hprK 基因敲除及对其枯草芽孢杆菌核黄素发酵的影响

枯草芽孢杆菌在葡萄糖丰富的环境中,胞内糖分解代谢物浓度的提高将引起碳分解代谢物阻遏效应（CCR）及糖吸收 的抑制,对核黄素等发酵过程产生不利影响。通过缺陷细胞的分解代谢物控制蛋白A（CcpA）可以解除CCR效应,但不能解除糖吸收的抑制。磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统（PTS）是枯草芽孢杆菌主要的糖吸收方式,HPr蛋白和双功能的HPr激酶/HPr-Ser46-P 磷酸酶（HprK/P）参与PTS系统的调控。在葡萄糖丰富的条件下,K96SRQ 的激酶活性受1,6二磷酸果糖激活,催化HPr蛋白46位丝氨酸残基磷酸化,形成HPr-Ser46-P.HPr-Ser46-P抑制某些碳源透过酶基因的表达;同时HPr-Ser46-P难以被酶I在His15磷酸化,不能在PTS系统中发挥转移磷酸基团的作用,使细胞的糖吸收受到抑制。在CcpA缺陷的背景下,敲除核黄素生产菌株B.subtilis24Al/Pmx45 的HprK/P 编码基因hprK,构建了CcpA和HprK/P双缺陷的重组菌B.subtilisZHc/Pmx45.摇瓶发酵显示,B.subtilisZHc/Pmx45核黄素发酵的最适葡萄糖浓度由24Al/Pmx45的8%提高到10%;核黄素产量达到4.374mg/Ml,比24Al/Pmx45提高了19.2%。结果表明,CcpA和HprK/P的双缺陷可有效解除高浓度葡萄糖所引起的CCR效 应和糖吸收抑制,有助于提高细胞对葡萄糖的耐受力,并提高核黄素产量。     

枯草芽孢杆菌ccpA基因敲除及对其核黄素产量的影响

CcpA蛋白是介导枯草芽孢杆菌碳分解代谢物阻遏(CCR)的全局调控因子,由ccpA基因编码。CCR效应的存在影响B.subtilis对葡萄糖的利用,降低B.subtilis生产发酵产品的效率。采用基因重组技术敲除了核黄素发酵菌株B.subtilis24/pMX45的ccpA基因,构建了CcpA缺陷株B.subtilis24A1/pMX45。发酵结果显示:B.subtilis24A1/pMX45能够在70h内基本耗尽10%的葡萄糖,生物量达到1.5×109个细胞/mL,溢流代谢产物积累量减少,在8%和10%葡萄糖浓度下,B.subtilis24A1/pMX45核黄素产量分别比B.subtilis24/pMX45提高了62%和95%。CcpA的缺陷,可以缓解葡萄糖引起的CCR效应,显著提高菌株的核黄素产量。     

蜡样芽孢杆菌ATCC14579核黄素操纵子的克隆及在枯草芽孢杆菌中的表达

利用BLAST从B．cereus ATCC14579的基因组中找到一段与枯草芽孢杆茵核黄素操纵子具有较高相似性的4．6kb大小的基因组DNA片段,该片段中含有完整的核黄素操纵子。该操纵子结构基因的编码产物的氨基酸序列与枯草芽孢杆菌核黄素操纵子相应结构基因的编码产物的氨基酸序列具有99％的同源性。该片段被克隆到大肠杆茵一枯草芽孢杆茵穿梭载体pHP13M中。表达分析的结果表明B．cereus ATCC14579核黄素操纵子可在大肠杆茵和枯草芽孢杆菌中表达。利用PCR方法用来自枯草杆菌的sac B基因的启动子替换B．cereus ATCC14579核黄素操纵子原有的启动子使其更好表达。替换启动子后的核黄素操纵子在本文使用的发酵条件下有较好的表达,核黄素产量从39．5mg／L增加到61．7mg/L.     

