黄瓜花叶病毒坏死型卫星RNA的cDNA克隆和全序列分析

从田间发生坏死病害的番茄病株中分离得到黄瓜花叶病毒TN分离物,经研究证实TN分离物带有1株坏死型卫星RNA(TN-SatRNA).利用已知CMV卫星RNA的两端序列作引物扩增并克隆了TN-SatRNA的cDNA.序列分析显示TN-SatRNA全长为390个核苷酸.比较TN-SatRNA与富有代表性的CMV卫星RNA的结构表明,这几种卫星RNA中具有4个结构同源区(Ⅰ:1～81nt,Ⅱ:216～261nt,Ⅲ:278～338nt;Ⅳ:349～390nt),而在82～215nt的区域几种卫星RNA的结构变化较大.在TN-SatRNA的3’端具有已报道的坏死型卫星RNA特征性序列结构.经3’RACE方法确定TN-SatRNA的3’端自然序列,与PCR扩增引物有1个核苷酸的差别.     

黄瓜花叶病毒卫星RNA人工突变体的构建及其侵染性测定

从1个369nt的黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)卫星RNA的cDNA出发,采用DNA改组技术构建人工突变体,经过体外转录,将其与不携带卫星RNA的黄瓜花叶病毒株进行假重组,鉴定突变体的生物活性,结果显示所获得的4个卫星RNA的点突变子MS1、MS5、MS6和MS11中,只有MS11仍然具有复制能力;而其他3个点突变子,尽管均只有1个位点的替换,却不能在辅助病毒作用下复制。序列比较分析发现MS11的突变位点位于卫星RNA变异区内,发生的突变与自发突变一致,其他3个突变子的突变位点发生在卫星RNA的高度保守区。而且通过侵染性试验证实突变子MS11与野生型Yi没有明显的差异。由此可推测卫星RNA序列中的高度保守区与卫星RNA的生物活性密切相关,个别碱基的突变会导致RNA二级结构的改变,进而引起其复制能力或稳定性的完全丧失。     

黄瓜花叶病毒山东株（CMV—SD）RNA2全和cDNA克隆的构建及全序列分析

分别利用５’ＲＡＣＥ和３’ＲＡＣＥ确定了ＣＭＶ－ＳＤＲＮＡ２的５’和３’未端序列,在此基础上,利用ＲＴ－ＰＣＲ得到了ＲＮＡ２的５’端一半的ｃＤＮＡＤＱ ＢＴＧ Ｐｃ２５和３’端一半的ｃＤＮＡ克隆ＰＣ２３,并通过拼接构建了ＲＮＡ２全长ｃＤＮＡ克隆ＰＣ２Ｆ。     

系统侵染寄主中黄瓜花叶病毒及其卫星RNA的动态变化

以³²P标记的黄瓜花叶病毒（CMV）RNA3 cDNA片段和卫星RNA全长cDNA作为探针,定量测定CMV基因组RNA和卫星RNA的含量变化,结果显示：二者均具有明显的寄主效应和时间效应.在16～20℃条件下,接种不携带卫星RNA的分离物CMV-R3,15天、30天和75天时,CMV基因组RNA负荷量呈显著下降的趋势.在第15天,RNA3的负荷量以烟草>心叶烟>克里夫兰烟>番茄的顺序表现为不同寄主的显著性差异.相同条件下接种携带高拷贝卫星RNA的分离物CMV-RS,在5天和15天之间基因组RNA和卫星RNA负荷量均呈现上升的趋势,同时测得其基因组RNA和卫星的负荷量具有相似的寄主效应和时间效应,但程度不同.第15天时,二者负荷量以烟草＞心叶烟＞番茄的顺序表现寄主效应的显著性差异.在18～21℃条件下,接种携带坏死卫星RNA的CMV强毒株HC4,第5天、第10天和第15天时,基因组RNA和卫星RNA的负荷量均以番茄＞心叶烟＞烟草的顺序表现出显著性差异,并表现出明显的时间效应.不同来源CMV分离物还存在寄主选择性差异.     

