Taqman多重实时荧光PCR同步定量检测6种动物源性成分方法的建立

旨在建立一种可同时检测猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅6种动物源性成分的六重实时荧光定量PCR方法。根据猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅细胞核基因组保守序列,参照序列比对结果选择差异位点设计6对特异性引物和6条以不同荧光素标记的Taqman探针。通过对PCR反应体系和反应条件的优化筛选,建立能同步定量检测猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅源性成分的六重实时荧光PCR方法。应用此方法分别对18种不同源性动物DNA和200份不同来源样品进行猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅源性成分检测,结果表明,所建立的六重实时荧光PCR方法灵敏度高,对六种动物的最低核酸检测量分别为0.049ng、0.048ng、0.085ng、0.13ng、0.162ng、0.074ng(50μl体系);特异性强,对狗、兔、鼠、驴、马、骆驼等其他12种动物无特异性扩增;200份样品的检测结果表明六重qPCR检测方法敏感,同一反应体系下实现一次对6种动物快速定量检测,耗时短、效率高、适用性广,可用于肉品、奶品、皮毛和饲料等动物产品猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅源性成分单一或混合物种的鉴别诊断。     

基于实时荧光PCR定量检测肉制品猪源性成分方法的建立

为了建立肉制品中猪源性成分检测的PCR方法,以猪线粒体细胞色素b(cytochrome b,Cyt b)为目的基因,设计猪特异性PCR引物;以猪、牛、羊、鸡及鸭DNA和不同稀释浓度猪DNA进行Real-time PCR反应,证明了该引物扩增具有物种特异性,检测低限可达5×10-5 ng/μL;设计内参基因β-actin通用引物,以猪源性成分含量0%~100%的混合肉样DNA为模板扩增,建立标准曲线,2-△△Ct值与猪源性成分含量有良好线性关系(R2=0.991 4);对猪源性成分含量0%~75%的混合肉样检测,回收率为99.85%~102.60%。应用建立的PCR方法检测了市售的6种品牌火腿肠,标识为清真食品的5种均未检测到猪源性成分,未标识清真食品的猪源性成分含量为12.70%。建立的实时荧光PCR检测方法操作简便、特异性强、所得数据可靠,为肉制品猪源性成分检测提供了新的手段。     

多重实时荧光PCR检测牛、山羊和绵羊源性成分

根据牛、山羊和绵羊线粒体细胞色素b基因序列, 设计特异性引物和以不同荧光素标记的Taqman探针。通过对PCR反应体系和反应条件的优化筛选, 建立能同时鉴别牛、山羊和绵羊源性成分的多重实时荧光PCR方法。采用本文方法与国标GB/T 20190-2006方法分别对17种不同源性动物DNA和200份不同来源样品DNA进行牛羊源性成分检测, 数据显示两者检测结果符合率达100%, 特异性相当。与国标方法相比, 本试验方法不需电泳、酶切和测序, 即可在一个PCR反应中同时鉴别检测牛、山羊和绵羊3种源性成分, 检测效率提高近3倍; 灵敏度更高, 比国标方法灵敏10倍; 适用性更广, 除了饲料, 还适用于肉品、奶品、生皮和动物油脂等动物产品的牛羊源性成分检测。     

双重荧光定量PCR检测志贺毒素stx1和stx2基因

目的建立一种双重荧光定量PCR检测志贺毒素stx1和stx2基因的方法。方法根据不同细菌来源的stx1和stx2序列,设计PCR引物和TaqMan探针,建立双重实时荧光定量PCR检测体系,进行灵敏度、特异性和重复性评价,并对腹泻患者粪便样本进行检测分析。结果双重实时荧光定量PCR检测含志贺毒素基因重组质粒的最低检测下限为102 copies/mL;该法对12种常见肠道病原菌均无特异性扩增,对不同浓度的标准质粒检测重复性高,Ct值变异系数均小于10%;对急性腹泻粪便标本的检测阳性率高于细菌分离培养。结论建立的双重实时荧光定量PCR可作为不同细菌来源的志贺毒素基因的快速鉴定方法,亦可用于人感染性腹泻标本的快速筛查。     

