大肠杆菌BL21(DE3)lpxM突变株的构建

目的:lpxM基因失活可以产生极低内毒素活性的脂多糖。构建大肠杆菌BL21(DE3)的lpxM突变株,并考察该突变株的生长状态和表达重组蛋白的能力。方法:构建同源臂长500bp左右的打靶载体,借助Red同源重组系统,使E.coliBL21(DE3)的lpxM基因发生插入失活,再导入编码FLP位点特异性重组酶的质粒pCP20去除抗性基因。PCR鉴定发生插入突变的菌株,应用SDS-PAGE分析突变前后的脂多糖,考查对重组蛋白表达的影响。结果:PCR鉴定结果说明lpxM基因发生了插入突变。与出发株比较,突变株的脂多糖电泳图谱发生了明显变化,但其生长状态与表达重组蛋白的能力与出发株基本一致。结论:大肠杆菌BL21(DE3)的lpxM突变株可以用于重组蛋白的表达。     

大肠杆菌ptsHIcrr操纵子的快速敲除及敲除菌生长性能测定

敲除大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(简称PTS系统)ptsHIcrr操纵子,考察敲除菌株生长特性并将其与ptsG敲除菌进行比较。利用I-SceⅠ特异性切割和Red同源重组方法成功构建了大肠杆菌DH5α△ptsHIcrr敲除菌。在LB培养基中,DH5α△ptsHIcrr的生长行为与DH5α和DH5α△ptsG明显不同,其最高菌密度是DH5α和DH5α△ptsG的近2倍,而DH5α△ptsG生长行为与DH5α无明显差异。但在含1%葡萄糖的LB中,DH5α△ptsHIcrr和DH5α△ptsG均表现出生长优势,最高菌密度依次是DH5α的2.8和2倍;培养液中最终乙酸含量分别是DH5α的12.2%、47%。在M9修饰培养基中,DH5α△ptsHIcrr比生长速率(1/h)和比葡萄糖消耗速率[g/(g.h)]明显低于DH5α,并略低于DH5α△ptsG。结果说明,ptsHIcrr操纵子敲除菌改变了葡萄糖的代谢速率,并呈现与ptsG基因敲除菌不同的代谢特点。     

一种新的基于Red重组及I-Sec I体内切割的大肠杆菌基因组无痕删减方法

目前常用的基因修饰方法是在Red同源重组介导下,电转线性PCR片段替换染色体上指定序列。因PCR过程错误掺入,该方法常常会在同源序列部位产生一些突变。为了避免此类突变,我们建立了一种新的无痕删除方法。首先将含有抗性标记(两侧带有I-Sec I识别位点)的线性DNA电转到Red重组感受态细胞内,用抗性基因替换基因组上指定序列;然后,将携带融合同源臂(两侧带有I-Sec I位点)的供体质粒导入上述细胞,诱导表达I-Sec I内切酶切割供体质粒释放同源片段,同时切除染色体上抗性基因产生双链断裂,通过分子间同源重组实现无痕删除。我们应用该方法连续删除了大肠杆菌DH1基因组上11个非必需区,使基因组减小10.59%。PCR测序证明所有删减区域同源臂未发生突变,基因组重测序证明指定区域被删除。删减菌的生长变化不大,但耐酸能力有所改变,并对番茄红素合成有不同影响。     

大肠杆菌基因组基因无痕敲除的优化方法

目的：优化大肠杆菌基因组基因无痕敲除的方法,提高无痕敲除的效率。方法：以无痕敲除大肠杆菌nanKETA基因簇为模型,利用Red同源重组系统和核酸内切酶I-SceI的筛选作用,通过两步连续同源重组无痕敲除大肠杆菌CLM37基因组中的nanKETA基因,优化无痕敲除时同源DNA长度与诱导用于筛选阳性克隆I-SceI表达的诱导剂浓度。通过比较敲除nanKETA基因前后菌株的生长曲线,研究大肠杆菌CLM37缺失nanKETA基因后的生长状态。结果：成功无痕敲除大肠杆菌CLM37基因组中的nanKETA基因,并在无痕化处理时,通过延长与基因组同源DNA的长度,由通常使用的80碱基对延长到684碱基对;并通过提高诱导筛选基因表达的四环素的浓度,由500 μg/ml提高到1000 μg/ml后,使无痕敲除效率高达90%以上。生长曲线研究表明,缺失nanKETA基因后的菌株生长状态与原菌株基本一致。结论：通过延长与基因组同源的双链核苷酸的长度和诱导筛选基因表达的四环素的浓度可显著提高无痕敲除的效率。     

