小鼠白细胞介素-33基因的克隆及序列分析

目的:克隆小鼠IL-33基因全长编码区cDNA,并对其进行序列分析。方法:从BALB/c小鼠的脊髓组织中提取总RNA,逆转录为cDNA,用热启动PCR技术,扩增小鼠IL-33基因全长编码区cDNA,经双酶切后,克隆入pcDNA3.1( )载体中,构建真核表达载体pcDNA3.1-mIL-33,然后进行酶切鉴定与序列分析。结果:小鼠IL-33基因的PCR产物和重组载体经凝胶电泳和酶切鉴定、测序分析证实,其序列与GenBank中数据一致。小鼠IL-33基因的全长编码序列为801 bp,编码266个氨基酸。结论:小鼠IL-33基因成功的克隆并构建了其真核表达载体,为进一步进行IL-33的表达与功能研究奠定了基础。     

内蒙古白绒山羊erk2基因的克隆及表达模式分析

旨在克隆内蒙古白绒山羊erk2基因cDNA并分析其基本表达模式。采用RT-PCR方法克隆白绒山羊erk2基因cDNA。通过在线软件Blast进行核酸序列分析,用SMART与Psite进行氨基酸序列分析。定量RT-PCR检测erk2基因在绒山羊组织中的表达特异性。免疫组化法检测绒山羊睾丸中erk2表达。克隆到的内蒙古白绒山羊erk2基因cDNA片段 (GenBank Accession No.JX569765) 长1 083 bp,包含了编码360个氨基酸残基的全长ORF,氨基酸序列与牛的ERK2 (Bos Taurus BC133588.1) 同源性为100％。SMART分析表明,ORF编码的蛋白包含了活化位点“TEY”及具有丝氨酸/苏氨酸激酶催化活性的S-TKc结构域。Psite分析表明,含2个N-糖基化位点、1个依赖于cAMP/cGMP的蛋白激酶磷酸化位点、3个蛋白激酶c磷酸化位点、5个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、2个N-豆蔻酰化位点、2个异戊二烯基结合区 (CAAX box)、7个微体羧基端靶向信号、2个蛋白激酶ATP结合区标记及一个丝/苏氨酸蛋白激酶活性区域标记。PSORT (k-NN prediction) 程序预测其定位于细胞质中。定量RT-PCR分析显示erk2基因mRNA丰度在心脏、皮肤以及乳腺组织中mRNA丰度较高,脾、肾中的表达相对较低。在睾丸中检测到ERK2蛋白表达。     

小鼠睾丸特异表达基因TSEG-1的克隆及序列分析

从表达序列标签(expressed sequence tags, ESTs)数据库ZooDDD中获得小鼠正常睾丸表达的EST, 通过dbEST数据库检索出与其高度同源的EST序列, 构建EST叠加群(contigs), Biolign软件拼接, GeneScan软件预测contigs对应的基因组序列中的外显子、内含子; 针对开放阅读框设计引物序列, 采用RT-PCR从小鼠睾丸组织中克隆新基因的cDNA, 分析该基因在小鼠各脏器中的mRNA表达, 并对测序结果进行生物信息学分析。结果表明: 在小鼠X染色体的1 668~2 011 kb间克隆出一新基因TSEG-1, 全长为510 bp, 开放阅读框为336 bp, 编码111氨基酸, 分子量12.84258 kDa, 等电点11.4000。RT-PCR证实该基因开放阅读框正确, 在小鼠睾丸组织中特异性表达, 且与小鼠其他cDNA 无同源性, 获得GenBank 登录号EU079024。功能区分析发现TSEG-1蛋白可能为一种跨膜蛋白, 跨膜区位于第41~61氨基酸残基。TSEG-1基因与人类睾丸特异性组蛋白2a变异体基因有较高同源性, 在TSEG-1基因5′-端非编码侧翼预测发现存在1个启动子区域, 范围为680 bp。 TSEG-1蛋白可能有4个抗原性位点, 2个特异性蛋白激酶的磷酸化位点, 其亚细胞定位可能位于线粒体。小鼠睾丸特异性基因TSEG-1的克隆为进一步研究其生物学功能和表达调控奠定了基础。     

