羟基肉桂酰基转移酶的结构、功能与应用

羟基肉桂酰基转移酶（hydroxycinnamoyl transferase,HCT）属于植物酰基转移酶家族的一个重要分支,具有“HXXXD”和“DFGWG”两个保守序列,以多种酰基辅酶A（肉桂酰辅酶A、对香豆酰辅酶A、咖啡酰辅酶A、阿魏酰辅酶A和芥子酰辅酶A等）作为酰基供体,催化多种底物（莽草酸、奎尼酸、4 羟基苯乳酸、龙胆酸和4 羟基苯乙胺等）形成酯类或酰胺化合物。其酰基化产物可改善植物次生代谢产物的理化性质和生物活性,因此HCT被广泛应用于开发生物质能源、改良作物品种和研制抗炎药物,对植物次生代谢产物的合成与后修饰具有重要意义。本文系统介绍了HCT的序列特点、蛋白质结构特征、酰基化反应机制和其在工业、农业及医药行业的应用,并对HCT的未来发展前景进行了展望。     

鸭梨PbHCT3基因的克隆及表达分析

羟基肉桂酰CoA:莽草酸/奎宁酸羟基肉桂酰转移酶(HCT)是植物绿原酸合成的关键酶之一.该研究以鸭梨为材料,采用同源基因克隆的方法,克隆出一个鸭梨的HCT基因,命名为PbHCT3.PbHCT3基因cDNA全长序列为1 731bp,基因编码序列长度为1 317bp,编码438个氨基酸,含有酰基转移酶的2个保守序列HHAAD和DFGWG及保守结构域MVVNVTVRES.实时荧光定量PCR分析表明:PbHCT3基因在幼果果皮、果肉、果心、幼叶及花蕾期花瓣中的表达量较高.随着鸭梨果实生长,果实中PbHCT3基因表达量逐渐降低.研究表明,PbHCT3基因与鸭梨幼嫩组织的生长发育有密切关系.     

决明查尔酮合成酶的同源模建和分子模拟对接

查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)是植物中类黄酮生物合成途径的关键酶,其催化对-香豆酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A发生缩合反应.本研究以苜蓿CHS的晶体为模板,利用同源建模构建决明CHS的三维模型.经过动力学优化后,决明CHS的三维模型与苜蓿CHS的结构极为相似,主要由α-螺旋和β-折叠构成,其中有13个α螺旋,占32.82％,15个β折叠,占19.23％,无规则卷曲占47.95％.模型验证结果表明决明CHS的三维模型具有合理的立体化学性质与氨基酸相容性.决明CHS含有两个重要的结构域:对-香豆酰辅酶A结合域与丙二酸单酰辅酶A结合域.决明CHS与对-香豆酰辅酶A、丙二酸单酰辅酶A的结合主要通过氢键与范德华力.决明CHS中Cys164、His303与活性中心的H2O能够形成电子传递体系,参与对-香豆酰辅酶A形成CHS-对-香豆酰基中间产物.本研究结果为利用此类CHS三维模型研究其催化机理和分子工程改造奠定基础.     

裂殖壶菌丙二酸单酰转移酶(MAT)基因的克隆与序列分析

二十二碳六烯酸(DHA)是一种重要的多不饱和脂肪酸,裂殖壶菌(Schizochytrium)因富含DHA成为当前的研究热点。丙二酸单酰转移酶(MAT)是该菌合成DHA的关键酶。以Schizochytriumsp.FJU-512cDNA文库中的EST序列contig417(GenBank accession No.EF483907)为基础,获得了丙二酸单酰转移酶基因的DNA序列和cDNA序列。序列分析表明,cDNA序列与DNA序列完全一致,开放阅读框全长1 176bp,编码391个氨基酸,且具备该类酶氨基酸序列的两个经典保守区。对该蛋白进行系统发育分析,构建进化树,结果显示,该蛋白同Schizochytriumsp.TIO01的丙二酰辅酶A-ACP转移酶(MCAT)亲缘关系最近。     

