鸮形目4种鸟类线粒体调控区全序列的测定与比较研究

利用Long-PCR和Primer Walking的方法对鸮形目的短耳鸮、长耳鸮、纵纹腹小鸮、灰林鸮4种鸟类的线粒体调控区进行了全序列测定。结果表明：短耳鸮的调控区跃度为3290bp;长耳鸮为2848bp;纵纹腹小鸮为2444bp;灰林鸮为1771bp。短耳鸮的调控区长度是4种鸮中最大的,并且是目前已知最大的鸟类线粒体调控区。这4种鸮类调控区的基本结构和其他鸟类相似,按照碱基变化速率的不同可以分为3个区：碱基变化速率较快的外围区域Ⅰ、Ⅲ和保守的中间区域Ⅱ。这4种鸟类调控区的3’端均存在大量的串联重复序列,短耳鸮为126bp单元重复7次和78bp单元重复14次;长耳鸮为127bp单元重复8次和78bp单几重复6次;纵纹腹小鸮有3个重复单元,分别为89bp单元重复3次、77bp单元重复4次和71bp单元重复6次;灰林鸮仅有1个单元的串联重复为78bp重复5次。调控区中串联重复序列可能是由链的滑动错配产生,另外这些重复序列都能形成热力学稳定的多重茎环二级结构,而且在重复序列中还发现一些保守基序,这说明重复序列可能具有一定的生理功能,影响调控区的调重控功能从而影响线粒体基因组的复制和转录。     

鸮形目8种鸟类线粒体DNA多态性研究

采用14种限制性内切酶,对鸮形目8种鸟类(Tyto alba、T.capensis、Otus bakkamoena、O.scops、Asio otus、A.flammeus、Strix aluco、Glaucidium cuculoides)线粒体DNA进行限制性片段长度多态分析, 结果表明:不同种间存在基因组长度多态性,短耳鸮为23.35 kb,长耳鸮为19.78 kb,斑头鸺鹠为18.62 kb,红角鸮为17.65 kb.鸮形目种间具有较高的遗传变异,其中仓鸮和草鸮的平均遗传距离为1.0%,长耳鸮和短耳鸮平均为10.8%,红角鸮和领角鸮平均为13.1%,灰林鸮和斑头鸺鹠为12.3%,其中红角鸮与斑头鸺鹠的平均遗传距离最大为17.5%.鸮形目鸟类线粒体DNA的进化速率为每百万年变化2.0%～2.2%,提示鸮形目两个科间在距今2 800～3 000万年前分歧开来,同时,鸱鸮科各种间的分歧时间在距今2 000～2 500万年前,即处于中新世中期.     

龟鳖类线粒体全基因组的比较研究

在基因组水平上,比较分析了已登录GenBank的19种龟鳖类线粒体全基因组的结构特征．结果表明：1）除平胸龟、扁陆龟外,其余17种龟鳖类线粒体基因组结构、基因排列顺序均与典型的脊椎动物相似,显示龟鳖类线粒体基因组在进化上十分保守：2）19种龟鳖类线粒体全基因组和各部分的碱基组成均表现出高AT、低G含量的偏向,在控制区中表现尤为明显：3）除中华鳖和白腹摄龟外,其余种类的某些蛋白编码基因中都存在一个或多个额外插入的核苷酸：4）除侧颈龟亚目的非洲侧颈龟外,其余18种曲颈龟线粒体DNA的“WANCY”区中都存在轻链复制起始点（OL）,且它们的二级结构、核苷酸组成高度保守,推测该结构可能是曲颈龟亚目的一个共同特征：5）部分龟鳖类线粒体基因组控制区3’端存在大片段（200～450bp）的重复序列,某些龟鳖类中有由（AT）构成的微卫星序列,并且这些拷贝序列在种间表现出一定的差异,其可作为特异的分子标记,对于龟鳖类动物系统学的研究、亲缘关系的鉴定、物种多样性的保护和研究等方面具有重要的参考价值．     

