重组人胱抑素C的原核表达及鉴定

目的构建重组人胱抑素C（cystatinC,CysC）的原核高效表达质粒,诱导表达并纯化获得CysC重组蛋白。方法根据大肠埃希菌编码蛋白的特性设计CysC编码基因序列,人工合成目的基因克隆至pET-22b（＋）表达载体中,测序及酶切鉴定正确后诱导其在大肠埃希菌BL21中表达,所获得的包涵体蛋白经亲和层析纯化后采用SDS—PAGE及Western印迹鉴定。结果酶切结果证实构建的表达质粒结构正确;测序结果显示克隆的基因序列所编码的蛋白与GenBank中的CysC氨基酸序列相符;SDS-PAGE及Western印迹结果证实获得的重组CysC融合蛋白分子量约为16kD,经NP亲和层析纯化获得纯度大于90％的目的蛋白。结论建立了重组人CysC的原核高效表达系统并获得了CysC重组蛋白。     

一种高效制备人乳酸脱氢酶LDH_5参考物质的方法及应用

[目的]研究高效、廉价制备人乳酸脱氢酶LDH5参考物质的方法。[方法]选取人乳酸脱氢酶基因(LDHA)CDS序列进行分析及优化,合成优化后的基因,克隆至表达载体pRSF-Duet中构建重组乳酸脱氢酶LDH5表达载体。使用大肠杆菌E.coli BL21(DE3)菌株对目的基因进行表达,异丙基硫代半乳糖苷酶(IPTG)诱导,镍离子亲和层析纯化,SDS-PAGE鉴定酶纯度,BCA法分析酶浓度,全自动生化仪分析酶活性、稳定性。[结果]经优化后的LDHA基因的大肠杆菌密码子适应指数为1;纯化蛋白达到电泳纯,比活性达19.01 U/mg,在4℃及25℃可稳定保存8 d。[结论]重组乳酸脱氢酶的表达效率为100 mg/L,酶活性、稳定性、纯度达到临床生化检测的参考物质的条件,可以作为血清乳酸脱氢酶检测的标准物质。     

重组人TNF-α在大肠杆菌表达、纯化及生物学活性鉴定

[目的]获得人TNF-α蛋白,并鉴定其生物学活性。[方法]通过对人源TNF-α序列进行密码子优化构建了p Cold-TNFα原核表达载体,完成了TNF-α重组蛋白的表达,建立了两步分离纯化方案,并利用Western Blot和细胞刺激实验检测了重组人TNF-α蛋白抗原性和生物学活性。[结果]利用大肠杆菌成功表达重组人TNF-α蛋白,经酶切纯化后的人TNF-α蛋白不含标签序列,纯度达95%,收率约70%,并具有良好的生物学活性。[结论]获得具有生物学活性的人TNF-α蛋白,为进一步的中和抗体研究奠定了基础。     

转录因子LRF蛋白POZ结构域的表达与纯化

[目的]旨在原核表达转录因子LRF的POZ结构域,纯化获得GST-POZ融合蛋白。[方法]以SD大鼠海马组织c DNA为模板,利用PCR扩增带有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的LRF基因的POZ结构域,并将其插入到原核表达载体p GEX-4T-1中,将构建成功的p GEX-4T-1-POZ原核表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导融合蛋白表达,再利用MagneGST particles亲和纯化GST-POZ融合蛋白,最后通过Western Blot鉴定融合蛋白。[结果]p GEX-4T-1-POZ原核表达质粒构建成功;在37℃条件下,浓度为0. 2 mmol/L的IPTG诱导7 h能够使重组蛋白大量表达,经MagneGST particles纯化后的GST-POZ重组蛋白能够被识别LRF的抗体特异性识别。[结论]纯化后的GST–POZ重组蛋白能够用于后续的生物学研究。     

人白介素-38原核表达载体的构建及其蛋白表达、纯化

$目的%构建人白介素(interleukin,IL)-38原核表达载体,原核表达IL-38重组蛋白、纯化及活性分析。[方法]PCR扩增IL-38成熟蛋白编码区,构建IL-38原核表达载体p ET-44-h IL-38,转化BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导,表达IL-38重组蛋白,并利用其C末端的组氨酸标签进行镍离子亲和层析纯化,将纯化的重组IL-38作用于脂多糖(LPS)诱导的THP-1细胞,研究纯化IL-38蛋白的生物学活性。[结果]构建的IL-38原核表达载体测序结果与Gen Bank中基因序列一致;IPTG诱导产生的IL-38蛋白主要以可溶性形式存在,纯化的目的蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳分析和Western Blot鉴定发现,蛋白纯度可达98%,细胞实验证明纯化的目的蛋白具有较高的生物学活性。[结论]成功构建了IL-38的原核表达载体,制备了具有生物活性的IL-38重组蛋白。     