山黧豆AAE超家族基因的鉴定及LsAAE3的酶活检测

【目的】为研究山黧豆（Lathyrus sativus L.）草酰辅酶A合成酶在三七素（β-N-草酰-L-α,β-二氨基丙酸,β-N-oxalyl-L-α,β-diaminopropionic acid,β-ODAP）生物合成途径中的作用。【方法】研究利用AMP结合结构域隐马尔科夫模型在山黧豆基因组中鉴定了酰基激活酶超家族（acyl-activating enzyme superfamily,AAE）基因,在此基础上,克隆了山黧豆草酰辅酶A合成酶基因LsAAE3,采用多序列比对、原核表达及酶活检测等方法分析LsAAE3基因功能。【结果】结果表明：山黧豆中至少存在22条AAE家族基因;系统发育分析表明,LsAAE3与拟南芥AtAAE3等聚为一支,隶属于酰基辅酶A合成酶家族。基因克隆及序列分析表明,LsAAE3基因cDNA全长为1 566 bp;LsAAE3和AtAAE3的保守结构域类似,均含有AMP结合位点、CoA结合位点、AAE保守结构域。SDS-PAGE检测表明,所获融合蛋白条带单一,大小在56 KD左右;利用His标签抗体进行Western blot分析发现,诱导后和纯化的融合蛋白均能检测到特征条带,说明所获融合蛋白为LsAAE3。体外酶活检测表明,LsAAE3具有草酰辅酶A合成酶活性,其活性发挥依赖于ATP、镁离子。【结论】研究在全基因组水平鉴定了山黧豆AAE超家族基因,并验证了LsAAE3具有草酰辅酶A合成酶活性,为进一步分析山黧豆LsAAE3在β-ODAP生物合成过程中的功能奠定基础。     

巴西橡胶树的脂酰辅酶A还原酶cDNA克隆及其序列分析

从巴西橡胶树差减cDNA文库中筛选到一个与脂酰辅酶A还原酶同源性较高的基因片段,根据该基因片段序列信息,设计特异引物,采用RACE进行差异片段的5’和3’端的扩增,获得长度为1365bp的cDNA克隆R28（GenBank登陆号：AY461413）。序列分析表明,该基因包含1149bp的开放阅读框,5＇-UTR为96bp,3＇-UTR为128bp,编码382个氨基酸,推测其蛋白质的分子量为43．5kDa,等电点为8．97,有一个跨膜螺旋N（187至215位氨基酸）和1个由17个氨基酸组成的信号肽（1至17位氨基酸）。R28含有脂酰辅酶A还原酶的保守（NADP结合蛋白保守区）,推测该基因是一个脂酰辅酶A还原酶基因。     

无核小枣木质素合成基因Zj4CL的克隆和表达分析

为研究无核小枣果实无核形成机理,应用RT-PCR扩增技术首次从无核小枣果实中克隆得到4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL,4-Coumarate:Coenzyme A Ligase)基因,该序列长度1819 bp,包含1776 bp的完整开放阅读框,编码591个氨基酸,命名为Zj4CL(登陆号KP279930)。Zj4CL与基因组序列比对发现,该基因组含有5个外显子,4个内含子。序列比对和结构域分析表明,Zj4CL包含4CL基因家族的Box I和Box II保守区。进化树分析显示,Zj4CL与苹果(XP_008362825)的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析表明,无核小枣在花后30 d左右基因表达量达到最大值,到花后40 d以后表达量明显下降。     

洋常春藤HMGS基因克隆与表达分析

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶(HMGS)是MVA途径中的关键酶基因,其作用主要是催化乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A缩合成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-Co A)。为分析洋常春藤HMGS基因在常春藤皂苷生物合成途径中的功能及调控机制,本研究利用RACE克隆技术克隆获得了洋常春藤HMGS基因c DNA全长序列并进行了生物信息学分析。结果表明:洋常春藤HMGS基因的c DNA全长1 751bp,命名为Hh HMGS(Gen Bank登录号:KX056075),其包含编码468个氨基酸的开放阅读框。预测该基因编码的蛋白质分子量为52.0 k D,理论等电点为5.99。氨基酸序列比对结果表明,洋常春藤中的HMGS与人参的HMGS同源性最高,达到95%。通过RT-q PCR分析Hh HMGS基因在洋常春藤中的时空表达规律,结果表明Hh HMGS基因与常春藤皂苷含量之间并未呈现出相关性。本研究为探讨HMGS基因在常春藤皂苷生物合成途径中的作用以及深入的研究该基因的分子调控机制奠定基础。     