缅甸蟒线粒体基因组全序列测定与分析

采用LA-PCR(long and accurate PCR)、巢式PCR及TA克隆测序技术,首次获得缅甸蟒Python bivittatus线粒体基因组全序列(GenBank登录号NC_021479)。分析结果表明:缅甸蟒线粒体全长17 617 bp,与其它多数蛇类线粒体基因组结构相似,由13个蛋白编码区、2个rRNA、22个tRNA和双控区组成,基因间排列紧凑;与蟒属其它物种相比,缅甸蟒线粒体在氨基酸数目上存在增减现象;tRNA中tRNA-Cys长度最短,只有57 bp,二氢尿嘧啶环无配对的茎区;缅甸蟒在两个控制区各存在3个相同的串联重复,可能是造成个体间相差87~89 bp的原因。     

中国鸮形目鸟类分类现状

鸮形目Strigiformes鸟类是一类适应夜行性生活的猛禽,主要于夜间活动,体色暗而斑驳,难于直接观察。我国关于鸮类分类的研究报道并不多见,长期沿用的一些种属名和目前国际上通用的相比已显陈旧。通过参阅相关文献,对我国现生鸮形目鸟类的分类系统进行了整理,计有2科12属33种。并指出需要迫切关注的物种和研究内容,其中毛脚渔鸮Bubo blakistoni为濒危种,四川林鸮Strixdavidi为易危种且是我国特有种,这两种鸮类国内相关报道罕见,亟待开展进一步研究工作以加强对这两个物种的保护管理。鬼鸮甘肃亚种Aegolius funereus beickianus的分类地位仍存在争议。鸮类的声学研究在我国几乎一片空白,鸮类的繁殖生物学研究也需要引起我国鸟类学工作者的足够重视。     

棕头鸥线粒体基因组全序列测定与分析

基于长距PCR扩增及保守引物步移法测定并注释了棕头鸥(Larus brunnicephalus)的线粒体基因组全序列。结果表明,棕头鸥线粒体基因组全长16 769 bp,GenBank登录号JX155863。基因含量和排列次序与红原鸡一致,包含13个蛋白编码基因、22个tRNA、2个rRNA和一个D-loop区(控制区)。除COI基因以GTG、ND3基因以ATT为起始密码子外,其余11个蛋白质编码基因均以ATG起始。11个蛋白质编码基因以典型的完全终止密码子AGG、TAG、TAA或AGA终止,COIII和ND4基因为不完全终止密码子T。预测了22个tRNA基因的二级结构,发现tRNASer(AGN)缺少DHU臂,tRNAPhe的TψC臂出现第4种排列形式。预测的棕头鸥12S和16S rRNA二级结构分别包括4个结构域47个茎环和6个结构域60个茎环。其他鸟类控制区发现的F-box、E-box、D-box、C-box、B-box、Bird similarity-box和CSB-boxes(1-3)也存在于棕头鸥中,预测了控制区H链复制起始序列OH和双向复制起始序列LSP/HSP。系统发育分析支持将棕头鸥划归为面具鸥族(Masked gulls)。     

银环蛇线粒体基因组全序列分析

根据GenBank公布的蛇类物种线粒体基因序列和已知的引物序列,总共设计和合成了9对引物.采用保真度较高的Ex-Taq酶,以总基因组DNA为模板进行PCR扩增,产物纯化后进行TA克隆和步移测序,拼接后获得了全长17 144 bp银环蛇线粒体基因组全序列.其共编码13种蛋白质、2种rRNA和22种tRNA.这些基因没有内含子,基因间排列紧密,仅有极少或完全没有核苷酸,甚至相互重叠.除了含有2个调控线粒体基因组复制和转录的控制区外,其余基因在长度和位置等方面与其它脊椎动物均具有较高的同源性.     