大肠杆菌rhtA缺失对血红素合成的影响

【背景】Escherichia coli BL21(DE3)是基因工程的常用宿主,以C5途径合成5-氨基乙酰丙酸(5-Aminolevulinicacid,ALA),ALA是合成血红素的重要前体物质,但ALA分泌对血红素合成的影响尚不清楚。【目的】阐明参与ALA外运的RhtA在血红素合成途径中的作用。【方法】利用Red同源重组,敲除Escherichia coli BL21(DE3)的rhtA,同时构建重组质粒pEA过表达血红素合成途径中的关键酶基因hemA,检测分析血红素及其前体物质含量,以及血红素合成途径中10个关键基因的表达水平。【结果】敲除rhtA对菌体生长没有显著影响,敲除菌株BL21(DE3)Δrht A与原始菌株BL21(DE3)比较,ALA的胞外含量下降23%,血红素含量提高12%,尿卟啉III (Uroporphyrin III,UIII)、粪卟啉III (Coproporphyrin III,CIII)和原卟啉IX (Protoporphyrin IX,PPIX)的含量分别提高25%、15%和18%;敲除rhtA同时过表达hemA的菌株BL21(DE3)ΔrhtA/pEA与仅过表达hemA的菌株BL21(DE3)/pEA比较,胞外ALA减少了16%,血红素含量提高了24%,UIII和CIII含量分别提高55%和64%,PPIX含量显著增加,约为4.7倍。实时定量PCR结果表明,rhtA缺失后,hemC基因转录水平下调,其余9个基因转录水平均有不同程度的上调。【结论】rhtA敲除减少了ALA的外运,使得胞内血红素产量得到提高。     

大肠杆菌PTS系统改造及重组菌生长性能测定

利用Red重组系统对野生大肠杆菌Escherichia coli磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(Phosphoenolpyruvate:carbohydrate phosphotransferase system,PTS)进行修饰改造,敲除PTS系统中关键组分EⅡCBGlc的编码基因(ptsG),磷酸组氨酸搬运蛋白HPr的编码基因(ptsI),同时敲入来源于运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis的葡萄糖易化体(Glucose facilitator)编码基因(glf),构建重组大肠杆菌,比较测定并系统评价了基因敲除和敲入对细胞的生长、葡萄糖代谢和乙酸积累的影响。敲除基因ptsG和ptsI造成大肠杆菌PTS系统部分功能缺失,细胞生长受到一定限制,敲入glf基因后,重组大肠杆菌能够利用Glf-Glk(葡萄糖易化体-葡萄糖激酶)途径,消耗ATP将葡萄糖进行磷酸化并转运进入细胞。通过该途径转运葡萄糖能够提高葡萄糖利用效率,降低副产物乙酸生成,同时能够使更多的碳代谢流进入后续相关合成途径,预期能够提高相关产物产量。     

大肠杆菌ptsG和ptsM突变体的构建及特性研究

目的：敲除大肠杆菌DH5α中与葡萄糖磷酸化转运相关的ptsG、ptsM基因,考察缺陷株生长特性及其可能的应用。方法：PCR扩增靶基因,构建两翼带有靶基因序列并嵌合抗药基因标记的线性片段,利用Red同源重组技术敲除靶基因。结果：成功敲除了大肠杆菌DH5α的ptsG和ptsM基因;在含有葡萄糖的LB培养基中,DH5αΔptsG最高菌密度是亲本的2.8倍,添加吡咯喹啉醌或导入其生物合成基因后能够产酸;DH5αΔptsM最高菌密度是亲本的4/10,有明显的产酸现象。结论：DH5αΔptsG可用于大肠杆菌高密度发酵和吡咯喹啉醌生物合成基因缺陷株筛选。     