光皮桦中4-香豆酸辅酶A连接酶基因Bl4CL的克隆和表达分析

以从光皮桦茎叶组织提取的mRNA为模板,根据其他已克隆到的阔叶类树种中4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)基因的同源序列设计兼并引物,进行RT-PCR扩增,获得部分基因片段,然后结合5’,3’RACE方法从光皮桦中扩增出1个4CL基因的全长cDNA序列,命名为Bl4CL。该基因cDNA全长为1983bp(GenBank登录号FJ410448),具有完整的开放阅读框架(69～1697bp),编码蛋白为542个氨基酸,包含一个AMP结合功能域和一个含有12个氨基酸的功能基序。与其他植物中的4CL进行同源性比对的结果显示,Bl4CL蛋白与东北白桦的同源性最高,达到了98%。该基因在光皮桦的根和茎中表达量较高,而在花和叶中的表达量低。     

保幼激素合成的研究进展

保幼激素 (juvenile hormone,JH) 是通过甲羟戊酸途径合成的一类倍半萜化合物。以昆虫中普遍存在的JH Ⅲ为例,从分子水平上概述了JH合成途径中的各种酶,并对其中的两个关键酶：羟甲基戊二酰辅酶A还原酶和保幼激素酸甲基转移酶作了详细介绍。还从家蚕基因组数据库(http://silkworm.genomics.org.cn)中推测出了JH合成途径中大部分酶的编码基因,初探了JH合成的调节机制,讨论了JH合成的研究趋势。     

毕赤酵母底盘芳香族氨基酸合成途径改造生产肉桂酸及对香豆酸*

目的:改造毕赤酵母使其异源合成类黄酮生物合成途径的重要中间体肉桂酸、对香豆酸,并优化前体芳香族氨基酸生物合成途径以提高毕赤酵母的生产能力。方法:在毕赤酵母GS115中利用乙醇诱导型人工转录系统表达Rhodotorula glutinis来源的苯丙氨酸解氨酶,并在该重组菌株中分别过表达胞内芳香族氨基酸生物合成途径中的关键酶或其突变体以进行优化。结果:异源表达苯丙氨酸解氨酶可使毕赤酵母将自身产生的L-苯丙氨酸、L-酪氨酸转化为肉桂酸(38.8 mg/L)、对香豆酸(34.2 mg/L),而通过过表达相关酶进行优化,最终肉桂酸和对香豆酸的产量分别达到124.1 mg/L和302.0 mg/L。结论:利用新的异源宿主毕赤酵母成功合成了肉桂酸、对香豆酸,并对胞内的芳香族氨基酸生物合成途径进行了优化,表明毕赤酵母具有生产黄酮类化合物的应用潜力,也为其他芳香族氨基酸衍生物或植物化合物在毕赤酵母中的异源合成奠定了基础。     

产对香豆酸酿酒酵母菌株的构建及优化

对香豆酸(p-coumaric acid)作为苯丙素类物质、芪类物质及黄酮类物质的重要前体化合物,在生物医药、化妆品及食品工业中均有广泛的应用价值。以酿酒酵母作为底盘菌株,利用合成生物学原理构建一株高产对香豆酸的人工酵母细胞。通过对比不同拷贝数的酪氨酸解氨酶(tyrosine ammonia lyase)合成的对香豆酸产量,发现随着基因拷贝数的增加对香豆酸的产量也相应提高;同时对酪氨酸的负反馈调控相关的蛋白质进行氨基酸定点突变得到Aro4pK229L和Aro7pG141S,利用delta位点将突变后的基因整合至酵母基因组,并挑取24株构建成功的酵母细胞进行发酵验证,发现菌株最高产量与最低产量相差28.87mg/L;为了进一步增加对香豆酸的代谢通量,对生成芳香醇类物质的旁路基因ARO10和PDC5进行敲除,发现同时敲除两个基因的菌株对香豆酸的产量最高,是敲除前产量的2.05倍(从42.71mg/L到87.56mg/L)。此外,通过设计前体酪氨酸的梯度添加实验,发现当添加1mmol/L的酪氨酸时,对香豆酸产量达到峰值(174.57±0.30)mg/L,相较于未添加时提高了将近1倍。通过运用合成生物学原理在酿酒酵母中实现了对香豆酸的高产,为后续的芪类化合物和黄酮类化合物生物合成奠定了基础。     