菜粉蝶线粒体基因组的全序列测定和分析

目前关于蝶类线粒体基因组全序列及其分子进化的研究还不多见。本研究通过长PCR和引物步移法对菜粉蝶Pieris rapae Linnaeus线粒体基因组全序列进行了测定和初步分析。结果表明：菜粉蝶线粒体基因组全长15 157 bp, 包含13个蛋白编码基因、22个tRNA和2个rRNA基因以及1个非编码的控制区域, 它们的长度分别是11 196 bp, 1 474 bp, 2 093 bp和393 bp。37个基因的位置与已报道的其他蝶类基本一致, 共有10对基因间存在总共59 bp的重叠, 重叠碱基数在1~35 bp之间; 基因间隔序列共计13处120 bp, 间隔长度1~46 bp不等, 最大的基因间隔46 bp, 位于tRNA^Ile和tRNA^Gln基因之间。另外, 基于13个蛋白质编码基因的氨基酸序列, 重建了基于蛋白质编码基因序列数据的11种代表性蝶类的NJ和MP系统树。结果表明:凤蝶类(包括凤蝶和绢蝶)为一大支系, 粉蝶类、 灰蝶类与蛱蝶类(包括蛱蝶、 珍蝶)构成另一大支系。结果不支持粉蝶科与凤蝶科（包括凤蝶类和绢蝶类）构成单系群, 却显示粉蝶科、 灰蝶科和蛱蝶科的组合为单系群。     

鸻形目鸟类线粒体基因组测序策略

鸻形目（Charadriiformes）,全世界约有384个物种,分属于19科94属,种类繁多、分布广泛,是研究迁徙和觅食行为的良好材料。近年来,线粒体基因组的研究快速发展,由于样品难以收集,缺乏系统的测序策略,鸻形目鸟类线粒体基因组的研究相对滞后。引物设计对聚合酶链式反应（PCR）至关重要,一个成功的PCR实验依赖于高质量的特异性引物,本研究拟设计一套用于鸻形目鸟类线粒体基因组扩增的通用引物。对GenBank中现有的鸻形目物种线粒体基因组进行多重比对,发现若干个保守性区域,本研究在该区域设计13对扩增鸻形目鸟类线粒体基因组的通用引物,扩增的目的片段长度均在1.5 kb左右。我们选取4个物种,即灰头麦鸡（Vanellus cinereus）、丘鹬（Scolopax rusticola）、白腰草鹬（Tringa ochropus）和针尾沙锥（Gallinago stenura）,进行PCR扩增验证,设计的引物在4个物种中均能顺利扩增、测序,该引物在鸻形目鸟类线粒体基因组扩增中的具有普遍适用性。本研究设计的13对通用引物在扩增鸻形目物种线粒体全基因组中具有较强的应用价值,将为鸻形目的系统发育关系、种群遗传学和生物地理学研究提供珍贵的资源。     

麦穗鱼线粒体基因组序列测定及分析

利用麦穗鱼Pseudorasbora parva和相关鱼类的部分线粒体基因序列,设计出2对长批引物和30对短批引物,采用基于长PCR的2次PCR扩增法测定并注释麦穗鱼线粒体基因组全序列。结果表明,麦穗鱼线粒体基因组长16600bp,A+T含量为58.9%,37个基因位置及组成与其它硬骨鱼一致,均由13个蛋白编码基因、22个tRNA、2个rRNA基因和1个控制区(D-loop)组成。其中L链仅含8个tRNA(Pro、T yr、Ser、Ala、Asn、Cys、Glu、Gln)及ND6基因,其余基因皆由H链编码。基因排列紧密,间隔序列共计13处64bp,长度从1～32bp不等;基因重叠区7处23bp,重叠碱基数在1～7bp之间。13个蛋白编码基因中,除COI起始密码子为GTG外,其余均以ATG为起始密码子;有8个基因(ND1、ND2、COI、ATP6、ATP8、ND4L、ND5、ND6)3’端有完全的TAA或TAG终止密码子,其它5个基因终止密码子为不完整的TA(ND3和ND4)或T(COⅡ,COⅢ,Cyt b)。除tRNASer(AGY)外,其余21个tRNA基因的二级结构均为典型的三叶草结构。预测的lrRNA二级结构共有6个结构域,53个茎环结构,srRNA二级结构包含43个茎环结构。控制区(D-loop)存在3个结构区:终止序列区(TAS)、中央保守区(CSB-F、CSB-D)和保守序列区(CSB-1、CSB-2、CSB-3),其中TAS与DNA复制终止相关,出现茎环结构。     