羊肉掺假鉴别快速荧光定量PCR芯片制备及应用研究

为了建立一种基于芯片的快速鉴别羊肉掺假成分的方法,将不同动物源性成分的引物及反应所需试剂预先冻干固定到空白芯片反应池内,以制备羊肉掺假鉴别快速荧光定量PCR芯片。同时,通过模拟掺假样品（在羊肉中掺入猪肉、鸡肉、鸭肉、鼠肉成分）检测实验,对所得芯片的性能进行了评价。从与ABI7500荧光定量PCR结果对比可知,基于芯片的快速荧光定量PCR检测方法可以准确检测5种动物源性成分,具有较高的准确性及可用性,且其PCR扩增时间较短,操作简单,满足了羊肉掺假快速鉴别的要求。该芯片的研制及快速检测方法的建立将有效的简化羊肉制品掺假检测的步骤、缩短检测时间,且成本较低,仪器便于携带,使现场检测成为可能。研究结果为我国肉类食品安全监管提供了有力保障。     

鳕鱼成分的实时荧光PCR检测方法

研究建立了鳕鱼成分的实时荧光PCR检测方法。依据鳕鱼的16S rRNA基因序列设计一对PCR引物及探针,对12种鳕鱼样品和71种非鳕鱼动植物样品进行实时荧光PCR检测,结果显示,只有12种鳕鱼样品产生荧光信号,其他非鳕鱼样品均不产生荧光信号,实验表明此方法具有特异性,其检测限为0.01 ng/μl鳕鱼DNA和0.01%鳕鱼肉粉。对市售的鳕鱼样品进行实际样品检测,均能很好地检出鳕鱼成分。此法特异性强,灵敏度高,可作为鳕鱼成分鉴定的检测方法。     

应用实时荧光PCR技术定性定量检测改良品质的转基因小麦

目的:对转入高分子量谷蛋白亚基的小麦中转基因成分进行实时荧光PCR定性定量检测。方法:针对转基因小麦品系中通用的ubiquitin启动子,NOS终止子以及标记基因bar基因进行定性筛选检测,同时用已知为单拷贝的Wx012基因作为小麦物种内源特异参照基因,用单粒B73转基因小麦提取基因组DNA建立内源基因和外源基因的标准曲线,对转基因小麦样品A进行定量检测,同时优化实时荧光PCR条件反应条件。定量检测结果为5.35%。结果:研究的实时荧光PCR技术对转基因小麦中转基因成分能够快速准确地进行定性定量检测。     

双重数字PCR在转基因大豆检测中的应用

利用微滴式数字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)平台建立针对MON87705、MON87769、DP356043三种转基因大豆中外源基因的双重PCR检测方法。利用双重数字PCR方法检测特异性、定量范围等参数,优化所用引物探针组合及实验体系程序,检测外源基因与内标准基因的拷贝数。结果表明,所用引物探针组合在数字PCR方法中仅对目标大豆品系有荧光信号,具有特异性,可用于转基因大豆品系的筛选与鉴别。检测了大豆的转基因成分含量,结果与材料标准品参数基本一致,并根据结果设定定量检测限为0.5%,定性检测限为0.05%,可满足低纯度样品检测的需求。双重数字PCR体系能够准确且稳定的满足实际检测需要,在实际应用上具有良好的发展前景。     

饲料中狐狸、水貂、貉子和狗源性的五重实时荧光PCR检测方法的建立

为了快速鉴别饲料中的狐狸、水貂、貉子和狗源性成分,根据线粒体16S r DNA种间保守序列,设计合成针对狐狸、水貂、貉子和狗的特异性引物和探针,通过对荧光PCR反应体系和反应条件的优化筛选,建立了多重实时荧光PCR方法,在同一PCR反应体系中可以同时完成4种动物源性成分检测。通过对15种其他物种的源性成分的检测,结果表明所设计的引物和探针具有很好的物种特异性,且灵敏度高,狐狸、水貂、貉子和狗的DNA检出限为0.01ng。对40份样品检测,其中5份检测出貉子、狐狸和水貂源性成分。结果表明,该方法可以有效地鉴别出饲料中狐狸、水貂、貉子和狗源性成分,同时适用于相关动物产品中。     

Taqman多重实时荧光定量PCR检测裸鼠肿瘤转移模型中肿瘤转移率方法的建立

目的:建立基于多重荧光定量PCR技术的动物体内恶性肿瘤转移模型中肿瘤转移率高效检测的方法。方法:以人和小鼠的β2m基因为目标,设计相应的引物和Taqman探针;分别抽提人涎腺腺样囊性癌ACC细胞和小鼠Sp2/0细胞的基因组DNA作为模板,建立两物种双重荧光定量PCR检测方法,且分别以人和鼠定量基因检测为参照考察双重荧光定量PCR方法的特异性、灵敏性和精确性,并与传统转移灶称重计算肿瘤转移率的方法进行比较。结果:双重Taqman实时荧光定量PCR检测方法具有很好的特异性和较高的灵敏度(0.006ng/μl DNA),重复性较好(批间平均CV=0.036),有较强稳定性,比传统称重法更高效,更准确。结论:双重荧光定量PCR能够在同一反应体系下同时对动物组织中人肿瘤转移灶和周围组织进行快速准确的定量检测,计算出肿瘤转移率,具有经济、快速、特异性强等优点,在肿瘤动物模型肿瘤转移率检测方面具有很高的应用价值。     