枯草芽孢杆菌基因修饰生产核黄素

【目的】研究枯草芽孢杆菌核黄素合成途径、木糖代谢相关基因修饰对核黄素合成的影响。【方法】单独过表达或共同过表达核黄素操纵子中的基因、过表达木糖代谢相关基因构建相应的重组菌株。通过测定和比较重组菌株摇瓶发酵的核黄素产量和生物量,表征各个基因修饰的效应。采用摇瓶和5 L罐发酵,考察木糖作为主要碳源以及木糖与蔗糖共代谢对核黄素发酵的影响。【结果】ribA基因单独过表达,使核黄素产量提高99%,但生物量降低30%,出现细胞自溶现象。ribA-ribH基因共表达,使核黄素产量提高280%,并且无细胞自溶和生物量下降现象。1.5%蔗糖与6.5%木糖作为碳源,5 L发酵罐发酵70 h,核黄素产量达到3.6 g/L,与8%蔗糖为碳源的发酵相比,核黄素产量提高80%。木糖代谢相关基因过表达,均明显降低核黄素产量。【结论】与ribA基因单独过表达相比,ribA-ribH基因共表达可有效避免细胞自溶现象,并能进一步提高核黄素产量。蔗糖与木糖共代谢,能够改善前体物供给,有利于提高核黄素产量。     

枯草芽孢杆菌核黄素操纵子rib operon的克隆与表达

目的:构建产核黄素的枯草芽孢杆菌基因工程菌.方法:以穿梭载体pEB03构建核黄素操纵子的表达质粒载体pGJB13和pGJB14,与质粒pMX45分别转化产核黄素的枯草芽孢杆菌GJ07,并通过发酵摇瓶实验检测核黄素的产量.结果:得到产核黄素的工程菌GJ13 、GJ14和GJ08,在以蔗糖为碳源的发酵条件下,GJ08可产核黄素820mg/L,提高了约55%.结论:得到了产核黄素的高产菌种G J08.     

枯草芽孢杆菌核黄素操纵子与ribC基因的修饰与遗传效应

[目的]研究核黄素操纵子(rib)组成型高表达,以及ribC基因低水平表达对枯草芽孢杆菌过量合成核黄素的影响.[方法]在染色体原位修饰启动子,用mRNA稳定子替换mRNA前导区,使rib操纵子组成型高表达;修饰ribC基因的启动子,降低ribC基因的表达水平.采用qRT-PCR方法,表征基因的相对表达水平;通过摇瓶发酵,测定重组菌的生物量和核黄素产量,表征相关基因修饰所表现的遗传效应.[结果]用gsiB mRNA稳定子替换核黄素操纵子的mRNA前导区,使其相对表达水平提高了约1 500倍.ribC基因启动子-35区的首个碱基由“T”突变为“C”,使ribC基因的表达水平下降了97％以上.得到的重组菌株LX34在补加蔗糖20 g/L的LB培养基上摇瓶发酵36 h,可积累核黄素2.1 g/L,同时生物量没有明显下降.[结论]使用gsiB mRNA稳定子,能够有效地提高目标基因或操纵子的表达水平;启动子-35区首个碱基的点突变,能够有效降低ribC基因的表达水平;rib操纵子过量表达和ribC基因低水平表达,使细胞能够过量合成并积累核黄素.     

枯草芽孢杆菌cdd基因敲除及对胞苷发酵的影响

目的:通过敲除出发菌株上的胞苷脱氨酶基因,阻断嘧啶代谢通量由胞苷流向尿苷和尿嘧啶,选育胞苷产生菌。方法:采用同源重组的方法敲除枯草芽孢杆菌TS8的胞苷脱氨酶基因cdd,并通过遗传稳定性实验验证其缺失标记和胞苷产量,通过摇瓶发酵实验对比出发菌株和缺失株的产苷水平。结果:cdd基因缺失菌株TSb发酵72h,发酵液中胞苷产量达到1.72g/L,与原始菌株相比提高了44.19%,且遗传性状稳定。结论:cdd基因的缺失可有效阻断嘧啶代谢通量由胞苷流向尿苷和尿嘧啶,提高胞苷产量。     