形目8种鸟类线粒体DNA多态性研究

采用１４种限制性内切酶,对号鸟形目８种鸟类（Ｔｙｔｏａｌｂａ、Ｔｃａｐｅｎｓｉｓ、Ｏｔｕｓｂａｋｋａｍｏｅｎａ、Ｏｓｃｏｐｓ、Ａｓｉｏｏｔｕｓ、Ａｆｌａｍｍｅｕｓ、Ｓｔｒｉｘａｌｕｃｏ、Ｇｌａｕｃｉｄｉｕｍｃｕｃｕｌｏｉｄｅｓ）线粒体ＤＮＡ进行限制性片段长度多态分析,结果表明：不同种间存在基因组长度多态性,短耳号鸟为２３３５ｋｂ,长耳号鸟为１９７８ｋｂ,斑头鸺留鸟为１８６２ｋｂ,红角号鸟为１７６５ｋｂ。号鸟形目种间具有较高的遗传变异,其中仓号鸟和草号鸟的平均遗传距离为１０％,长耳号鸟和短耳号鸟平均为１０８％,红角号鸟和领角号鸟平均为１３１％,灰林号鸟和斑头鸺留鸟为１２３％,其中红角号鸟与斑头鸺留鸟的平均遗传距离最大为１７５％。号鸟形目鸟类线粒体ＤＮＡ的进化速率为每百万年变化２０％～２２％,提示号鸟形目两个科间在距今２８００～３０００万年前分歧开来,同时,鸱号鸟科各种间的分歧时间在距今２０００～２５００万年前,即处于中新世中期。     

北京鸭线粒体基因组全序列测定和分析

线粒体DNA作为遗传标记,已在家鸡(Gallus gallus)和家鹅(Anser anser)的研究中取得了重大进展,而对家鸭(Anas platyrhychos domesticus)的研究却很少.本研究参照近源物种线粒体基因组序列设计15对引物,通过PCR扩增、测序、拼接,获得北京鸭(A.platyrhychos)线粒体基因组全序列,初步分析其特点和各基因的定位.结果显示,北京鸭线粒体基因组全长16 604 bp,碱基组成为29.19%A、22.20%T、15.80%G、32.81%C,包含13个蛋白质编码基因、2个rRNA基因、22个tRNA基因和1个非编码控制区(D-loop),基因组成及排列顺序与其他鸟类相似.基于线粒体D-loop区全序列,用N-J法构建了7种雁形目鸟类系统进化树,结果表明,北京鸭与绿头鸭(A.platyrhychos)系统进化关系较近.     

赤麂线粒体全基因组的序列和结构

提取赤麂细胞株总DNA,参照我们实验室已测定的同属动物小麂线粒体全基因组序列设计引物,PCR扩增、测序、拼接,获得赤麂线粒体全基因组序列并进行生物信息学分析。赤麂线粒体全基因组序列全长16354bp。定位了22个tRNA基因、2个rRNA基因、13个蛋白编码基因和1个D-loop区。赤麂与小麂及其它哺乳动物线粒体的基因组结构相同,它们的序列同源性都较高。     

云斑车蝗线粒体基因组全序列测定与分析

采用长距 PCR 扩增及保守引物步移法并结合克隆测序测定并注释了云斑车蝗 Gastrimargus marmoratus （Thunberg）的线粒体基因组全序列。结果表明：云斑车蝗线粒体基因组全序列为15 904 bp（GenBank登录号为EU527334）,A+T含量略高于非洲飞蝗Locusta migratoria,为76.04%,包括13个蛋白质编码基因,22个tRNA 基因,2个rRNA基因和一段1 057 bp的A+T富集区。蛋白质基因的起始密码子中,除COⅠ和ND5为TTG以外,均为昆虫典型的起始密码子ATN。ND5基因使用了不完全终止密码子T,其余基因均为典型的TAA或TAG。预测了22个tRNA基因的二级结构,发现tRNA^Ser（AGN）缺少DHU臂, tRNA^Ser（UGY）的反密码子环上有9个碱基。预测了云斑车蝗12S和16S rRNA二级结构,分别包括3个结构域30个茎环和6个结构域44个茎环。A+T富集区含有3个串联重复序列。     