一种病毒侵染性全长cDNA克隆的快速构建方法

利用ＲＴ－ＰＣＲ技术获得了含烟草花叶病毒蚕豆分离物（ＴＭＶ－Ｂ）的他长基因组ｃＤＮＡ,并克隆ｐＴ７Ｂｌｕｅ载体中。以获得的全长ｃＤＮＡ及其ＰＣＲ产物为模板分别进行体外转录,接种试验发现转录产物均具有侵染活性。比较两种方法发现以ＰＣＲ产物为模板的体外转录物的侵染效率更高。     

黄瓜花叶病毒香蕉株系（CMV—Xb）RNA3cDNA的克隆和序列分析

通过PR－PCR方法,设计两对引物,克隆了黄瓜花叶病毒香蕉株系（CMV-Xb)RNA3,并进行了核苷酸和蛋白质水平上的分析,结果表明Xb株系RNA3全长2205nt,具有两个蛋白编码阅读框型架（ORF）,其中5'端（97－936nt)编码一个279aa的3a蛋白;3'端（1225－1871nt)编码一个2188aa的CP蛋白。5'非编码域为96nt;其因间隔区（IR）长288nt;3'NR含有324nt。通过与亚组Ⅱ其它株系RNA3核苷酸和所编码产物推导的氨基酸序列分析发现,亚组Ⅱ株系无论在编码区还是非编码区的核苷酸同源性都相对较高;亚组Ⅱ株系在进化过程中具有连续性。     

黄瓜花叶病毒山东株(CMV-SD)RNA2全长cDNA克隆的构建及全序列分析

分别利用５’ＲＡＣＥ和３’ＲＡＣＥ确定了ＣＭＶＳＤＲＮＡ２的５’和３’末端序列,在此基础上,利用ＲＴＰＣＲ得到了ＲＮＡ２的５’端一半的ｃＤＮＡ克隆ｐＣ２５和３’端一半的ｃＤＮＡ克隆ｐＣ２３,并通过拼接构建了ＲＮＡ２全长ｃＤＮＡ克隆ｐＣ２Ｆ。通过对ｐＣ２５和ｐＣ２３进行序列测定,得到了ＲＮＡ２的全序列。序列分析结果表明ＣＭＶＳＤＲＮＡ２由３０４８ｎｔ组成,其中存在２个部分重叠的阅读框ＯＲＦ１（７９～２６５２ｎｔ）和ＯＲＦ２（２４１４～２７４６ｎｔ）,分别编码８５８ａａ的２ａ蛋白和１１１ａａ的２ｂ蛋白,并在２ａ蛋白的序列中发现了动植物病毒复制酶所特有的两个保守序列。该株系ＲＮＡ２核苷酸序列与分属ＣＭＶＩ亚组的Ｆｎｙ株系和ＩＩ亚组的Ｑ株系ＲＮＡ２的核苷酸序列同源性分别为９１７％和７５６％;２ａ蛋白的氨基酸序列同源性分别为９３８％和６７７％,２ｂ蛋白的氨基酸序列同源性分别为８３０％和５１３％。同源性比较的结果表明ＳＤ株系属于ＣＭＶＩ亚组。     

黄瓜花叶病毒香蕉株系(CMV-Xb)RNA3 cDNA的克隆和序列分析

通过RT-PCR方法,设计两对引物,克隆了黄瓜花叶病毒香蕉株系(CMV-Xb)RNA3,并进行了核苷酸和蛋白质水平上的分析.结果表明Xb株系RNA3全长2205nt,具有两个蛋白编码阅读框架(ORF),其中5'端(97～936nt)编码一个279aa的3a蛋白;3'端(1225～1871nt)编码一个218aa的CP蛋白.5'非编码区域为96nt;基因间隔区(IR)长288nt;3'NR含有324nt.通过与亚组Ⅱ其它株系RNA3核苷酸和所编码产物推导的氨基酸序列分析发现,亚组Ⅱ株系无论在编码区还是非编码区的核苷酸同源性都相对较高;亚组Ⅱ株系在进化过程中具有连续性.     