枯草芽孢杆菌bgIS基因在酵母染色体上整合

将枯草杆菌β－１,３－１,４－葡聚糖酶基因（ｂｇＩＳ）２．７ｋｂＥｃｏＲＩ片段和酵母染色体ｒＤＮＡ片段克隆到整合型不含酵母自主复制序列（Ａｕｔｏｎｏｍｕｓｌｙ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）的大肠杆菌／酵母菌穿梭质粒ＹＩＰ５上,构建成ＹＩＰ５－ｂｇＩＳ－ｒＤＮＡ的杂种质粒ＰＣＺＨ,转化Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ并得到表达。稳定性测定表明,Ｙ３３（ＰＣＺＨ１０１）和Ｙ３３（ＰＣＺＨ１０４）     

地衣芽孢杆菌α—淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的诱导表达

采用PCR技术扩增了sacB基因的启动子-信号序列,并将扩增的序列重组进含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的质粒载体上构建了含α-淀粉酶基因的分泌型表达载体pSA60。将pSA60转化枯草芽孢杆菌QB1098后,α-淀粉酶基因在sacB基因启动子-信号序列的调控和蔗糖的诱导下获得表达,表达产物分泌至胞外。     

产嘌呤核苷的枯草杆菌prsA基因在大肠杆菌中的表达

为了克隆产嘌呤核苷的枯草杆菌prsA基因。用PCR扩增的方法,从产肌苷的枯草杆菌Bacillus subtilis JSIM-1019中克隆出一个长1kb长的DNA片段,经功能检测,证明正向插入片段与大肠杆菌的磷酸核糖焦磷酸营养缺陷特性（PREP-）能够营养互补。含有该重组质粒的PRPP缺陷大肠杆菌JSIM—DH-27在基本培养基上的能够生长。     

枯草芽孢杆菌抗脯氨酸结构类似物突变株的筛选及突变株proBA基因的克隆和序列分析

利用亚硝基胍对枯草芽孢杆菌93151进行诱变处理,获得了耐NaCl浓度达14％的突变株,同时发现该突变株也是一个抗脯氨酸反馈抑制突变菌株,其胞内自由脯氨酸的含量随着盐浓度的提高显著增加,说明其对渗透压的耐受能力与胞内自由脯氨酸的含量紧密相关。利用PCR方法克隆突变株的proBA基因,得到一个约2.3kb的DNA片段,序列分析表明该片段含有一完整的proB基因和部分proA基因,与野生菌株的proB基因相比,突变株proB基因中有3个碱基发生了改变,其中一个碱基的变化（从起始密码子开始第781位由T→A）导致了一个氨基酸发生改变（Ser→Thr),另外两个碱基变化为沉默位点突变。将该proB基因转入大肠杆菌脯氨酸营养缺陷型菌株,能够与其功能互补。同时对部分proA基因序列分析发现,其与proB基因头尾重叠。在proA基因起始密码子上游第14个碱基处有一个类似于SD的序列,其所编码的氨基酸序列与枯草芽孢杆菌168的同源性为77％。     

枯草芽孢杆菌耐盐突变株proA基因克隆及proBA基因渗透压调节功能研究

利用TaKaRaLAPCRTM试剂盒扩增枯草芽孢杆菌 931 5 1耐盐突变株proA基因的未知下游序列。根据测序结果 ,设计引物 ,克隆出发菌株和突变株全长proBA基因。将出发菌株和突变株的proBA基因分别转化大肠杆菌JM83(proBA- ) ,均能够与其功能互补。SDS PAGE分析其表达产物 ,有两条分子量分别约为 4 0kD和 4 5kD的新蛋白带出现。测定 4种转化子 (分别含有出发菌株和突变株proB基因的大肠杆菌 1 1 2 5 2转化子及proBA基因的大肠杆菌JM83转化子 )的耐盐能力。发现含有突变株proB或proBA基因转化子的耐盐能力 ,均比相应的含有出发菌株proB或proBA基因的转化子高。另外含有出发菌株和突变株的proBA基因转化子的耐盐能力 ,也均比相应的仅含proB基因的转化子高 ,表明枯草芽孢杆菌的ProA比大肠杆菌的ProA更为有效。测定所有JM83转化子胞内自由脯氨酸 ,发现其含量随盐浓度的上升而提高 ,其中含突变菌株proBA基因的转化子提高更为显著     