地黄核苷二磷酸激酶基因的克隆及生物信息学分析

核苷二磷酸激酶(NDPK)是一种高度保守的多功能蛋白,具有催化底物磷酸化的作用,能够参与植物的生长发育、非生物胁迫、感病应激、光合作用和能量代谢等过程。为了解地黄核苷二磷酸激酶基因(RgNDPKⅠ)的结构、功能和性质,该研究利用地黄转录组学数据,通过电子克隆的方法获得了RgNDPKⅠ基因的全长cDNA序列,长度为765 bp。生物信息学分析结果表明,RgNDPKⅠ基因的开放阅读框长度为447 bp,编码148个氨基酸,具有典型的核苷二磷酸激酶活性结构域和其他磷酸化活性位点。RgNDPKⅠ基因编码的蛋白质定位于细胞质,是无跨膜区域的亲水性蛋白,该蛋白质与芝麻、紫花风铃的核苷二磷酸激酶相似性较高,分别为97%和96%。在多种生物中已经克隆得到了核苷二磷酸激酶基因,且不同植物核苷二磷酸激酶氨基酸序列中存在多个相似的保守结构域,推测RgNDPKⅠ基因所编码的蛋白质为核苷二磷酸激酶超家族成员。该研究结果为进一步探明RgNDPKⅠ的性质、结构、功能及表达机制提供了重要的理论依据。     

基因编辑技术对大肠杆菌yjjW基因点突变的两步法策略

[目的]为了实现对大肠杆菌靶基因的点突变,本研究将同源重组系统与CRISPR-Cas9技术相结合,探索一种高效、简捷的两步法策略.[方法]将靶基因的上下游同源臂和标记基因(amp)与pKOV质粒连接,获得pKOV-HR重组质粒.将pKOV-HR转化至大肠杆菌,借助其自身RecA重组系统,介导DNA发生同源重组,获得靶基...     

致犊牛脑膜炎大肠杆菌新疆分离株ibeB基因的特性分析北大核心CSCD

【目的】分析致犊牛脑膜炎大肠杆菌分离株ibeB基因的分子生物学信息。【方法】以自脑炎死亡犊牛脑组织、肝组织分离鉴定的O161-K99-STa致病性大肠杆菌牛-EN株和牛-EG分离株为材料。根据GenBank中公布的脑膜炎大肠杆菌K1株RS218 ibeB基因序列设计1对引物,采用PCR方法,从分离株中成功克隆ibe B基因,比较分离株ibeB基因与不同来源大肠杆菌ibeB基因的部分生物信息学特性。【结果】分离株ibeB基因序列全长1500 bp,包含1371 bp开放阅读框,共编码457个氨基酸;生物信息学分析显示,牛-EN株与致人脑膜炎大肠杆菌K1 RS218的核苷酸和氨基酸同源性分别为90.5%和96.9%,牛-EG株与大肠杆菌K12的核苷酸和氨基酸同源性分别为99.4%和100.0%;ibeB蛋白为亲水性蛋白,分子质量为50.26 kDa,理论等电点为6.05;该蛋白无跨膜区,但具有信号肽序列;亚细胞定位显示,分泌信号通路位点(SP)占比例为0.939,说明该蛋白属于分泌型蛋白。【结论】从致脑膜炎大肠杆菌分离株中成功克隆ibeB基因,该基因与致人脑膜炎大肠杆菌K1 RS218 ibeB基因有较高的同源性,均有相似的生物学特性,属肠外致病性大肠杆菌。     

基于膜压力应答途径的大肠杆菌丁醇耐受性

【目的】筛选丁醇压力下Escherichia coli中参与溶剂压力应答的细胞信号传导途径,并从应答途径出发,提高E.coli丁醇耐受性。【方法】在丁醇压力下,利用RT-PCR分析大肠杆菌内膜压力应答途径中反应调节因子(response regulator,RR)的表达水平,通过Red同源重组以及一步克隆的方法分别构建外膜脂蛋白Nlp E和分子伴侣蛋白Spy的敲除菌株E.coli JM109(Δnlp E)和E.coli JM109(Δspy)及重组菌株E.coli JM109/p QE80L-nlp E和E.coli JM109/p QE80L-spy,并测定其溶剂耐受性和细胞膜疏水性。【结果】0.8%(V/V)丁醇处理10 h后,Cpx和Bae双组分压力应答途径中的cpx R和bae R基因的表达水平分别提高了8.3和3.3倍;分别在含0.6%(V/V)四氢呋喃、0.1%(V/V)甲苯和0.6%(V/V)环己烷的培养基中培养10 h后,重组菌株E.coli JM109/p QE80L-spy和E.coli JM109/p QE80L-nlp E的OD600相比对照组(OD600增长0.02-0.04)分别增长了0.13-0.17和0.05-0.13,重组菌的溶剂耐受性得到了显著提高。【结论】Cpx和Bae系统参与大肠杆菌丁醇压力应答,分子伴侣蛋白Spy的过表达能够有效提高大肠杆菌对有机溶剂的耐受性,本研究为阐明微生物有机溶剂耐受性机制提供了理论依据。     

