苹果根际自毒物质降解菌的筛选鉴定及降解特性研究

【目的】从苹果根际土壤筛选苹果根系自毒物质降解细菌,并探究分离菌株对根皮苷、邻苯二甲酸、对羟基苯甲酸以及焦性没食子酸的降解能力。【方法】分别采用邻苯二甲酸、焦性没食子酸为唯一碳源富集并筛选其降解菌株。通过对分离菌株的生理生化特征测定及16S r RNA基因序列分析,采用MEGA 5构建系统发育树,进行菌株鉴定。采用紫外分光光度法和高效液相色谱法测定分离菌株对4种自毒物质的降解能力。【结果】共分离5株有降解能力的细菌,编号为BL1、BL2、BL3、BJ1和BJ2,经鉴定BL1为钩虫贪铜菌Cupriavidus necator,BL2为生脂固氮螺菌Azospirillum lipoferum,BL3为氧化烃微杆菌Microbacterium hydrocarbonoxydans,BJ1为Paenibacillus phyllosphaerae,BJ2为Ochrobactrum cytisi。BL1、BL2、BL3菌株对邻苯二甲酸、对羟基苯甲酸、根皮苷、焦性没食子酸的降解率均高于50%。其中BL2菌株的降解效果最好,分别达到66%、72%、84%和84%。【结论】首次发现钩虫贪铜菌、生脂固氮螺菌和氧化烃微杆菌对4种自毒物质均具有很好的降解能力,对缓解自毒物质引起的连作障碍具有潜在的应用价值。     

病死猪尸体降解复合菌的筛选、鉴定、优化及应用效果评价

[背景]我国生猪病死率较高,建立高效的病死猪尸体无害化处理方式尤为重要.[目的]提高病死猪尸体堆肥无害化处理效率.[方法]筛选具有蛋白质和脂肪降解功能的菌株,并构建复合菌剂,利用单因素和响应面方法对其菌种配比及降解条件进行优化,对其接种于病死猪和锯末堆肥进行应用效果评价.[结果]经鉴定,菌株DB1为粘质沙雷氏菌,所产蛋...     

耐高温沼渣降解菌的筛选及复合菌剂降解效果研究

分离筛选耐高温纤维素降解细菌，构建可快速降解沼渣的复合菌剂，缩短堆肥腐熟时间。采用高温富集筛选法，从宁夏中卫市秸秆堆和畜禽粪便中分离筛选耐高温细菌，经羧甲基纤维素钠水解试验和滤纸条崩解试验复筛获得具有纤维素降解能力的菌株。通过纤维素酶和木质素酶活性比较，确定目标菌株并进行分类鉴定。开展拮抗性试验和菌种复配，构建复合型菌剂；经沼渣堆肥场地试验验证复合菌剂的促腐熟效果。本研究筛选获得2株耐高温纤维降解细菌——蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)W44菌株和解蛋白芽胞杆菌(Bacillus proteolyticus)X51菌株，纤维素酶活性分别为34 812.69 U/L和34 159.10 U/L。比较菌株W44/X51配比分别为1:1、1:2和2:1的复合菌剂对沼渣堆肥的促腐熟效果，添加不同的复合菌剂均缩短了沼渣堆肥腐熟时间，其中1:2处理腐熟时间最短，较CK提前18 d。蜡样芽胞杆菌W44和解蛋白芽胞杆菌X51按1:2配比的复合菌剂可用于沼渣快速堆肥发酵。     

烟草幼苗根系分泌自毒物质种类及PAEs对根系抗氧化性能的影响

采用GC-MS技术鉴定水培烟草Burley及K326在幼苗期不同生长阶段的根系分泌物;并用不同浓度邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二异辛酯(DIOP)溶液浇灌盆栽烟草幼苗,研究其根系抗氧化性能变化。结果如下:(1)Burley根系分泌物主要有3类化合物,其中自毒物质邻苯二甲酸酯(PAEs)在二叶龄期、四叶龄期、六叶龄期的相对含量分别为7.6%、0.3%、未检出;而K326根系分泌物主要有9类化合物,PAEs在二叶龄期、四叶龄期、六叶龄期的相对含量分别为35.6%、51.3%、2.2%。(2)浓度高于0.1 mmol/L的PAEs使根中超氧阴离子自由基产生的速率显著(P0.05)增加;随着DIOP及DBP浓度的增加,超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性增加,在0.5 mmol/L时达到最大,然后随着处理浓度的增加而下降。丙二醛的浓度随着这两种PAEs处理浓度的增加而增大。结果表明:烟草根系分泌的自毒物质PAEs达到0.5 mmol/L时,能降低根系的抗氧化性能,造成根尖细胞膜系统的氧化损伤,引起根吸收功能等一系列生理生化变化,并最终表现出自毒作用。     