实时荧光PCR快速检测食品中致敏原芹菜成分

探讨采用实时荧光PCK技术建立检测食品中致敏原芹菜成分的方法.试验结果表明:针对芹菜管家基因Mrd基因设计的特异性检测引物和探针进行检测时,31种样品经实时PCR扩增,只有芹菜和西芹样品产生阳性的荧光信号,其余样品均不产生荧光信号.灵敏度试验结果表明:该方法对芹菜致敏原基因的检测灵敏度较高,可检测到芹菜过敏原样品中10mg/kg～1mg/kg的含量.     

牛流行热病毒LUX~(TM)荧光RT-PCR检测方法的建立

采用LUXTM荧光PCR技术原理,以牛流行热病毒(BEFV)糖蛋白抗原G基因保守序列为模板设计特异荧光PCR扩增引物,建立BEFV LUXTM实时荧光RT-PCR快速检测方法。试验结果显示,所建立的荧光RT-PCR可特异检测牛流行热病毒RNA,而对蓝舌病病毒、牛病毒性腹泻-粘膜病病毒、水泡性口炎病毒、口蹄疫病毒、牛白血病病毒以及与BEFV同种属的狂犬病病毒核酸检测呈阴性反应。敏感性试验表明LUXTM荧光RT-PCR对BEFV RNA的检测敏感性比常规RT-PCR方法提高达100倍以上。该LUXTM荧光RT-PCR的批内检测变异系数0.64%-1.17%,批间检测变异系数均小于2%,表明检测体系稳定、重复性好。通过人工添加灭活病毒液的方法制备30份模拟感染牛血清样品,采用上述所建立的BEFV LUXTM荧光RT-PCR方法检测均呈阳性。     

转基因水稻“科丰6号”实时荧光PCR定性定量检测方法研究

旨在建立转基因水稻"科丰6号"外源基因和边界序列的实时荧光PCR检测方法,为科丰6号定性定量检测提供技术支持。根据外源基因和边界序列信息,设计实时荧光PCR探针引物,优化体系,对不同转基因产品和不同转基因含量的"科丰6号"水稻进行检测。结果显示,所设计的引物探针具有很好的特异性,与其他转基因水稻品系、转基因玉米、转基因棉花、转基因番茄和非转基因水稻均无非特异性反应,对转基因水稻"科丰6号"的检测灵敏度达到0.01%。建立的科丰6号实时荧光PCR检测方法重复性好、灵敏度高,能够达到目前国际上转基因产品定量检测的标准,为该水稻品系的定性定量检测提供技术支持。     

双重实时荧光PCR法检测食品和饲料中的鸡源性成分

根据鸡线粒体DNA细胞色素b基因序列和内参照基因PUC18质粒基因序列设计特异性引物和以不同荧光素标记的TaqMan探针。通过对反应条件的优化筛选,建立能同时扩增鸡源性成分和内参照基因成分的双重实时荧光PCR检测方法。设置内参照反应是为了监控反应体系中是否含有PCR反应的抑制物,避免出现假阴性结果。分别以鸡、鸭、鹅、火鸡、牛、羊、猪、鱼、兔、驴、鹿、狗、马、鸽子、大豆、玉米、小麦、大米、马铃薯及番茄的线粒体DNA作为模板进行特异性试验,结果表明该方法仅能特异性扩增鸡源性成分,而对其它物种未见有效扩增。通过灵敏度测试,该方法检出限达0.01%。所制定的方法特异性高,灵敏度好,可以作为食品和饲料中鸡源性成分的高效检测方法。     

运用基因芯片技术检测牛、山羊、猪和鸡源性成分

本研究通过对脊椎动物分子标记基因进行序列分析,最终选择线粒体DNA(mtDNA)16S rRNA基因为目标基因,利用一对通用引物,在该引物扩增区间设计了4条特异性基因芯片检测探针及2条质控探针用于对牛、山羊、猪、鸡等4种动物源性成分进行检测。通过对PCR扩增体系及杂交体系的优化,该检测方法能实现对上述4种动物源性成分同时进行快速、准确地检测,具有很好的特异性,灵敏度均达到1pg,最终建立了这4种动物源性基因芯片检测方法。该基因芯片检测技术将为我国进出口饲料中的动物源性成分的鉴别提供新的检测方法和技术支持。     