和厚朴酚对大肠埃希氏菌生物被膜形成的抑制机制

【目的】研究不同浓度的和厚朴酚(honokiol)抑制大肠埃希菌(Escherichia coli)的供试菌株10389生物被膜(biofilm,BF)形成的作用机制。【方法】用氯化三苯基四氮唑比色法(TTC)和四唑盐减低法(XTT)测定honokiol抑制E.coli10389生物被膜形成的药物最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)及其抑制作用与时间的关系;通过qRT-PCR法检测不同浓度的honokiol对E. coli 10389生物被膜形成基因和群体感应系统相关基因表达量的影响;通过生物发光法和qRT-PCR法检测亚-MIC honokiol对E. coli 10389呋喃糖基硼酸二酯(AI-2)及其调控的与生物被膜形成相关的下游基因表达量的影响。【结果】Honokiol能抑制E.coli10389生物被膜的形成,但不同浓度的honokiol抑制E. coli 10389 BF形成的作用机制不同。其中,与对照组相比,MIC的honokiol能使E. coli 10389 BF形成相关基因编码毒素(hha)和细菌酸性调节因子(ari R) mRNA的表达量显著提高,抗毒素...     

在大肠杆菌中拓展合成途径合成异胡椒醇北大核心

天然异胡椒醇作为一种植物来源香料,具有很高的经济价值。目前国内外还未见利用大肠杆菌工程菌株转化生产异胡椒醇的报道。【目的】构建工程菌,采用生物合成方法获得天然香料异胡椒醇。【方法】对来自胡椒薄荷的细胞色素P450家族的柠檬烯-3-羟化酶(LIM3H)基因PM2进行改造,截短LIM3H的N端疏水区,分别添加17α短肽或2B1短肽增加其亲水性,采用CO差示光谱法检测LIM3H活性;将N端疏水区截短后的来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的NADPH-细胞色素P450还原酶基因(trATR)和修饰后LIM3H基因(Modi-LIM3H)融合后表达,最终以柠檬烯为底物进行全细胞转化。【结果】3种N端修饰LIM3H基因均检测到LIM3H表达和异胡椒醇生成,其中17α短肽修饰后的蛋白表达量最高,异胡椒醇产量达到1.94 mg/L。【结论】本研究在大肠杆菌中增加外源LIM3H与ATR,成功催化柠檬烯生成异胡椒醇,为天然异胡椒醇的生产提供了新的方法。     

腺苷酸激酶基因在大肠杆菌中的可溶性高表达

报道了鸡肌腺苷酸激酶基因的克隆和在温控启动子P_RP_L调控下在大肠杆菌中的可溶性高效表达.SDS-PAGE分析表明,鸡肌腺苷酸激酶的含量可占大肠杆菌细胞总蛋白含量的38％.利用Johnson等的干冰/乙醇-冰水浴反复冻融法,可将此重组蛋白进行富集,纯度可达85％以上.鸡肌腺苷酸激酶可与抗兔肌腺苷酸激酶单克隆抗体产生强的交叉反应.     

