSAK1具有丝裂原活化蛋白激酶典型的Ser/Thr蛋白激酶催化结构域，并且与其他卵菌的SAPKs同属一个进化分支。致病疫霉PiSAK1分别在休止孢阶段、侵染马铃薯48 h时表达量最高，且0.3 mol/L NaCl及3 mmol/L H2O2胁迫刺激0.5 h后PiSAK1的表达量均显著升高。构建PiSAK1沉默、过表达菌株并测...     

胶孢炭疽菌的种内遗传多样性研究

应用RAPD分析对广东不同果树上的胶孢炭疽菌的种内遗传多样性进行研究。结果表明：除部分芒果上的菌株外,20个来源于不同果树上的胶孢炭疽攻都以较高的相似系数聚为一个大群(群Ⅰ)。说明尽管胶孢炭疽攻具有复合种的性质,但在一定的地理范围内,其遗传背景还是相近的,表现出种的典型特征。6个芒果菌株组成3个小群,且与群Ⅰ的亲缘关系较远,其分类地位有待进一步明确。     

芒果炭疽病菌小柱孢酮脱水酶基因SCD1的克隆与敲除载体构建

芒果炭疽病(Colletotrichum gloeosporioides)是为害芒果的重要病害之一,为了明确小柱孢酮脱水酶基因SCD1与芒果炭疽病菌致病力之间的相互关系,本研究以芒果炭疽病菌DNA为模板,利用同源克隆技术扩增SCD1,分析其序列特征、推测了其蛋白的保守结构域,并借助In-Fusion~ HD Cloning Kit技术进行敲除载体构建。结果表明,该基因DNA和cDNA全长分别为796 bp、564 bp,编码区有两个内含子(大小为52 bp,180 bp),推测编码187个氨基酸,其分子量约为21.52 kD,等电点PI为5.90,与NCBI网站中已公布的基因进行Blastp比对,发现该序列与香蕉炭疽菌(C.musae)、无花果炭疽菌(C.caricae)(登录号:GQ266389.1,GQ266386.1)的小柱孢酮脱水酶基因相似性分别为98%和97%。该基因的敲除载体pSCDGH-1已构建成功,为下一步获得SCD1基因敲除突变体,研究该基因功能打下了材料基础。     

云南芒果采后炭疽病病原菌的鉴定及室内生防菌的筛选

随着对云南芒果需求量的增加,其种植面积日趋扩大,并不断引入新品种,这也导致云南省芒果炭疽病害发生日趋加重。为了有针对性地开展芒果炭疽病的生物防治,采用组织块分离法分离芒果采后炭疽病病原菌,通过形态学观察初步鉴定,并遵循柯赫氏法则对病原菌进行验证。随后,利用rDNA-ITS序列和系统发育树分析明确病原菌的分类学地位。最后,采用5种生防细菌对病原菌进行拮抗试验。通过对芒果采后炭疽病病原菌进行分离鉴定,确定胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)是引起云南芒果采后炭疽病的病原菌,该菌株内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列长度为536 bp,登录号为MH744668;5株生防细菌对芒果炭疽病病原菌都有一定的抑菌作用,具有较好的生防开发潜能,其中抗生素溶杆菌L-44的抑菌效果最好,抑制率达53.7%。研究结果为云南省芒果采后病害的生物防治提供了新的思路。     

纳他霉素对芒果采后胶孢炭疽菌的抑菌效果及机理

以纳他霉素为抑菌剂, 实验测定了离体条件下不同浓度纳他霉素对胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)的孢子萌发及菌丝生长的抑制效果, 以及活体损伤接种炭疽病菌后, 纳他霉素对芒果(Mangifera indica)果实炭疽病的防治效果。通过测定纳他霉素处理后胶孢炭疽菌的细胞膜相对渗透率、可溶性蛋白含量、细胞膜完整性、孢子内活性氧水平和线粒体分布情况, 初步探明其抑菌机理。结果表明, 3 mg∙L ^-1纳他霉素可显著抑制胶孢炭疽菌孢子萌发、芽管伸长和菌落生长, 80 mg∙L ^-1纳他霉素可有效抑制芒果贮存过程中果实炭疽病斑的扩展。纳他霉素处理后胶孢炭疽菌细胞膜相对渗透率和可溶性蛋白含量增加; 2 mg∙L ^-1纳他霉素处理8小时, 处理组胶孢炭疽菌孢子细胞膜损伤染色率为33.6%, 对照组染色率为13.9%; 处理组胞内活性氧产生染色率达46.9%, 比对照组高39.7%; 同时观察到纳他霉素使胞内线粒体分布不均且荧光信号微弱。以上结果表明, 纳他霉素可以破坏胶孢炭疽病菌细胞膜, 诱导活性氧大量积累, 并降低线粒体活性, 从而干扰菌体正常生理活性, 使其代谢活动受影响, 从而达到抑菌目的。