质粒DNA单次脾内注射制备单克隆抗体

探索一种新的快捷有效DNA免疫制备单克隆抗体的方法,辅助实现构建高通量无蛋白纯化体系单克隆抗体制备和筛选。分别通过“重叠PCR”和“无模板PCR”在pVAX1真核载体中分别引入IL-2信号肽、IgG kappa链信号肽构建分泌型真核表达载体,将代表抗原基因的profilin1基因克隆到经改造带有信号肽基因的表达载体上,构建重组质粒pVAX-IL2-prof1和pVAX-Igκ-prof1,单次脾内注射重组质粒DNA免疫BALB/c小鼠。经过细胞融合、ELISA筛选,获得两株抗profilin1的单克隆抗体。单抗亚型分别为IgM和IgG3。单次脾内质粒DNA免疫便捷有效,是制备单克隆抗体的有效方法。     

人tPA信号肽和Yersinia Pestis保护性抗原F1-V融合基因的构建及其免疫效果观察

为获得含有鼠疫F1和V抗原编码基因以及人tPA信号肽基因的重组质粒tPA-pVAX1/F1-V,并测定其诱导特异性免疫应答的能力, 用PCR扩增鼠疫菌F1和V编码基因,分别与pGEM-T连接测序,构建pVAX1/F1-V融合重组质粒.PCR扩增tPA信号肽片段并将其插入到F1-V的上游,构建tPA-pVAX1/F1-V融合重组质粒;转染COS-7细胞,Western blot法鉴定目的蛋白的表达.重组质粒tPA-pVAX1/F1-V加GM-CSF佐剂免疫BALB/c小鼠,观察免疫效果.400个LD50强毒鼠疫菌皮下攻毒观察保护率.结果表明,tPA-pVAX1/F1-V在COS-7细胞中表达;免疫鼠体内产生特异性抗体;抗体亚型分析、细胞因子等指标的测定表明,所构建DNA疫苗以诱发Th1型免疫为主;攻毒保护率达90%.结果提示,已成功构建F1-V融合蛋白真核表达载体tPA-pVAX1/F1-V,且具有诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答的能力, 对强毒鼠疫菌皮下攻毒有一定的保护效力,为鼠疫菌新型疫苗研制奠定了基础.     

纳豆激酶基因在大肠杆菌中的表达及活性分析

目的:构建纳豆激酶基因的表达载体,鉴定其在大肠杆菌中的表达及表达产物的生物活性鉴定.方法:以纳豆芽胞杆菌基因组为模板,PCR技术克隆出纳豆激酶基因的成熟肽序列,分别克隆进具有信号肽的pMAL-p2x及无信号肽pMAL-c2x质粒中,经酶切和测序鉴定其正确性,分别将重组质粒转化至大肠杆菌中表达.结果:成功构建的两组重组质粒在IPTG诱导下,均能分别在37℃及16℃条件下表达出可溶性的融合蛋白,SDS-PAGE胶检测证实重组质粒在大肠杆菌中可表达出相对分子量约76kDa的纳豆激酶蛋白.纤维蛋白平板实验证明两种融合蛋白均有活性,且有信号肽的融合蛋白的酶活较无信号肽的融合蛋白高.结果:成功构建了两组重组纳豆激酶基因的表达质粒,且该两组重组基因在大肠杆菌中可溶性表达并具有生物活性,因此为下一步研究表达产物纳豆激酶的功能、应用和生产奠定了基础.     

含人抗体恒定区基因的酵母表达质粒的构建

本文主要报告了用以表达人-鼠嵌合抗体基因的酵母表达载体的构建、筛选与鉴定的研究结果.作者利用高度表达的酵母质粒YEP_(51),与含人抗体恒定区基因的pSV_2gptHuG_4两个质粒为材料,构建成可以供表达任何小鼠单克隆抗体的可变区基因,以构成嵌合的人-鼠抗体基因,用酶切回收插入DNA片段、原位和斑点杂交法对重组质粒予以鉴定和筛选,获得了pYEP-H重组的酵母表达载体.     