大肠杆菌机械敏感性离子通道MscS失活特性分析

[目的]细菌机械敏感性离子通道MscS能够在细菌周围环境渗透压急剧降低时,打开并释放胞内内容物,平衡内外渗透压差,使细菌存活。鉴于其广泛分布在各种细菌中,而在哺乳动物中未发现其同源体,MscS被认为是一种新型抗生素靶点。MscS一个独特的开放特征是具有失活特性,即在持续的机械刺激条件下,MscS从开放状态进入一种非离子通透的失活状态,从而避免因通道持续开放引起大量内容物流失导致细菌死亡。该研究的目的是鉴定影响MscS失活的关键氨基酸,为靶向MscS的药物设计提供思路。[方法]采用分子克隆方法制备MscS Cyto-helix(P166−I170)半胱氨酸突变体,利用巯基化合物MTSET⁺结合半胱氨酸从而对其侧链基团进行修饰,并通过低渗刺激实验,检测表达MscS半胱氨酸突变体的大肠杆菌分别在无或有MTSET⁺处理下,低渗刺激诱发通道开放后的存活率筛选显著影响通道功能的突变体。利用电生理膜片钳方法检测突变体在MTSET⁺处理前后通道失活特性的变化,结合定点突变手段进一步探讨失活机制。[结果]MTSET⁺处理导致表达半胱氨酸突变体G168C-MscS的大肠杆菌在低渗刺激后存活率极大降低;G168C- MscS在结合MTSET⁺后失去失活特性,保持持续开放,是导致细菌胞内内容物大量流失并死亡的重要原因;酪氨酸突变G168Y-MscS、亮氨酸突变G168L-MscS和赖氨酸突变G168K-MscS的失活特性与野生型WT-MscS一致,而天冬氨酸突变G168D、缬氨酸突变G168V和异亮氨酸突变G168I的失活速率显著降低,尤其是G168I-MscS失去失活特性,表明MscS 168位点是影响通道失活的关键位点,并且通道失活特性与该位点氨基酸侧链基团的大小及电荷性质相关。[结论]G168位点甘氨酸是影响MscS通道失活的关键氨基酸。     

大肠杆菌中转录-翻译耦合的机制

在大肠杆菌（Escherichia coli,E. coli）等原核生物中,转录和翻译往往是耦合的,这种耦合通常表现在转录和翻译的互相调控上,如转录极性、转录衰减和转录-翻译速率的同步。间接耦合和物理耦合是耦合的两种模式。由警报素（alarmone）(p)ppGpp维持的间接耦合可能需要DksA和TufA蛋白的辅助。物理耦合分为NusG或RfaH因子介导的耦合和非因子条件下产生的“碰撞”耦合。响应于压力的转录或翻译的变化会引发几种耦合模式间的相互转变。耦合对于基因正常表达是必要的,其解除将引发转录终止、R环形成、复制-转录冲突、mRNA切割等不利的事件。结构生物学的相关技术已经清晰地展示了部分耦合的表达体（expressome）的结构细节和特征,这些技术联合多组学分析等方法将提供关于耦合的更深层次的见解。重要的是,对耦合的研究或许会为靶向抗菌药物的开发带来新的思路。     

Intramolecular homologous recombination of linearized plasmids in Escherichia coli K12

Summary The efficacy of linear DNA as a substrate for general homologous recombination was demonstrated using BamHI-linearized pKLC8.5, a plasmid that carries internal direct repeats flanking the unique BamHI site. An analogous plasmid, pKLC2.31, was used in a parallel and comparative study of intramolecular homologous recombination in circular DNA substrates. When the rec ⁺ wild-type strain, AB1157, and its isogenic rec ^– derivatives were transformed with linear pKLC8.5 DNA, intramolecular homologous recombination was independent of recA, recB, recN, recO and exonuclease III (xth-1) functions. Although the recBCsbcA and recBCsbcBC cells were both very recombination proficient, only linear but not circular DNA was used as substrate for intramolecular homologous recombination in the recBCsbcA cells. In both the recBCsbcA and recBCsbcBC genetic backgrounds, the recombination frequencies for linearized pKLC8.5 DNA were 100%. A notable difference between the two strains was that none of the recBCsbcA transformants obtained with circular pKLC8.5 DNA were Tc^s recombinants, whereas 11% of the corresponding recBCsbcBC transformants were Tc^s recombinants. The sbcB mutation was responsible for the recombination proficiency of the recBCsbcBC cells. Unlike the case in recBCsbcA cells, intramolecular homologous recombination of linear DNA in the recBCsbcBC cells was dependent on recA and recF as well as recN and recO gene functions, but was independent of recJ and reeL gene functions.     

Recombinant streptokinase production by fed-batch cultivation of Escherichia coli

Streptokinase (SK) is a specific effective medicine for thrombolytic therapy of acute myocardial infarction. This study established a process for the pilot production of recombinant streptokinase (r-SK). Engineering bacteria were fermented in a 20-l fermentor to produce r-SK. After simple renaturation and purification, 12.9 g of r-SK with 97.8% of purity and about 10⁵ IU mg⁻¹ of specific activity was obtained, the yield of protein and the recovery of activity were 44.9% and 51%, respectively. Finally, the r-SK was made into about 700 doses of injections for clinical applications.