三七自毒与化感作用初步研究

采用生物测定方法,对三七的自毒与化感作用进行初步研究。结果表明:(1)三七种子萌发过程中的自毒作用随其播种密度不同而有一定差异,但无明显规律性。三七种子萌发过程中的分泌物对油菜生长具有化感作用,主要表现为对油菜种子发芽率、发芽指数及苗高的抑制效应;(2)三七水浸液对不同受体植物的化感作用不尽相同,对小麦主要表现为对苗鲜重、苗干重、根鲜重、苗高及须根数有不同程度的促进或抑制作用;对油菜则表现为对其种子发芽率具有抑制作用,而对苗鲜重、苗干重、根鲜重、最长根长具有促进作用;(3)三七存在明显的化感自毒作用,其自毒物质可能为影响其连作的一个重要因素。     

三七皂苷类自毒物质降解细菌分离及其降解特性

三七是我国的名贵药材,但由于连作障碍发生严重,因此土壤中自毒物质的积累成为导致三七连作障碍发生的主要原因之一。生物降解土壤中的自毒物质是缓解连作障碍的有效措施,为筛选并利用降解菌使土壤中皂苷类自毒物质快速消减,该研究以皂苷类自毒物质为筛选靶标,采用富集和驯化策略,从连作三七根际土壤中分离、筛选三七皂苷类自毒物质降解细菌,结合16S rRNA基因测序对高活性菌株进行分类鉴定,并对筛选得到的高活性菌株SC3的降解特性进行了研究。结果表明:(1)从三七根际土壤中成功分离出8株潜在自毒物质降解细菌,初筛评价结果显示SC3菌株对三七总皂苷的降解率最高,达87.42%。(2)通过16S rRNA基因序列分析,编号SC3的高活性菌株被鉴定为寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)细菌。(3)在相同培养条件下,菌株SC3对单体皂苷Rb₁的降解效果强于对Rg₁的降解。(4)在液体培养条件下,底物浓度、接种量和培养温度均会显著影响SC3菌株对单体皂苷Rb₁的降解效果。综上表明,采用富集和驯化策略可以有效筛选自毒物质降解细菌,SC3菌株具有消除连作土壤中皂苷类自毒物质的潜力。该研究结果为连作土壤修复提供了生物资源,并为今后深入研究皂苷降解机制提供了理论依据。     

低温秸秆降解复合微生物菌剂的研究进展

我国东北地区冬季寒冷,秸秆产量巨大,但综合利用率较低,利用高酶活性微生物将低温环境中的秸秆降解变废为宝,是一项循环利用的有效途径。研究表明,通过生物学技术手段,筛选高酶活性菌株,深入研究降解机理,优化功能微生物培养条件,提高纤维素酶活性,是提高降解率,秸秆资源化利用的最佳途径。复合微生物菌剂产生的酶活值普遍高于单一微生物菌,真菌菌丝体产生的酶活值高于细菌。实际应用中,选择适合的复合菌剂是低温环境下提高秸秆降解效率的有效途径。系统地归纳了低温条件下降解秸秆的微生物技术、分析了不同条件下降解秸秆的菌株类型和促进秸秆纤维素降解菌酶活力特征、并总结了低温环境下生物菌剂降解秸秆的技术应用效果,旨为低温环境下秸秆的资源化利用提供一定的技术参考。     

花生植株和土壤水浸液自毒作用研究及土壤中自毒物质检测

通过盆栽试验及生物测试研究花生植株、土壤水浸液对其种子萌发和幼苗生长的自毒作用,利用单因子方差分析结合多重比较分析各处理组生物活性差异;采用液相色谱法(HPLC)对正茬、连作2、4 a和6 a的花生根际土壤中酚酸类物质进行定性和定量分析。结果表明:花生植株不同部位及根际土壤水浸液对花生种子萌发和幼苗生长均具有不同程度的抑制作用,且抑制作用具有浓度梯度效应,浓度越高抑制作用越强,16 g/10 mL水浸液的抑制作用最大。花生生长受自毒物质的影响,此影响作用强度因自毒物质的来源部位不同而存在差异。种子萌发以茎水浸液的自毒作用最为明显。但针对幼苗生长的不同测定指标其部位差异不一致,其中以茎水浸液对幼苗株高和叶面积的自毒作用最为明显,根际土壤水浸液对幼苗主根长、单株鲜重和单株干重的自毒作用最为明显。在根际土壤水浸液中鉴定到4种酚酸物质,分别为对羟基苯甲酸、香草酸、香豆酸和香豆素,其中香草酸和香豆素含量较高且变化规律性明显,在土壤中的含量随连作年限的增加而上升,连作6 a后土壤中的含量达到0.289μg/g和0.025μg/g干土。     