大肠杆菌yfiF基因原核表达系统构建、表达条件优化及蛋白纯化

[目的]构建大肠杆菌功能未知基因yfi F的原核表达系统,对诱导表达条件进行优化,并纯化表达的可溶性Yfi F融合蛋白。[方法]使用p ET16b表达质粒构建p ET16b-yfi F原核表达载体,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达Yfi F融合蛋白,对IPTG加入时机、终浓度及诱导时间进行优化,并使用镍柱纯化裂菌上清液中的可溶性Yfi F融合蛋白。[结果]构建了p ET16b-yfi F重组质粒,IPTG诱导表达Yfi F融合蛋白,最佳诱导条件为细菌生长至OD600值为1时加入IPTG,终浓度为0.1 mmol/L,诱导9 h。裂菌上清液中的可溶性Yfi F融合蛋白纯化后浓度为209μg/ml。[结论]成功构建了yfi F的原核表达系统,优化了诱导表达条件,可溶性Yfi F融合蛋白得到纯化。     

新型抗菌肽Perinerin在大肠杆菌中的融合表达

为了获得新型抗菌肽 perinerin在大肠杆菌中的高效和可溶表达,实验首先采用SOE 法(重叠 PCR 法)获得的 perinerin 基因序列,对目的基因密码子优化,然后将其连接到 pET32a 载体中获得重组表达载体 pET32a-PEN,通过改变诱导时间和温度、诱导剂 IPTG 浓度以及诱变工程菌株等条件和方法,观察重组蛋白的表达效果,并运用金属螯合层析对融合蛋白进行纯化.SDS-PAGE 显示重组菌诱导后表达的融合蛋白分子量约为 26kD,采用变异重组菌株 MUT 3诱导表达,在 2×YT 培养基培养条件下,30 ℃诱导4 h 可获得高效表达的 perinerin 融合蛋白,其表达量约占菌体总蛋白的 50 % 左右,重组蛋白主要以可溶性表达形式存在,可溶性产物最高可达重组蛋白总表达量的 60 %.融合蛋白运用金属螯合层析一步纯化,纯度可达 90 % 以上.     

人血管能抑素基因的克隆、表达及其表达产物的纯化和生物活性测定

以人胎盘脐带组织为材料,提取组织总RNA,用netRTPCR方法合成人血管能抑素cDNA基因,将该cDNA克隆进pSP72载体获得重组质粒pSP72C, DNA序列分析结果与预期序列一致。用BamHⅠ和NdeⅠ双酶切,切下pSP72C上的血管能抑素cDNA,插入pET3c载体的相应位点获得重组表达质粒pETC, 转化E. coli BL21(DE3), SDSPAGE分析显示：在IPTG诱导下,血管能抑素基因获得了高效表达,表达量约占菌体总蛋白的 27.9 %,主要以包涵体形式存在。包涵体经过洗涤、裂解、蛋白复性以及Sephadex G75凝胶过滤层析等步骤后,获得了纯度达91.4 %的人血管能抑素。CAM实验证明10 μg纯化蛋白就能显著抑制鸡胚新生血管生成。     