广西华珊瑚蛇线粒体基因组全序列测定与分析

本研究对眼镜蛇科广西华珊瑚蛇（Sinomicrurus peinani）线粒体基因组序列进行测定与分析,并探究其与近缘种的系统发育关系。结果表明,广西华珊瑚蛇线粒体基因组是一条全长19 477 bp的环状DNA,基因组碱基构成为A（33.4%）、T（28.1%）、C（26.6%）和G（11.9%）。共编码38个基因,包含2个核糖体RNA（rRNA）基因、22个转移RNA（tRNA）基因、13个蛋白质编码基因及1个线粒体基因控制区（D-loop）。13个蛋白质编码基因均采用AUG作为起始密码子,UAA和UGA作为终止密码子;蛋白质编码基因编码频率较高的氨基酸分别为亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）、苏氨酸（Thr）和丝氨酸（Ser）;相对密码子使用度（RSCU）频率最高的4个密码子依次是CGA、UGA、CUA和CCA。22个tRNA,除tRNASer（一臂两环）外其他均可形成典型三叶草结构。基于眼镜蛇科线粒体基因组系统发育分析结果表明,与广西华珊瑚蛇关系最密切的是中华珊瑚蛇（Sinomicrurus macclellandi）,其次是孟加拉眼镜蛇（Naja kaouthia）与眼镜王蛇（Ophiophagus hannah）。     

Xiao形目8种鸟类线粒体DNA多态性研究

采用１４种限制性内切酶,对Ｘｉａｏ形目８种鸟类线粒体ＤＮＡ进行限制性片段长度多态分析,结果表明：不同种间存在基因组长度多态性,短耳Ｘｉａｏ为２３．３５ｋｂ,长耳Ｘｉａｏ为１９．７８ｋｂ斑头鸺Ｌｉｕ为１８．６２ｋｂ,红鱼Ｘｉａｏ为１７．６５ｋｂ。Ｘｉａｏ形目种间具有较高的遗传变异,其中仓Ｘｉａｏ和草Ｘｉａｏ的平均遗传距离为１．０％,长耳Ｘｉａｏ和短耳Ｘｉａｏ平均为１０．８％,红角Ｘｉａｏ和领角Ｘｉａ     

中华攀雀线粒体基因组全序列测定与分析

该研究使用长PCR扩增和引物步移法测定了中华攀雀(Remiz consobrinus)线粒体基因组全序列,在对序列进行拼接和注释的基础上,分析了其结构、序列组成及蛋白编码基因密码子使用情况等,并对22个tRNA和2个rRNA的二级结构以及控制区结构进行了预测及系统发育分析,为雀形目鸟类的系统发育研究提供了新信息。中华攀雀线粒体基因组全长16737bp,GenBank登录号KC463856,碱基A、T、C、G的含量分别为27.8%、21.5%、35.4%及15.3%,37个基因排列顺序与已报道的其他鸟类基本一致,包含13个蛋白编码基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因及1个非编码的控制区(D-loop),有18对基因间共存在77bp的间隔,7对基因间共存在30bp的重叠。除ND3基因的起始密码子为ATT外,其余均为标准的ATG,11个蛋白编码基因的终止密码子为TAA、TAG、AGA或AGG,2个为不完全终止密码子T(COⅢ、ND4)。除tRNASer-AGNDHU臂缺失外,其余21个tRNA均可形成典型的三叶草结构,在出现的27处碱基错配中有19处为常见的G-U错配。SrRNA和LrRNA二级结构分别包含3个结构域47个茎环结构和6个结构域60个茎环结构,与所发表的其他鸟类rRNA二级结构大体一致。中华攀雀控制区发现了同样存在于其他鸟类控制区的保守框F-box、D-box、C-box、B-box、Bird similarity-box和CSB1-box。该研究支持将攀雀科作为独立的科,同时,支持莺总科与攀雀科的单系性。     