茄子自毒物质对辣椒种子萌发及枯萎菌的化感效应

运用模拟的方式,采用生物测定和室内培养的方法,研究了两种茄子自毒物质香草醛和肉桂酸各浓度对辣椒种子萌发和幼苗生长的化感效应,及其对辣椒枯萎菌菌丝生长的影响.结果表明:这两种自毒物质对辣椒种子萌发和幼苗生长具有低浓度促进,高浓度抑制的化感效应.香草醛和肉桂酸对辣椒和茄子种子的化感效应存在较大差异,辣椒种子受这两种自毒物质的抑制强度明显弱于茄子种子.香草醛和肉桂酸对辣椒枯萎菌菌丝生长表现为各浓度(0.1, 0.5, 1, 4mmol/L)下均具有抑制作用,作用强度随着浓度增加而增强,肉桂酸低浓度时对菌丝生长的抑制作用即达到显著水平.     

三七(Panax notoginseng)根残体化感自毒效应研究

为研究三七(Panax notoginseng(Burk)F.H.Chen)采收过程中残留须根的化感自毒效应,采用土培和水培2种方法,按不同比例添加三七须根粉碎物,检测根残体作用下土培三七土壤中皂苷的动态变化及水培三七根部形态结构变化。结果显示,土培条件下,随着须根粉碎物处理时间的延长,土壤中皂苷成分种类增加、总皂苷含量减少。水培条件下,随着处理时间的延长,添加须根粉碎物处理后的三七根尖细胞壁增厚,细胞中出现菌丝体;随着处理时间及处理浓度的增加,细胞开始皱缩甚至破碎,细胞中无完整细胞器结构,三七根部细胞结构差异明显。研究表明三七采收过程中残留在土壤中的须根腐解释放的化学物质可能是导致三七自毒效应的因素之一。     

石油降解菌剂的研制及其在石油污染土壤修复中的应用

用液态和固态相结合的方式对包含2种细菌的石油降解菌剂进行培养,牛肉膏、蛋白胨作为液态培养基培齐初级种子,然后接种到草炭和麸皮的固态培养基中培养：分析温度、接种量、料水比、草炭与麸皮的比例、培养时间对固态培养的影响.制备的BC—E和BC-12种菌剂的活菌量分别达到2．47×10^11个／g和3．6×10^10个／g。采用研制的菌剂对石油污染土壤进行修复实验,1个月污染土壤中的石油降解率可达到45％。     

烟草青枯病拮抗内生细菌的分离、鉴定及其田间防效

从病区健康烟草植株茎杆内分离到一株对烟草青枯罗尔氏菌(Ralstonia solanacarum)有强拮抗作用的内生细菌,命名为B-001菌株.拮抗性研究表明,B-001菌株对多种革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌以及病原真菌均有较强的抑制作用.形态和生理生化特征初步表明菌株B-001为芽孢杆菌属(Bacillus)细菌.经扩增、测序得到B-001的16S rDNA序列,GenBank接收号为DQ444283.用ClustalX进行多重序列对比,并通过MEGA3方法构建16S rDNA系统发育树,表明:菌株B-001与Bacillus subtilis (DQ415893)的相似性为99.2%,并处于同一分支;结合形态和生理生化指标,将其鉴定为枯草芽孢杆菌(B. subtilis).2005和2006年在湖南省桂阳县、宁乡县进行了田间试验,防效在40.03%～78.14%,防治效果良好,且明显优于农用链霉素.     