三种互花米草天然化合物降尿酸作用研究

采用腹腔注射次黄嘌呤的方法构建高尿酸血症小鼠动物模型,选择苯溴马隆为阳性对照,选择互花米草精粉和去糖互花米草精粉作为拟阳性对照,研究异戊基奎尼酸(绿原酸)、苜蓿素和对香豆酸三种互花米草天然化合物的降尿酸作用。结果表明:对香豆酸可显著降低高尿酸血症小鼠的血清尿酸和血糖水平,其降尿酸和降血糖效果优于苯溴马隆。对香豆酸、绿原酸和苜蓿素能降低血清肌酐、尿素氮、总胆固醇和甘油三酯水平,同时还可以显著提高血清总蛋白浓度,具有一定的保护肾、降血脂作用。研究结果也表明,互花米草精粉具有更强的保肾护肝作用。     

木质素生物合成中C3H/HCT的研究进展

木质素是由三种不同的木质素单体聚合而成的,其含量和单体组成与植物体的综合利用密切相关。木质素单体的生物合成途径涉及到许多酶的参与,C3H/HCT是发现较晚的两个酶,在从对-香豆酰辅酶A（p-coumaroyl CoA）到咖啡酰辅酶A（caffeoyl CoA）的羟基化过程中起作用,是控制木质素H-单体与G/S-单体相互转化的关键酶。该文主要对C3H/HCT的研究进展及在木质素生物合成中的作用进行了阐述。     

热稳定酯酰辅酶A合成酶的异源表达及酶学特性

【目的】为寻找能合成丙酰辅酶A和丁酰辅酶A等聚酮合成前体的生物催化剂,用体外酶学实验对一个酯酰辅酶A合成酶进行了表征。【方法】利用丙二酰辅酶A合成酶作为输入序列,通过BLAST程序在Caldicellulosiruptor owensensis OL的基因组中找到1个酯酰辅酶A合成酶基因。在大肠杆菌中进行了异源表达,并通过亲和层析进行纯化。底物谱、最适反应条件、稳定性和动力学参数通过体外酶学实验进行表征,而定点突变则用于活性中心的氨基酸残基的分析。【结果】该酶具有较好的底物宽泛性,可识别丙酸、丁酸、2-甲基丙酸、戊酸、3-甲基丁酸、2-甲基丁酸以及环己甲酸等一系列单酸。反应最适温度为30°C,最适p H为7.0。70°C保温8 h后仍有45%的活性残留,表明该酶相对比较稳定。通过活性中心3个位点的定点突变可以改变酶的底物特异性。【结论】C.owensensis OL来源的酯酰辅酶A合成酶是潜在的生物催化剂,可以用于聚酮前体的合成。     

3-(4-羟基苯基)丙酸在酿酒酵母中的生物合成

3-(4-羟基苯基)丙酸(HPPA)是一种芳香类化合物,作为中间体主要应用于医药、食品、化学领域,具有重要的经济价值。旨在实现HPPA在酿酒酵母中的从头合成,通过在酿酒酵母中过表达约氏黄杆菌来源的酪氨酸转移酶(Fj TAL)、拟南芥来源的对香豆酰辅酶A连接酶(At4CL),同时利用酿酒酵母BY4742自身来源的超长链烯酰辅酶A还原酶(Sc TSC13)、硫酯水解酶,实现了在酿酒酵母中从头合成HPPA,产量约为70 mg/L左右。在以4 mmol/L酪氨酸为前体、半乳糖诱导Fj TAL过表达、30℃发酵培养72 h的条件下,约36%的酪氨酸转化生成对香豆酸;在以4 mmol/L对香豆酸或咖啡酸为前体,半乳糖诱导At4CL过表达,同时利用酵母内源Sc TSC13、硫酯水解酶,30℃发酵培养72 h的条件下,约94%的对香豆酸被还原成HPPA,约91%的咖啡酸被还原成3,4-二羟基苯丙酸(DHPPA),为进一步生物合成HPPA及其衍生物奠定了基础。     