枯草杆菌DC-2纳豆激酶基因的克隆及其融合蛋白在E.coli中的表达

纳豆激酶是一种纤维蛋白溶解酶 ,有望开发成为新型的溶栓药物 .从中国豆豉中分离的具有较强纤溶活性的枯草杆菌DC 2中提取总DNA ,根据纳豆激酶 (NK)基因序列设计引物 ,用PCR法扩增NK基因 .序列分析表明 ,NK基因成熟肽编码区含有 82 5bp ,编码 2 75个氨基酸残基 ,与文献报道的序列分别有 93 4 %和 94 5 %同源性 .将NK基因插入载体pGEX 4T1构建表达质粒pGEX NK ,转化大肠杆菌JM10 9后 ,经 1mmol LIPTG诱导 4h ,发现大量NK融合蛋白表达 ,并形成包涵体 .SDS PAGE分析表明 ,NK融合蛋白作为包涵体的分子量为 5 3kD .凝胶自动扫描结果显示 ,NK融合蛋白约占菌体可溶性蛋白的 2 6 % .     

枯草芽孢杆菌渗透压调节基因proB的克隆和表达

用PCR扩增的方法从耐盐的枯草杆菌中克隆出一个13kb长的DNA片段,经功能检测,证明正向插入片段与大肠杆菌的脯氨酸营养缺陷特性(proB-)能够营养互补。含有该重组质粒的大肠杆菌DH5α在基本培养基上的耐盐能力从2%提高至4%。通过引物步行法测定了该插入片段的核苷酸序列。利用DNAsis软件进行序列分析发现,该片段第122～1235bp核苷酸编码一个由370个氨基酸组成的蛋白质分子,其上游存在非典型的-10区,典型的-35区和核糖体结合位点,起始密码子处有最佳翻译起始效率的侧翼核苷酸序列。将其与Genebank中的已知基因的序列和编码的氨基酸序列进行同源性比较,结果表明该片段与枯草杆菌168的核苷酸序列、氨基酸序列的同源性分别为81%和90%。证明该基因确实是一个proB基因。通过与三十个不同种属微芽生物proB基因的氨基酸序列比较,发现该蛋白存在有可能与形成酶的活性中心和三维结构有密切关系的几个绝对保守的区域。     

透明颤菌血红蛋白基因在提高枯草芽孢杆菌产脂肽功能中的研究

脂肽是一类具有特殊作用的生物表面活性剂。本实验将血红蛋白基因(vhb)置于RDR细菌启动子驱动下的质粒PSET中,构建PSET-RDR-vhb重组质粒,并通过电激作用转入脂肽代谢菌株-枯草芽孢杆菌株(bacillus subtilis)ZW-3中,转化菌株经酶切和PCR电泳检测鉴定,Southern-blot杂交显示部分转化菌株中外源基因插入基因组DNA,采用一氧化碳差异色谱法测定了血红蛋白的表达量。实验进一步对转化菌株的生长曲线、总蛋白量、过氧化氢酶活性、脂肽的产率进行了测定,结果显示,相比于原始菌株,转化菌株数据均有明显提高。     

Biomass recycling from a riboflavin cultivation with B. subtilis: lysis, extract production and testing as substrate in riboflavin cultivation

Autolysis of riboflavin-producing B. subtilis can be induced by pH, lack of carbon source, and the buffer system. Stress factors like temperature shift or oxygen dearth enhance the autolysis process. After cultivation of a riboflavin-producing strain, the pH of the whole culture broth was adjusted to 6.5-7.5. At a temperature of 40 degrees C, autolysis started after 1 h. Adding a defined amount of commercially available endo- and exo-proteases enhanced both auto- and proteo-lysis. Optimization of endo- and exo-protease concentrations and of the time increased the degree of proteolysis. Additionally, the amount of DNA and Protein trapped in the riboflavin crystals could be significantly reduced by autolysis. After autolysis, the cultivation broth was centrifuged and the supernatant was cross-flow filtrated with a cut off of 10 kDa. Using this autolysate instead of yeast extract as a medium component for riboflavin production with B. subtilis, a riboflavin yield of 77% was obtained in comparison with the standard cultivation on yeast extract.