卫星RNA对黄瓜花叶病毒基因组RNA体外合成的影响

卫星ＲＮＡ对黄瓜花叶病毒基因组ＲＮＡ体外合成的影响杨海花,康良仪,赵大健,田波（中国科学院微生物研究所,北京１０００８０）关键词卫星ＲＮＡ,黄瓜花叶病毒,依赖ＲＮＡ的ＲＮＡ聚合酶,体外合成利用卫星ＲＮＡ生防制剂控制田间的番茄、青椒、烟草等由黄瓜花叶病...     

卫星RNA作为黄瓜花叶病毒病生防因子的研究III．卫星RNA对黄瓜花叶病毒感染的烟叶组织中病毒双链RNA含量的影响

用3H尿嘧啶核苷标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分析、放射自显影等技术以及根据抗RNA酶和DNA酶的性质比较了感染黄瓜花叶病毒(CMV)及其带有卫星RNA的黄瓜花叶病毒(CMV-S52)的三生烟叶组织中病毒ds RNA含量的变化。结果表明,随接种后时间的延长,CMV-S32感染的组织中卫星RNA的ds RNA含量呈直线增长,第10天达最高峰,而病毒基因组RNA的ds RNA的含量则随时间延长而降低,这一趋势一直延续到最后一次测定。卫星RNA的双链RNA含量也比病毒基因组ds RNA高得多,从接种后的第二天的2．5倍到第10天的20倍及第l{天的近40倍,但不含卫星RNA的cMV接种后在所测定的14天内,各基因组RNA的ds RNA含量比较衡定。     

两株黄瓜花叶病毒卫星RNA的竞争与共存研究

通过体外转录方法 ,将大小分别为 36 9nt和 385nt的 2个黄瓜花叶病毒 (Cucumbermosaicvirus,CMV)的卫星RNAYi和Yns共同与不含卫星的辅助病毒株CMV_CNa进行假重组 ,接种CMV系统寄主心叶烟。结果表明 :在接种5d的接种叶上同时检测到卫星RNA_Yi和卫星RNA_Yns;在系统叶上 ,接种 5d和 10d亦可同时检测到 2株卫星 ;但接种 15d ,在系统叶组织中只检测到卫星RNA_Yi。再将接种 5d的接种叶扩大接种到几种不同的指示植物后 ,经dsRNA抽提 ,也只获得 1条与卫星RNA_Yi大小相符的条带。通过假重组病毒株中分别获得卫星RNA并测序 ,确定2个卫星RNA的序列没有变化。卫星RNA_Yns和Yi在辅助病毒CMV_CNa作用下 ,表现出明显的竞争性 ,它们在辅助病毒中不能形成稳定的共存关系。     

Genetic analysis of helper virus-specific selective amplification of cucumber mosaic virus satellite RNAs

Satellite RNAs (sat-RNAs) are small molecular parasites associated with a number of plant RNA viruses. The cucumber mosaic virus (CMV) sat-RNAs are ca. 335 nucleotides and have evolved to produce a large number of closely related sat-RNAs. Different cucumoviruses can act as helper viruses in the amplification of CMV sat-RNAs. We have found that different helper viruses show a preference for a particular sat-RNA in a mixed infection. In this study the specificity of WL47 sat-RNA amplification by LS-CMV and of D4 sat-RNA amplification by tomato aspermy virus in mixed infections was examined. Recombinant cDNA clones of D4 sat-RNA and WL47 sat-RNA were used to map the sat-RNA sequences responsible for the helper virus selection of a specific sat-RNA for amplification.Correspondence to: M.J. Roossinck     

用黄瓜花叶病毒卫星RNA生防制剂大面积防治麦茬辣椒病毒病

用黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）卫星ＲＮＡ生防制剂Ｓ＿（５２）免疫辣椒,能防治辣椒由ＣＭＶ引起的病毒病。用Ｓ＿（５２）免疫接种辣椒的大田对比试验,防效达５９．５－７１．０％,产量比对照增加２６．１－３２．２％,产值增加３３．５－４５．２％。小区对比试验,用Ｓ＿（５２）免疫接种５０天的辣椒,防效达７１．３－９２．９％,免疫接种８０天,防效达５５．９－７８．５％,产量比对照增加３６．０－６５．３％,产值增加４９．３－９３．５％,还有刺激生长,促进早熟和增强对真菌、细菌病害抵抗作用。     