产对香豆酸酿酒酵母工程菌株的构建与优化

对香豆酸是黄酮类、芪类等天然活性化合物的重要前体,在生物医药、食品等行业应用广泛。与传统植物提取和化学合成相比,微生物合成对香豆酸因其具有生产周期短、转化效率高等优势而得到广泛关注。为构建高产对香豆酸酵母工程菌株,以酿酒酵母为出发菌,通过敲除酪氨酸合成竞争路径基因ARO10和PDC5,突变芳香族氨基酸合成调控基因ARO4^K229L与ARO7^G141S、解除酪氨酸负反馈抑制、并整合酪氨酸解氨酶FjTAL,获得的工程菌C001对香豆酸产量为296.73 mg/L。为进一步提高对香豆酸合成前体积累,分别敲除8个与氨基酸、糖类等转运相关基因并强化糖异生途径,分析其对对香豆酸积累的影响。结果表明,敲除GAL2及过表达EcppsA,对香豆酸产量提高至475.11 mg/L。最后,分析了FjTAL蛋白锚定至酵母液泡对产物积累的影响,结果表明其定位液泡后对香豆酸产量明显提升,达到593.04mg/L。通过强化前体物供应,阻断竞争旁路途径,利用亚细胞定位等策略有效提高对香豆酸产量,为后续黄酮类及芪类化合物的合成提供高效平台菌株,具有重要的应用前景。     

84K杨PagC3H3基因表达模式分析

木质素作为木材的主要组成成分,通常是由3种单体聚合而成,在其生物合成过程中,共有10个酶家族参与负责将苯丙胺酸转化为单体木质素,其中C3H是在对-香豆酰辅酶A（p-coumaroyl CoA）到咖啡酰辅酶A（caffeoyl CoA）的羟基化过程和G/S单体形成中的关键控制酶类,探究PagC3H3基因表达模式,对于进一步了解该基因功能具有重要意义。该研究通过定量PCR对PagC3H3基因的组织特异性表达进行分析;克隆得到了长度为2 035 bp的PagC3H3的启动子序列,预测含有多个顺式作用元件;同时,将获得的PagC3H3的启动子序列构建植物表达载体pBI121-PagC3H3pro：：GUS,进行拟南芥瞬时转化,结果显示PagC3H3基因在84K杨的根、中部茎节和基部茎节中的表达量较高;瞬时转化拟南芥,GUS染色表明：在下胚轴和根中GUS活性较强,由此推测PagC3H3基因在木质素合成过程中发挥作用。     

光皮桦中4-香豆酸辅酶A连接酶基因B14CL的克隆和表达分析

以从光皮桦茎叶组织提取的mRNA为模板,根据其他已克隆到的阔叶类树种中4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL）基因的同源序列设计兼并引物,进行RT—PCR扩增,获得部分基因片段,然后结合5’,3’RACE方法从光皮桦中扩增出1个4CL基因的全长cDNA序列,命名为B14CL。该基因cDNA全长为1983bp（GenBank登录号FJ410448）,具有完整的开放阅读框架（69—1697bp）,编码蛋白为542个氨基酸,包含一个AMP结合功能域和一个含有12个氨基酸的功能基序。与其他植物中的4CL进行同源性比对的结果显示,B14CL蛋白与东北白桦的同源性最高,达到了98％。该基因在光皮桦的根和茎中表达量较高,而在花和叶中的表达量低。     

金钟藤中酚类化合物的研究

从金钟藤(Merremia boisiana(Gagnep.)V.Ooststr.)的地上部分分离得到8个酚类化合物。通过光谱分析,分别鉴定为东莨菪内酯(1)、七叶内酯(2)、N-p-香豆酰酪胺(3)、3,5-二咖啡酰基奎尼酸甲酯(4)、3,4-二咖啡酰基奎尼酸甲酯(5)、3,4,5-三咖啡酰基奎尼酸甲酯(6)、槲皮素(7)以及山奈酚-3-β-D-半乳糖甙(8)。这些化合物均是首次从鱼黄草属(Merremia)植物中发现。