内蒙古白绒山羊4E-BP1基因cDNA克隆及组织表达特异性分析

旨在克隆内蒙古白绒山羊4E-BP1(真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1)基因并进行生物信息学及表达模式分析。根据已报道物种4E-BP1基因cDNA序列,用primer premier5软件设计引物,通过RT-PCR从绒山羊胎儿成纤维细胞总RNA中扩增出4E-BP1基因编码区cDNA序列,对目的片段进行测序及表达模式分析。克隆到的内蒙古白绒山羊4E-BP1基因cDNA全长357 bp,包含了完整的的ORF,编码118个氨基酸残基。核酸序列与牛、马、人、大鼠及小鼠的同源性分别为98%、90%、90%、88%和87%。4E-BP1基因在绒山羊脑、心脏、睾丸及胰腺组织中均有表达。     

内蒙古白绒山羊TSC2基因克隆与表达模式分析

旨在克隆内蒙古白绒山羊TSC2基因cDNA并分析其特性及基本表达模式.利用RT-PCR分段克隆TSC2基因cDNA片段并测序,将得到的cDNA各片段核苷酸序列拼接后获得绒山羊TSC2基因编码区全长序列(HQ684023)并进行生物信息学分析.半定量RT-PCR方法检测TSC2基因在不同组织中的表达特异性.结果表明内蒙古白绒山羊TSC2基因cDNA编码区核苷酸序列为5184 bp,包含了编码1727个氨基酸残基的全长ORF.核苷酸序列与牛、猪、马、大熊猫、犬、恒河猴、人、小鼠及大鼠的同源性分别为97％、90％、89％、88％、87％、87％、87％、86％和86％.NCBI CDD程序预测该基因编码的蛋白质有一个Tuberin结构域和一个Rap-GAP结构域;Psite程序分析有5个N糖基化位点、2个cAMP和cGMP依赖蛋白激酶磷酸化位点、16个蛋白激酶C磷酸化位点、25个酪蛋白激酶磷酸化位点.PSORT程序预测其定位于胞内体膜.TSC2基因在内蒙古白绒山羊的睾丸、脑、肝脏、肺、乳腺、脾和肾脏等组织中都有表达,mRNA丰度在睾丸中较高,乳腺中较低.     

内蒙古白绒山羊IGF-IR基因cDNA克隆及组织表达特异性分析

旨在克隆内蒙古白绒山羊IGF-IR基因并分析其基本表达模式.采用RT-PCR克隆基因,将得到的IGF-IR基因cDNA片段的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析.半定量RT-PCR进行组织特异性表达检测.获得了内蒙古白绒山羊IGF-IR基因3’端编码区2118 bp的cDNA序列(JN200823),编码705个氨基酸残基.核苷酸序列与牛的IGF-IR( XM606794.3)基因同源性为98％,相应的氨基酸序列同源性为99％.SMART分析表明,推导出的编码蛋白具有跨膜域,酪氨酸激酶催化域.半定量RT-PCR检测表明,IGF-IR基因在绒山羊脑、胰腺、肝、肾组织中均有表达.     

小鼠睾丸生精细胞凋亡相关基因mTSARG3的克隆

从在小鼠隐睾和正常睾丸对照中表达量有明显差异的EST片段 (BE6 4 4 5 37)出发 ,利用GeneScan软件分析该片段所在染色体基因组序列 ,获得一个包含该EST的新基因序列。设计该基因特异性引物从小鼠睾丸cDNA文库中进行PCR扩增 ,分离出小鼠睾丸生精细胞凋亡相关基因mTSARG3(GenBank登录号为AF4 192 92 )。该基因定位于小鼠 7号染色体 7E1 E2区带 ,全长为 11kb ,cDNA全长为 132 8bp ,包含 8个外显子 ,编码由 316个氨基酸组成的、分子量为 36kD的蛋白质。该蛋白质含有DnaJ区和DnaJ- c区 ,与热激蛋白 4 0家族多种蛋白质有较高相似性 ,其中与小鼠DJB4 - MOUSE在 336aa的范围内有 4 6 %的相似性 ,属热激蛋白 4 0家族新成员。多组织RT PCR和Northern印迹结果显示 ,该基因在小鼠睾丸组织高表达 ,转录本大小约为 1.35kb ;Southern杂交结果显示 ,该基因在小鼠正常睾丸和隐睾组织无缺失和重排。实验结果证明成功克隆到了一个小鼠睾丸生精细胞凋亡相关基因mT SARG3。     