J亚群白血病病毒NX0101株感染性克隆化病毒的构建及其致病性

采用PCR方法分3段扩增出J亚群白血病病毒NX0 10 1株的前病毒cDNA ,PCR产物经克隆后顺次连接,获得一个含有完整ALV J前病毒cDNA的重组质粒,命名为pALV J NX。将此质粒DNA纯化后转染鸡胚成纤维细胞,以针对ALV J的单克隆抗体JE9对转染后的细胞作间接免疫荧光反应,证明获得了具有感染性的病毒。测定原始野毒和分子克隆化病毒的半数组织感染量(TCID50 ) ,分别人工接种1日龄商品代肉鸡并隔离饲养17周。接种野毒组死亡率为2 6 % ,髓细胞瘤发病率为2 4 %。接种分子克隆化病毒组死亡率为2 2 % ,髓细胞瘤发病率为2 2 %。结果表明,克隆化病毒具有天然病毒的致病性并对肉用型鸡表现致瘤性     

Resistance of tomato infected with cucumber mosaic virus satellite RNA to potato spindle tuber viroid

Tomato (Lycopersicon esculentum cvs Rutgers and Lichun) plants were firstly pre-inoculated either with a cucumber mosaic virus (CMV) isolate containing satellite RNA (CMV-S52) or with a CMV isolate without satellite RNA, and then challenged 14 days later with a severe strain of potato spindle tuber viroid (PSTVd). Also, tomato plants transformed with CMV satellite cDNA and non-transgenic control plants were directly inoculated with PSTVd. Protection effects were assessed by the observation of symptoms and by assay of PSTVd accumulation in tomato plants using return polyacrylamide gel electrophoresis and silver staining. The results indicated that the satellite-transgenic plants and plants pre-inoculated with CMV-S52 showed much milder symptoms of PSTVd infection than the respective control plants. The concentration of PSTVd RNA in the satellite-transgenic plants and CMV-S52 pre-inoculated plants was reduced to about 0.02–0.03 of the controls. PSTVd infection did not increase the amount of satellite ds-RNA in plants. It is concluded that the plant resistance to PSTVd is induced by the presence of satellite RNA rather than the CMV infection. It is suggested that as there is considerable sequence similarity between satellite RNA and PSTVd, base pairings may be a cause of reduction of both symptoms and the accumulation of PSTVd.     

Resistance of tomato infected with cucumber mosaic virus satellite RNA to potato spindle tuber viroid

Tomato (Lycopersicon esculentum cvs Rutgers and Lichun) plants were firstly pre-inoculated either with a cucumber mosaic virus (CMV) isolate containing satellite RNA (CMV-S52) or with a CMV isolate without satellite RNA, and then challenged 14 days later with a severe strain of potato spindle tuber viroid (PSTVd). Also, tomato plants transformed with CMV satellite cDNA and non-transgenic control plants were directly inoculated with PSTVd. Protection effects were assessed by the observation of symptoms and by assay of PSTVd accumulation in tomato plants using return polyacrylamide gel electrophoresis and silver staining. The results indicated that the satellite-transgenic plants and plants pre-inoculated with CMV-S52 showed much milder symptoms of PSTVd infection than the respective control plants. The concentration of PSTVd RNA in the satellite-transgenic plants and CMV-S52 pre-inoculated plants was reduced to about 0.02-0.03 of the controls. PSTVd infection did not increase the amount of satellite ds-RNA in plants. It is concluded that the plant resistance to PSTVd is induced by the presence of satellite RNA rather than the CMV infection. It is suggested that as there is considerable sequence similarity between satellite RNA and PSTVd, base pairings may be a cause of reduction of both symptoms and the accumulation of PSTVd.