金黄色葡萄球菌蛋白A串联Z结构域的表达、纯化及其亲和填料制备

目的构建金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcal Protein A,简称SPA或蛋白A),串联Z结构域的重组表达克隆,并实现在大肠杆菌中诱导表达,随后纯化获得重组蛋白,制备亲和填料.方法对目的基因进行元和表达的密码子优化,利用PCR扩增方法获得SPA的3个串联Z结构域,并在蛋白的N端加入组氨酸标签.将优化后的基因序列克隆到p ET43.1a(+)表达载体上,获得p ET43.1a(+)-SPA-3Z重组质粒;测序正确的重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3),IPTG诱导表达,通过亲和层析方法纯化表达的重组蛋白,并使用SDS-PAGE鉴定表达蛋白.将纯化获得的SPA纯品偶联到经环氧氯丙烷活化的Sepharose 6B Fast Flow凝胶上.使用兔多抗和腹水单抗对填料进行验证.结果成功构建p ET43.1a(+)-SPA-3Z克隆,纯化的SPA蛋白纯度高.成功将重组SPA偶联到经环氧氯丙烷活化的Sepharose 6B Fast Flow凝胶上.制备的填料在0.1mol/L的Na OH溶液里浸泡30小时,填料亲和性能未见明显变化,这为填料的长期使用提供了可能.将该填料用于抗体纯化,湿胶的多抗结合量可达22.7mg/ml,纯化的腹水单抗纯度在98%以上.结论本研究为SPA的大规模制备提供了基础.     

利用毕赤酵母系统表达重组人生长激素的研究

为了获得重组人生长激素在毕赤酵母中高表达的菌株,按毕赤酵母基因密码子偏爱性,人工合成hGH的全基因序列.该基因被克隆到穿梭质粒pPIC9K中,PEG1000介导转入毕赤酵母GS115细胞,通过G418筛选获得高拷贝转化子.在甲醇的诱导下.实现了hGH在毕赤酵母中的成功表达.通过发酵条件的优化.发酵上清中的表达量达1537 mg/L经过超滤和两步层析,重组蛋白的得率这35%,纯度为97%,相对分子质量测定表明重组蛋白的相对分子质量与理论值相近.N-端氨基酸测序证实hGH基因在毕赤酵母中获得正确的表达.     

猪丹毒丝菌SpaA蛋白的表达与纯化

[目的]在大肠杆菌中表达猪丹毒丝菌spaA基因并纯化重组蛋白。[方法]利用PCR扩增猪丹毒丝菌临床分离株spaA基因,构建重组质粒p GEX-4T-1-spaA,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达融合蛋白GST-SpaA,并优化表达条件。最后采用GST琼脂糖纯化树脂纯化,SDS-PAGE和Western Blotting检测。[结果]成功扩增spaA基因,获得重组表达菌株BL21(DE3)/p GEX-4T-1-spaA;在菌体OD₆₀₀为0. 9时,加入IPTG至终浓度0. 1 mmol/L,34℃诱导6 h的条件下表达效果最好。经SDS-PAGE检测和纯化后得到大小为97 kDa的GST-SpaA; Western Blotting检测结果表明,GST-SpaA具有良好的免疫原性。[结论]成功在大肠杆菌中表达了SpaA蛋白,经纯化得到具有免疫原性的重组蛋白,为后续研制猪丹毒丝菌SpaA蛋白亚单位疫苗奠定基础。     

稀有密码子影响人RNaseH-Apaf1融合蛋白原核表达

通过限制性内切酶克隆法构建两个pET-28a-TAT-RNaseH-Apaf1重组质粒,其中一个质粒经过稀有密码子的优化。将两个重组质粒分别转化原核表达宿主菌BL21(DE3)和Transetta(DE3),通过SDS-PAGE观察相应融合蛋白诱导表达的情况,并用His标签抗体和Apaf1抗体通过Western Blotting鉴定诱导蛋白。菌液PCR和测序证明经稀有密码子优化和未经稀有密码子优化的人源RNaseH-Apaf1序列成功重组到pET-28a-TAT载体中;经稀有密码子优化的重组质粒成功地在大肠杆菌宿主菌中表达RNaseH-Apaf1融合蛋白,并用Western Blotting检测到该融合蛋白。结果表明,稀有密码子可影响人RNaseH-Apaf1融合蛋白的原核表达。     

人LL-37与干扰素α2a密码子的优化及其在毕赤酵母中的融合表达

通过密码子优化,在毕赤酵母中高效表达人LL-37与IFN-α2a融合蛋白。先按P.pastoris密码子偏好性对LL-37与IFN-α2a的原始密码子进行了改造,并在二者之间加上Gly Gly Gly Gly Ser的柔性连接接头,人工合成设计的新序列,最后通过p PIC9K载体将其整合入P.pastoris GS115的基因组,构建出重组菌株GS115LI。利用遗传霉素浓度梯度筛选出两株高拷贝的GS115LI1和GS115LI2菌株。对这两株菌经发酵诱导后的发酵液进行SDS-PAGE检测、抗病毒活性检测和抗菌活性检测,证明重组株既能够成功表达出LL-37与IFN-α2a的融合蛋白,而且该融合蛋白成功保留了抗菌肽与干扰素的功能活性。诱导发酵后,融合蛋白的产量可达到819.1 mg/L,经盐析、疏水层析和离子交换层析分离,可得到纯度达97%的融合蛋白产物,回收率可达到46.2%,纯化后产品的效价可达2.6×108 IU/mg。经过密码子优化后,成功实现在毕赤酵母中高效表达出既有LL-37抗菌活性又具有干扰素α2a活性的融合蛋白。     