大鼠脑红蛋白基因编码区的克隆、多态性分析及该基因组织表达谱研究

参考人和小鼠脑红蛋白（Neuroglobin,NGB)的cDNA序列设计简并引物,用RT－PCR方法从大鼠脑组织中扩增出大鼠NGB基因编码区的cDNA序列,该序列与小鼠NGB基因编码区的序列同尖性为96％,与人NGB基因编码区的序列同源性为88％,进一步分析表明,大鼠NGB基因编码区存在多个多态性位点;113t/c[138P],133a/g[N45D],388a/g[R130G],417t/c.该序列已被GenBank接受,登录号为AF333245,RT－PCR分析表明,该基因在大鼠脑,肝,肾,心肌和骨骼肌中均有较高水平表达,提示了其功能上的重要性。     

内蒙古白绒山羊VEGF164基因cDNA克隆及组织表达特异性分析

旨在克隆内蒙古白绒山羊血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF164)基因并分析其基本表达模式。采用RT-PCR技术克隆基因,将得到的基因cDNA序列及其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。利用半定量RT-PCR方法进行组织表达检测。获得了内蒙古白绒山羊VEGF164基因编码区cDNA全长序列,扩增片段全长573 bp,包含了完整的ORF,编码190个氨基酸残基。核苷酸序列与绵羊的VEGF164(EU857623.1)基因同源性为99%,相应的氨基酸序列同源性为99%。SMART程序分析表明,ORF编码的蛋白质具有信号肽序列及血小板衍生和血管内皮生长因子家族(PDGF,VEGF)结构域。Psite程序分析表明,有1个蛋白激酶C磷酸化位点,4个酪蛋白激酶磷酸化位点。ProtComp Version 9.0程序分析将其定位于细胞外。RT-PCR检测表明,VEGF164基因在绒山羊脑、心脏、睾丸、胰腺、脾、肾和肺组织中均有表达。     

广西巴马小型猪PGC-1α基因克隆与组织表达分析

目的克隆广西巴马小型猪PGC-1α基因编码区（CDS）序列,利用RT-PCR和QRT-PCR方法分析PGC-1αmRNA组织表达情况。方法本实验以广西巴马小型猪背最长肌cDNA为模版,PCR扩增PGC-1α基因CDS序列,将其连接至pEASY-T5载体,转染细菌、验证和序列测定;通过RT-PCR半定量和QRT-PCR实时荧光定量检测PGC-1α基因在小型猪多个组织中的表达情况。结果克隆获得广西巴马小型猪PGC-1α基因CDS序列,全长2391 bp,编码796个氨基酸,与参考序列的同源性为99.9%,两处碱基发生同义突变,分别是C-A1105和GA1524;PGC-1α基因在广西巴马小型猪心脏和肾脏中的表达丰度最高,其次是肝脏、皮下脂肪和背最长肌,而在胰腺中未检测到其表达。结论成功克隆了广西巴马小型猪PGC-1α基因编码区序列并进行了多种组织表达分析,为后续研究PGC-1α在小型猪2型糖尿病发生过程中作用途径打下基础。     

小鼠Lin28基因的克隆及原核表达

目的探讨获取小鼠Lin28蛋白的方法。方法 提取8.5 d ICR小鼠胚胎mRNA后反转录为cDNA序列,用一对两端引入特定酶切位点（NcoⅠ及XhoⅠ）引物,从该cDNA中扩增出Lin28基因编码区序列;将获得的Lin28基因编码区序列克隆到pMD18-T载体上。对质粒双酶切回收其中Lin28基因片段,与pET-30a（+）载体相连接并转化Rosetta（DE3）型大肠杆菌,用IPTG诱导表达,最后采用SDS-PAGE对表达结果进行分析。结果对所克隆的Lin28蛋白编码区的DNA序列分析表明,Lin28 CDS区包括终止密码子在内为630 bp,与参照DNA（NM₁45833）相比同源性为99.37%,与参照氨基酸序列相比同源性为100%;在IPTG诱导下pET-30a（+）-Lin28重组质粒可表达与预期相符的约为27.5×103的蛋白质。结论利用克隆的小鼠Lin28基因,采用原核表达方法,成功获得小鼠Lin28蛋白,为进一步开展以重组蛋白诱导体细胞重编程研究奠定基础。     