实时荧光PCR法检测肉制品中鸡、鸭源性成分

根据鸡、鸭线粒体DNA(mt DNA)序列设计了鸡、鸭特异性引物及Taqman探针,建立了肉制品中鸡、鸭源性成分的实时荧光聚合酶链式(real-time PCR)检测方法。结果发现:利用此方法,两种动物源性的最低检出限值(质量分数)分别为0.01%和0.001%。实时荧光PCR法能够作为肉制品中检测鸡、鸭源性成分的有效方法。     

加工产品中转基因玉米Bt11成分实时荧光PCR定量(性)检测

实验在玉米自身基因和外源基因的边界序列之间设计了具有品种和品系特异性的引物和探针 ,并以实时荧光PCR技术 ,建立了加工产品中转基因玉米Bt1 1成分品系鉴定检测和定量检测的方法。实验对加热条件和时间对检测转基因成分的影响作了探讨 ,并检测了部分市售食品和饲料。检测结果发现 ,加热时间温度越高、时间越长 ,对转基因成分定量检测的影响越大 ;在所检测的样品中可以检测出转基因玉米Bt1 1成分 ,有些样品还同时检出其他转基因成分。本研究实验建立的方法 ,可以用于加工产品中转基因成分的定量检测 ,也可以用于定性检测 ,或作为常规PCR定性检测后的确证实验方法。     

EvaGreen实时荧光定量PCR检测猪圆环病毒2型方法的建立

根据GenBank中的猪圆环病毒2型(PCV2)ORF4基因序列设计一对特异性引物,通过常规PCR扩增PCV2的ORF4基因,并将其纯化的PCR产物克隆入pMD18-T载体中,构建重组质粒。应用该重组质粒进行EvaGreen实时荧光定量PCR,建立了PCV2 DNA的标准曲线,并进行熔解曲线分析。结果显示:建立的EvaGreen实时荧光定量PCR特异性强,与其他非靶标病毒基因不发生交叉反应;灵敏度高,最高可检测到10拷贝/μL的病毒量;重复性好,3个浓度的批间和批内的变异系数均小于2.5%;对118份临床样品进行检测,阳性样品25份,阳性率为21.2%,检测结果与普通PCR相符率为99.2%,其中一份样品经荧光PCR检测为PCV2阳性,普通PCR检测为阴性。结果表明,建立的EvaGreen实时荧光定量PCR方法具有特异性强、敏感度高、重复性好、简便快捷等特点,可用于临床PCV2感染的早期诊断以及分子流行病学调查。     

猪源性成分检测中3种DNA提取方法比较

为了达到对动物源性成分快速、准确的检定,对提取动物源性基因组DNA的方法进行了比较分析。考察酚-三氯甲烷法、聚乙烯吡咯烷酮法(PVP法)和试剂盒法这3种方法对DNA提取的浓度、纯度及实时荧光PCR扩增效果的影响。结果表明:酚-三氯甲烷法提取DNA浓度最高,试剂盒法纯度最高且实时荧光PCR扩增效果最好,但PVP法操作简单、安全、经济,提取的DNA用于实时荧光PCR扩增检出限可达1.98 pg/μL。使用PVP法对市场上10份不同类型的动物性产品进行了检测,检出两份产品中含有猪源性成分。PVP法应是3种方法中的首选方法,本文为实验室选择合适的DNA提取方法提供了依据。     

四重PCR 反应体系的建立及在牛肉掺假检测中的应用

目的:建立马、牛、猪、鸭肉四重聚合酶链式反应(PCR)反应体系,为牛肉掺假检测提供参考。方法:选取马、牛、猪、鸭肉阳性样本,根据线粒体基因组中细胞色素b(cytochrome b)序列,设计多重PCR引物,同时对马、牛、猪、鸭肉进行PCR及电泳检测,建立四重PCR反应体系,并运用该体系对市场40份牛肉制品进行检测。结果:引物比例为马:牛:猪:鸭=1:1:2:1时,46℃退火温度下反应35个循环,四重PCR效果较好;建立四重PCR反应体系,四重PCR条带清晰且亮度较为一致,几乎没有二聚体产生,扩增灵敏度高。根据样品检测结果,烤牛肉串、牛肉丸的掺假率较高,分别为36.4%、75%,牛排未检出除牛肉外的三种动物源成分,但不排除有其他动物源成分的掺入。结论:四重PCR反应体系可用于牛肉掺假检测。