钝顶螺旋藻sod基因真核表达载体的构建与表达

目的:在毕赤酵母中表达钝顶螺旋藻超氧化物歧化酶SOD。方法:以质粒p ET30-sod为模板,采用PCR扩增sod基因,并将其与表达载体p PIC9K相连,构建重组表达质粒p PIC9K-sod。将重组质粒p PIC9K-sod用限制性内切酶PmeⅠ线性化,并电转化入毕赤酵母GS115。利用单菌落PCR筛选整合有重组质粒的阳性转化子,用甲醇进行诱导表达,并在5L发酵罐内进行发酵表达目的蛋白。用改进的邻苯三酚自氧化法测定重组SOD的活性。结果:成功构建了钝顶螺旋藻的sod的真核表达载体,并在毕赤酵母中表达了分子量为22k Da的重组蛋白SOD。发酵罐高密度发酵所获目的蛋白的平均浓度为0.36±0.4 mg/m L,比活性为409±17U/mg。结论:在毕赤酵母中表达了分子量为22k Da的钝顶螺旋藻SOD。     

鸡碳酸酐酶4基因在毕赤酵母中的表达

[目的]通过毕赤酵母的表达获得鸡碳酸酐酶4(CAⅣ)蛋白。[方法]根据鸡CAⅣ的序列,结合毕赤酵母密码子的偏好性,合成CAⅣ基因。将CAⅣ基因克隆到pPICZαA真核表达载体,获得重组表达质粒pPICZαA-CAⅣ。将其电转毕赤酵母GS115后,获得重组毕赤酵母菌GS115/pPICZαA-CAⅣ。用终浓度为1%的甲醇对重组阳性菌进行诱导表达,通过SDS-PAGE和Westernblot法检测蛋白的表达,并用Ni离子亲和层析法对表达出的蛋白进行纯化。[结果]成功构建了表达载体pPICZαA-CAⅣ,转化重组酵母菌后可分泌出36kDa左右的CAⅣ蛋白,并通过Ni离子亲和层析法获得了单一性的目的蛋白CAⅣ。[结论]获得分子量约36kDa的鸡CAⅣ蛋白。     

肝靶向肽-人内皮抑制素融合蛋白表达条件的优化及活性鉴定

为了获得足够多纯度高且有活性的肝靶向肽-人内皮抑制素融合蛋白(HTP-r ES),首先研究了BL21/p ET21b-HTP-r ES重组菌株的生长曲线和最佳诱导时机;单因素分析不同p H值、不同诱导时间、不同诱导剂浓度、不同诱导温度时融合蛋白表达量;通过包涵体洗涤、复性、纯化,以获得高纯度的肝靶向肽-人内皮抑制素融合蛋白;最后采用流式细胞仪和MTT对融合蛋白进行活性鉴定。结果表明,BL21/p ET21b-HTP-r ES重组菌株在1.5–3.5 h处于对数生长期,培养基p H 8.0、IPTG终浓度0.06 mmol/L、42℃、诱导表达5 h为最佳表达条件。包涵体洗涤后纯度达60%,经复性、纯化后获得的目的蛋白纯度达到95%以上,对人肝癌细胞具有靶向性,能抑制人脐静脉内皮细胞的增殖。研究确立了融合蛋白最佳表达条件以及复性、纯化条件,为进一步研究其生物学活性及药物开发奠定基础。     