云南省烟植地青枯菌RS-22的分离及其拮抗菌的筛选和鉴定

【背景】由青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的烟草青枯病是一种重要土传病害,在我国南方烟区普遍发生。生物防控是针对烟草青枯病的一种有效防治措施,但是相关的研究报道还较少。【目的】分离云南省烟植地的青枯病原菌,筛选其拮抗菌并对其抑菌效果进行鉴定。【方法】采用平板稀释法从云南感病烟草中分离获得青枯菌,采用平板对峙法筛选青枯菌拮抗菌,筛选得到的拮抗菌通过16SrRNA基因测序比对确定菌种类型,并在实验室和大田鉴定其对青枯病的防治效果。【结果】从感病烟草茎中分离出一株强致病性青枯菌小种RS-22,该菌能侵染烟草和番茄并最终使植物死亡;筛选出12株RS-22拮抗菌,其中拮抗作用最强的是Y4;Y4被鉴定为一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),其菌体和分泌物都能抑制RS-22生长;Y4根部灌根处理能显著提高烟草和番茄对青枯菌RS-22的抗性,Y4处理能使感病烟草部分恢复正常,在云南文山州烟草种植大田施加Y4菌剂和菌剂有机肥混合物也能显著降低烟草青枯病的感病率。【结论】青枯菌RS-22具有广谱的致病性,筛选的拮抗菌Y4能显著抑制青枯菌生长,而且对青枯菌侵染植物有很好的防治效果。研究结果为进一步研究烟草青枯病的生物防控提供了新的理论依据。     

烟草青枯病危害对烟田中小型土壤动物群落的影响

为了掌握重庆植烟区烟草青枯病危害对烟田中小型土壤动物群落结构及多样性特征的影响,分别于2015年3月烟田休耕期、6月烟株旺长期和9月烟叶成熟期在重庆市彭水县进行了定点实验,调查了烟草青枯病连续成灾烟田及其对照无青枯病危害烟田中的中小型土壤动物群落。共捕获中小型土壤动物50112只,隶属于33个类群。其中,线虫、螨类和弹尾虫构成了烟田中小型土壤动物的主体,对烟田土壤动物群落特征起决定性作用。不同季节青枯病田及其对照田土壤动物整体数量表现为3月6月9月。两类烟田不同季节的土壤动物及其主要类群相对多度和密度,以及群落Margalef丰富度指数、Shannon-Wiener多样性指数、Pielou均匀度指数和Simpson优势集中性指数均表现出了明显的动态变化,且出现了显著性差异(P0.05)。群落相似性分析显示,两类烟田土壤动物群落组成相似度高,但烟草青枯病危害加剧会使相似度降低。群落稳定性结果表明,6月和9月对照田稳定性均要明显大于青枯病田。螨类与弹尾虫个体数的A/C比值均为对照田大于青枯病田,且3月和6月差异显著(P0.05)。主成分分析(PCA)表明,青枯病危害对土壤动物个体数、土壤动物密度、中气门亚目、甲螨亚目、线虫、啮虫目和棘跳虫科以及螨类与弹尾虫个体数的A/C比值影响较大;而这些对青枯病危害反应敏感的土壤动物指标,可作为青枯病发生和危害程度评价的特征指标;另外,基于PCA得分的土壤样品采集点排序结果进一步指出,两类烟田土壤动物群落组成的异质性随着青枯病危害程度的加剧而加大。上述结果说明土壤动物群落组成和多样性特征与青枯病的发生和危害密切相关;在农业生产上要开展可持续和有效的烟草青枯病生物防治,应不断加强该病原菌与土壤中小型动物生态关系的基础研究。     

Epifluorescence microscope methods for bacterial enumeration in a 4-chlorophenol degrading consortium

Epifluorescence microscope methods, namely BacLight, direct epifluorescence filter technique and Rhodamine 123, consistently underestimated plate bacterial counts in a 4-chlorophenol degrading consortium. Cells capable of passing through 0.2 microm filters, referred as 'ultramicrocells', were found. Although cell counts were higher when traditional methods were used, BacLight and direct epifluorescence filter technique were convenient techniques for the systematic monitoring of bacteria involved in biodegradation processes, as results were consistent and available within a short time.     