大卫绢蛱蝶线粒体基因组全序列测定和分析

目前有关蝶类线粒体基因组全序列及其分子进化的研究报道还不多见。本文利用long PCR和引物步移法得到大卫绢蛱蝶Calinaga davidis的线粒体基因组全序列, 同时就其基因组成和结构特点作了初步分析。结果显示： 其基因组全长为15 267 bp (GenBank登录号为HQ658143), 包括13个蛋白质编码基因(ATP6, ATP8, COI-III, ND1-6, ND4L, Cytb)、22个tRNA基因、2个rRNA基因(16S和12S)以及非编码的控制区。与其他鳞翅目昆虫相一致, 其基因组未出现基因重排现象。基因组共包含11个基因间隔区,总长度为130 bp, 间隔长度1~46 bp, 最大间隔在tRNA^Gln与ND2基因之间; 基因间共存在13处重叠, 总长度为66 bp, 重叠碱基数1~35 bp, 最长的重叠区位于COII与tRNA^Lys基因。lrRNA和srRNA基因长度分别为1 337 bp和773 bp; 除tRNA^Ser(AGN)缺少二氢尿嘧啶臂(DHU stem), 在相应的位置上只形成一个简单环外, 其余的tRNA基因都能形成典型的三叶草结构。13个蛋白编码基因总长度为11 247 bp, 共有3 737个密码子, 它们的碱基组成和密码子的使用具有明显的偏倚性; 除COI外(起始密码子TTG), 其余的12个蛋白质编码基因都以标准的ATN作为起始密码子; COI基因终止密码子为不完全T, ND4基因终止密码子为不完全TA, 其余基因都以TAA为终止密码子。A+T丰富区全长为389 bp, A+T含量高达92.0%, 其中存在2段类似微卫星的重复序列(TA)₆和(AAT)₄。本文的研究结果为探讨绢蛱蝶亚科在蛱蝶科中的系统学地位及其与其他亚科间的系统发生关系等问题提供了重要的分子生物学数据。     

短尾蝮蛇线粒体基因组全序列分析

参照近缘物种的线粒体基因序列设计并筛选得到8对引物,结合TA克隆和步移测序获得了全长17227bp的短尾蝮蛇线粒体基因组全序列.与多数蛇类线粒体基因组类似,其共编码包括13个蛋白、2个rRNA和22个tRNA在内的37个基因,另外还包含2个非编码的富含AT的控制区.基因间排列紧凑,多数基因间间隔极短甚至发生重叠.除nad1、cox1和nad3外,多数蛋白编码基因均以ATG作为起始密码子,终止密码子的使用则存在TAA、AGA、AGG和不完全的T4种情况.基于合并的19个tRNA基因序列组合数据采用NJ、MP和ME3种算法对21种蛇进行了初步的系统发育分析,结果表明,各主要分类单元之间的亲缘关系与前人基于形态学、线粒体12SrRNA和cytb基因序列研究的结论完全一致,这证实了基于合并的线粒体tRNA基因序列进行蛇类物种DNA分子系统学研究的可行性.     

黑尾地鸦线粒体基因组序列测定与分析

采用长PCR扩增的线粒体DNA和引物步移法, 测定并注释了中国特有鸟类-黑尾地鸦(Podoces hendersoni)的线粒体基因组全序列。黑尾地鸦的mtDNA序列全长16 867 bp, GenBank登录号GU592504。基因含量和排列次序与原鸡的一致, 包含13个蛋白编码基因、22个tRNA、2个rRNA和1个控制区(D-loop)。除COI基因以GTG作为起始密码子外, 其余12个蛋白质编码基因均以典型ATG密码子起始。11个蛋白编码基因以完全终止密码子TAA、AGG或AGA终止, COIII和ND4基因终止密码子为不完整的T。tRNA^Ser(AGY)的DHU臂缺失, tRNA^Leu(CUN)的反密码子环由9个碱基构成, 而不是标准的7个碱基。其余的20个tRNA基因的二级结构均属典型的三叶草结构。预测了rRNA的二级结构, 其中, 12S rRNA二级结构包含4个结构域, 43个茎环结构; 16S rRNA的二级结构包含6个结构域, 55个茎环结构。此外, 在其他鸟类控制区中所发现的F-box、D-box、C-box、B-box、Bird similarity-box和CSB1-box也同样存在于黑尾地鸦中。