内蒙古白绒山羊翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)基因克隆及组织表达特性分析

旨在克隆内蒙古白绒山羊翻译控制肿瘤蛋白(Translationally controlled tumor protein,TCTP)基因并分析其表达模式。采用RT-PCR技术扩增TCTP基因编码区cDNA序列,将得到的基因cDNA序列及其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析,利用定量RT-PCR方法检测TCTP基因在绒山羊不同组织中的表达特异性。获得的内蒙古白绒山羊TCTP基因编码区cDNA序列全长519 bp,包含了完整的ORF,编码172个氨基酸残基组成的蛋白质。核苷酸序列与绵羊、牛、猪、人、猴及大鼠的同源性在99%-95%之间。生物信息学分析表明,编码的蛋白质理论分子质量19.6 kD,等电点(pI)4.673,含有一个N端糖基化位点,一个蛋白激酶C磷酸化位点,3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,定位于细胞质中。定量RT-PCR方法检测表明,TCTP基因在绒山羊肾脏、肌肉、胰腺、肝脏、睾丸和脑组织中均有表达,其中在肝脏中的表达量较高,在脑中表达量较低。     

小鼠Smad3基因的克隆及其在小鼠组织中的表达

采用PCR获得的Smad3cDNA片段作为探针筛选小鼠脑cDNA文库 .克隆了小鼠全长的Smad3基因 .对小鼠Smad3基因的全编码区进行了序列测定 .结果表明 ,小鼠SMAD3与人SMAD3氨基酸同源性高达 99% .与小鼠Smad2基因相比 ,碱基同源性高达 91 8% .Northern杂交显示 ,Smad3基因在小鼠胚胎发育和各成体器官中普遍表达 .原位杂交显示 ,Smad3基因表达在小鼠胚胎期E16 5d的软骨、骨髓和皮肤角质细胞中     

脊尾白虾组织蛋白酶L基因的克隆及其表达分析

根据本实验室构建的脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)血细胞全长cDNA文库获得的EST序列,利用RACE技术克隆获得脊尾白虾组织蛋白酶L基因的cDNA全长,命名为EcCatL基因.该序列全长1136 bp,包括5'非编码区24 bp,开放阅读框960 bp和3'非编码区152 bp,开放阅读框共编码319个氨基酸,预测相对分子量为35.30×103,理论等电点为5.27.同源性分析表明,脊尾白虾组织蛋白酶LEcCatL氨基酸序列与其它甲壳动物高度保守,与变色小长臂虾(Palaemonetes varians)及北极甜虾(Pandalus borealis) CatL的同源性分别为92％和76％.系统进化分析表明,EcCatL基因氨基酸序列与变色小长臂虾的CatL聚为一支.荧光定量PCR分析结果表明,EcCatL基因在血细胞、鳃、肝胰腺、肌肉、卵巢、肠、胃及眼柄中均有表达,其中肝胰腺中的相对表达量最高.感染鳗弧菌及WSSV后6h和12h,脊尾白虾血细胞和肝胰腺中EcCatL的表达量较对照组均极显著增加(P＜0.01),且具有明显的时间差异性,表明EcCatL基因在脊尾白虾免疫反应中具有重要作用.     

新型人肝再生增强因子的分子克隆及其性能研究

肝再生增强因子(ALR)是新近发现,存在于新生大鼠肝组织中的一种新的肝增殖刺激因子,其人源性对应序列未见报道.研究在克隆大鼠ALRcDNA的基础上,首次报道了依据cDNA序列推导的人ALR的氨基酸序列;将人ALR编码区cD-NA亚克隆于真核表达质粒pcDNAⅠ,转染cos-7细胞后,发现其表达产物具有促进HTC肝癌细胞增殖的作用;Northern杂交提示人 ALR mRNA比大鼠ALR mRNA大,约l.4kb,表明人ALR cDNA具有更长的非翻译区序列;除肝脏外,ALR mRNA在胸腺及肾等人胚胎组织中也有较高丰度表达;正常大鼠肝组织仅低丰度表达ALRmRNA,但 2/3肝部分切除后12h肝组织ALR mRNA表达明显增高,提示 ALR可能是一种重要的肝再生刺激因子.     