健康与感染青枯病烟株根际土壤与茎秆细菌群落结构与多样性

【目的】了解健康烟株与感染青枯病烟株在根际土壤、茎杆发病部位、茎杆病健交界部位以及未发病茎杆的细菌群落结构与多样性。【方法】分别对土壤与茎杆样品中细菌的16S rRNA基因V3-V4区进行扩增,采用Illumina MiSeq测序技术对扩增片段进行高通量测序,然后对健康烟株与感染青枯病烟株不同部位细菌群落结构与多样性进行分析。【结果】感染青枯病烟株发病茎杆及根际土壤的细菌群落多样性高于健康烟株茎杆及其根际土壤样品,病健交界茎杆样品细菌群落多样性低于健康烟株。变形菌门(Proteobacteria)在所有样品中均为优势菌门;所有烟株根际土壤的优势菌门为拟杆菌门(Bacteroidetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和绿弯菌门(Chloroflexi);健康烟株茎杆部位的优势菌门为蓝细菌门(Cyanobacteria);感染青枯病烟株发病茎杆和病健交界茎杆部位的优势菌门为蓝细菌门(Cyanobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)。所有根际土壤样品的优势菌属为劳尔氏菌属(Ralstonia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、黄杆菌属(Flavobacterium)和代尔夫特菌属(Delftia),而感染青枯病烟株根际土壤的劳尔氏菌属(Ralstonia)和假单胞菌属(Pseudomonas)相对丰度显著高于健康烟株根际土壤,鞘脂单胞菌属相对丰度显著低于健康烟株根际土壤。烟株茎杆的优势菌属为劳尔氏菌属和假单胞菌属等。感染青枯病烟株病健交界茎杆中劳尔氏菌属、肠杆菌属(Enterobacter)和泛菌属(Pantoea)相对丰度显著低于健康烟株样品。【结论】健康与感染青枯病烟株茎杆样品细菌群落的丰富度和多样性明显低于相应的根际土壤样品。较健康烟株而言,感染青枯病烟株根际土壤和茎杆样品细菌群落丰富度和多样性均表现出不同程度地增加,且根际土壤细菌群落结构变化较茎杆样品明显,而病健交界茎杆样品细菌群落丰富度和多样性降低。烟草青枯病为典型土传病害,其病原茄科劳尔氏菌尽管能在烟株维管束中蔓延扩增,但主要还是分布于土壤中;它的存在似乎对土壤细菌群落的影响大于茎杆样品的。该研究结果提示对于青枯病的防治不能局限于烟株本身,田间土壤也应加大防治力度。     

降解菌HN36对二氯喹啉酸胁迫下烟草茎尖和叶片超微结构的影响

利用降解菌HN36降解土壤中的二氯喹啉酸及修复土壤的生态环境, 为稻田植烟地区烟叶安全生产提供技术和理论依据。采用盆栽试验, 将二氯喹啉酸与降解菌HN36配成一定量的溶液, 均匀喷洒到过筛的干土中, 将5叶期烟苗移栽到处理的塑料盆土中。当烟苗长到8叶期时分别取茎尖﹑顶叶和中部叶进行处理, 在电镜下观察细胞超微结构变化, 利用高效液相色谱仪检测土壤中二氯喹啉酸降解的动态。烟株细胞超微结构变化的程度有差异, 表现为受害烟株>修复烟株>健康烟株; 烟株的茎尖和顶叶细胞伤害最严重, 中部叶片细胞伤害较轻。研究结果还显示, 在含二氯喹啉酸的土壤中, 加入降解菌HN36能加速二氯喹啉酸降解, 改善土壤健康质量, 烟株细胞超微结构及烟叶品质明显得到修复。     

纤维素降解菌的筛选与复合菌系的初步构建

目的 针对大庆地区土地盐碱化较严重,盐碱面积较大等现状,从大庆特征性盐碱地区土壤样品中分离出能够降解纤维素的菌株,为降解植物废料以及缓解土壤盐碱化改善土壤环境提供功能菌株。方法 通过刚果红染色法初步筛得到具有纤维素降解能力菌株,进一步用比色法测定其纤维素降解率,同时测定菌株耐盐、耐碱、产酸性能,选择性能优良的3株菌作为纤维素降解菌复合菌系构建菌株,通过耐盐性、耐碱性和纤维素降解率实验测定复合菌系菌株最佳组合,进一步通过上述实验确定复合菌系菌株最佳混合比例。结果 得到由DX-5和DX-9按照2∶3进行组合复合菌系纤维素降解率最高,达到87.96%,且具有较高的耐盐以及耐碱能力。结论 通过实验得到纤维素降解菌的复合菌系,具有较高纤维素降解率以及改善土壤盐碱性能力。     

响应面法优化青枯病生防菌Hrp~-菌株的发酵条件

对工程菌Hrp-菌株的摇瓶发酵条件进行优化。首先采用Plackett-Burman设计法对影响Hrp-菌株活菌量的6个因素进行评价,筛选出具有显著效应的2个因素(发酵温度和摇床转速),再用最陡爬坡试验法接近重要因子的最优水平,最后应用中心组合设计确定重要因子的最优水平。确定优化后的发酵条件:初始pH 8.75、装液量为100 mL(500 mL三角瓶)、接种量6.25%、接种龄10 h、温度20℃、摇瓶转速205 r/min。实验结果表明:采用优化后的发酵条件,Hrp-菌株的发酵液菌量由最初的3.30×1010个/mL提高至4.42×1010个/mL,增幅为133.9%。