人分泌磷蛋白2基因的克隆、原核表达与活性检测

提取人肝癌组织RNA,通过RT-PCR扩增人SPP2成熟蛋白编码区基因并克隆至原核表达载体pET-22b（＋）,将测序正确的质粒转化大肠杆菌BL2l（DE3）,IPTG诱导重组蛋白表达,用Ni-NTA柱进行纯化,SDS-PAGE电泳及Western blot检测并证实目的蛋白的表达,通过重组蛋白对木瓜蛋白酶的抑制作用验证其生物学活性。重组质粒测序和酶切结果显示SPP2成熟蛋白基因已成功克隆到pET-22b（＋）。IPTG诱导重组菌后有25kDa大小的目的蛋白表达。优化诱导表达条件,获得可溶性表达的目的蛋白,纯化后纯度达90%,western blot表明其具有His标签抗原活性。重组SPP2成熟蛋白可抑制木瓜蛋白酶的水解作用（酪蛋白为底物）,重量抑制比为1∶3.1,抑制比活性为2511U/mg。     

日本鳗鲡绿色荧光蛋白基因的克隆与表达

[目的]克隆日本鳗鲡绿色荧光蛋白UnaG基因,表达并纯化UnaG蛋白。[方法]从日本鳗鲡中克隆了绿色荧光UnaG基因,并克隆至p ET28Aa、pc DNA-Flag质粒中。将重组质粒pc DNA-Flag用脂质体转染到293T细胞中,用荧光显微镜观察绿色荧光,同时用原核表达系统诱导His-UnaG融合蛋白的表达,用亲和层析和凝胶过滤层析纯化HisUnaGg融合蛋白。[结果]转染人293T细胞后不到24 h,荧光显微镜观察到日本鳗鲡UnaG能被激发出较强的绿色荧光;原核表达并纯化的His-UnaG融合蛋白纯度很高,Western Blot检测为单一条带,蛋白量达3μg/μl。[结论]成功克隆并纯化了UnaG,为进一步研究UnaG的应用奠定基础。     

改善稀有密码子和氨基酸残基限制提高重组人ADAM15去整合素结构域蛋白表达水平

[目的]为提高重组人ADAM(A Disintegrin And Metalloproteinase)15去整合素结构域蛋白(rhADAMl5)的表达水平.[方法]在详尽分析rhADAM15的cDNA和GST(谷胱甘肽-S-转移酶).ADAM15结构的基础上,选择表达宿主菌并对表达质粒进行改造.[结果](1)选择能为大肠杆菌稀有密码子提供额外tRNA的Escherichia coli.Rosetta(DE3)作为宿主菌,将质粒pGEX-ADAM15转化于其中在最佳诱导表达条件下获得298 mg/L融合蛋白GST-ADAM15;(2)采用PCR体外定点突变技术将目标蛋白编码区稀有密码子GGA(Gly<'425)替换为GGC,使融合蛋白表达水平提高9.4%;(3)通过消除凝血酶识别序列附近的Pro-Glu-Phe残基,提高凝血酶酶切效率,使rhADAM15产量提高了35.7%;(4)在GGA替换为GGC基础上切除"Pro-Glu-Phe"残基,使rhADAM15产量提高到68 mg/L,比分别切除"Pro-Glu-Phe"残基、GGA替换为GGC和野生型提高了19.2%、51.1%和61.9%.[结论]这一结果表明,在充分认识目标蛋白特性的基础上定向选择表达宿主并改造表达质粒能实现外源蛋白高水平表达.     

VISTA-Ig融合蛋白的表达及其包涵体复性研究

[目的]构建VISTA-Ig融合蛋白表达载体,进行诱导表达获得VISTA-Ig融合蛋白。[方法]以C57BL/6小鼠脾脏细胞c DNA为模板,扩增小鼠VISTA胞外段基因,利用重叠延伸PCR的方法合成VISTA-Ig融合基因,构建重组质粒p ET-22b-VISTA-Ig,在大肠杆菌表达菌株E.coli BL21(DE3)中诱导表达。[结果]VISTA-Ig融合蛋白主要以包涵体的形式存在。变性后,利用镍柱纯化,通过采用氧化型/还原型谷胱甘肽(GSH/GSSG)复性体系,复性效率达到80%以上,提高了复性效率。利用r Protein A柱对目标蛋白进一步纯化,Western Blot鉴定结果显示,能与Ig G Fc(HRP)抗体特异性结合。[结论]成功构建了重组质粒p ET-22b-VISTA-Ig,纯化的VISTA-Ig包涵体蛋白复性效率得到明显提高,为后续VISTA-Ig免疫学功能的研究奠定了基础。