利用DNA免疫技术制备果蝇GBB多克隆抗体及其表达模式的分析

TGF-β信号家族在生物体生命活动中具有多种发育和生理功能。研究该信号家族在生物体内的表达模式具有重要的意义。gbb是TGF-β信号成员bmp7的果蝇同源基因,为了进一步研究gbb对胚胎发育的影响,本文采用DNA免疫技术制备得到果蝇GBB多克隆抗体。首先提取果蝇总RNA,反转录得到cDNA文库,以该文库为模板克隆出gbb基因编码区序列,构建成真核表达质粒pCAGGS-P7/gbb。采用DNA免疫技术免疫BALB/c小鼠,取心血分离血清制备了GBB多克隆抗体。免疫印迹试验表明制备的GBB多克隆抗体有效,果蝇胚胎免疫荧光分析表明GBB在果蝇胚胎发育0～9 h无明显表达,9 h之后开始高效表达。     

心脏特异新基因Lrrc10的分子克隆与特性分析

采用表达序列标签(EST)介导的基因克隆和表达谱分析,从小鼠心脏克隆了一个心脏特异新基因Lrrc10（GenBank Acc No. AF527781）.该基因cDNA全长为1 410 bp,定位于小鼠染色体10D2,在基因组中无内含子.Lrrc10的最大开放阅读框编码的假想蛋白由274个氨基酸组成,含有7个亮氨酸重复基序.同源性检索未发现有整体同源性的已知基因.EST数据库中支持该基因cDNA序列的全部18条EST均来自小鼠心脏组织.对小鼠的不同组织cDNA的RT-PCR检测证实该基因主要在心脏中强表达,在肺低表达,而在其他组织中不表达或表达很弱.因此该基因是心脏特异的富亮氨酸重复超家族新成员.     

家兔精子膜蛋白rsp10基因的克隆和特征分析

 sp10基因在精卵识别过程中起着重要作用 .从家兔睾丸cDNA文库中克隆了家兔的sp10基因 (rsp10 ) ,cDNA序列全长 12 82bp ,包含 10 0 5bp开放阅读框 .由开放阅读框推测出的氨基酸序列与人、狒狒、狐和小鼠的SP10氨基酸序列之间存在较高水平的同源性 ,同源性分别为 70 %、69%、68%和 61% .在大肠杆菌中表达rsp10基因 ,获得重组rSP10 .用重组rSP10免疫雌性母兔 ,得到rSP10专一性多抗 .对精子膜蛋白进行免疫印迹分析发现 ,rsp10基因在家兔睾丸中的表达呈现多态性 .rsp10基因在GenBank的登录号为 :AF2 51558.     

大鼠中心体蛋白家族基因的克隆及其在睾丸中的表达特征

centrin是进化上高度保守的中心体蛋白家族, 已从多种生物中克隆到其同源基因, 但基因文库中尚无大鼠centrin序列的报道. 采用RT-PCR从大鼠睾丸组织中克隆到centrin-1, -2和 -3 cDNA片段, 对其衍生的氨基酸序列进行同源性比较, 结果显示, 人、小鼠、大鼠中相应的centrin蛋白同源性很高. 采用半定量RT-PCR技术研究了它们在大鼠精子发生过程中的表达特征. 结果表明, centrin-1的表达具有睾丸组织和生精细胞特异性, 并呈现出发育阶段相关的规律, 它仅在减数分裂开始后转录, 其mRNA水平在圆形精子细胞中达到高峰. centrin-2和centrin-3在睾丸精原细胞中有高表达, 进入减数分裂后其mRNA水平迅速降低, 同时在一些体细胞中也有表达. 推测centrin-1可能在减数分裂或精子细胞变态分化过程中发挥作用, 而centrin-2, -3可能与有丝分裂有关.     

小鼠睾丸生精细胞凋亡相关基因SRG2的分子克隆及其在隐睾中的表达特征

从已获得的在隐睾和正常睾丸对照中表达量有明显差异的EST片段(BE644542)入手,利用网上生物信息学克隆了SRG2基因全长,GenBank登录号为AF395083。从小鼠睾丸cDNA文库中分离出该基因完整阅读框cDNA,SRG2基因的cDNA全长为1088bp,为编码295个氨基酸、分子量为33579kD、等电点为9．64的蛋白质,与人类同源基因TSARG2相似性为78％,而与其他已知蛋白质无明显同源性。RT-PCR结果表明：该基因只在睾丸中有高表达。应用新型的分子信标检测该基因在不同时期隐睾中的mRNA表达水平,发现该基因呈明显上调,证明该基因在隐睾的发生发展中具重要作用。