EB病毒融合基因重组BCG穿梭质粒的构建及表达

分别以卡介苗(BCG)和EB病毒融合基因cDNA为模板,通过PCR扩增得到139bp的BCG-Ag85B信号肽序列和2291bp的Z2A基因序列。将BCG-Ag85B信号肽序列与大肠杆菌-卡介苗穿梭表达载体pMV261重组,得到重组质粒pMVS。再将EB病毒融合基因序列Z2A亚克隆至pMVS中,得到重组质粒pMVZ2A,电转化导入BCG。SDS-PAGE分析结果表明,构建的重组质粒pMVZ2A经双酶切、PCR扩增及测序鉴定证实,克隆基因BCG-Ag85B信号肽和Z2A正确插入载体pMV261,电转化导入BCG,能够在BCG中分泌表达。     

小鼠IL-35基因毕赤酵母表达载体的构建及表达

目的构建真核酵母表达载体pPIC9K与小鼠IL-35基因的重组质粒pPIC9K-mIL-35-His,在毕赤酵母GS115菌株中诱导表达,并对其进行鉴定。方法以pET-30a-mIL-35为模板,用PCR扩增出IL-35去信号肽基因全序列,并在3'端引入His标签,构建重组质粒pPIC9K-mIL-35-His,经SalⅠ线性化重组质粒后,用电穿孔方法将该基因转染毕赤酵母细胞内。经G418梯度筛选高拷贝转化子,筛选Mut+表型后经PCR进一步鉴定IL-35基因与酵母染色体是否整合。小量诱导表达筛选出高表达菌株,大量甲醇诱导表达,以SDS-PAGE及免疫印迹(Western blot)鉴定蛋白表达。结果小鼠IL-35基因真核酵母表达载体pPIC9K-mIL-35-His构建成功,并且在GS115中通过甲醇诱导表达,经SDS-PAGE及Western blot分析,可见相对分子质量约为65 000的目的蛋白。结论实验所构建的重组质粒pPIC9K-mIL-35-His可在毕赤酵母GS115中正确的表达小鼠IL-35基因。     

信号肽序列对禽流感病毒H5N1 HA 蛋白GFP融合分子在真核细胞中表达的影响

[目的]构建绿色荧光蛋白(GFP)与禽流感病毒(AIV)HA基因的融合表达载体,观察信号肽序列的有无及位置对HA-GFP在293T细胞中的表达影响.[方法]应用PCR方法从H5N1亚型AIV质粒DNA中扩增出完整的或除去信号肽序列的HA基因片段,PCR产物经Xho Ⅰ和SmaⅠ双酶切后定向插入绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1的不同位点,将得到的重组体M1,M2和M3分别转化宿主菌DH5a,经双酶切及.DNA测序鉴定分析后,采用脂质体转染法将pEGFF-C1,M1,M2和M3转染人胚肾细胞系293T细胞,荧光显微镜下观察HA-GFP的表达,流式细胞仪检测表达HA蛋白的细胞百分数.[结果]经酶切及测序鉴定成功构建了HA-GFP重组表达载体M1,M2和M3,荧光显微镜及流式细胞仪检测到重组质粒转染的293T细胞表达强的荧光蛋白,信号肽的有无对HA-GFP融合蛋白在293T细胞中的表达有显著影响,信号肽序列使HA-GFP融合蛋白在293T细胞中的表达减少,而信号肽的位置对融合蛋白表达量的影响不显著.[结论]信号肽的有无对HA-GFP融合蛋白在细胞中的表达有显著影响.     

博尔纳病病毒pEGFP-p24基因重组质粒的构建及鉴定

构建博尔纳病病毒pEGFP-p24基因重组表达质粒。通过PCR方法扩增获得博尔纳病痛毒p24基因的完整序列,将此片段定向克隆到pEGFP-N1载体多克隆位点区,筛选重组阳性菌株,提取重组质粒,利用PCR方法和核酸序列测定验证重组质粒构建的正确性。PCR及核酸序列测定证明博尔纳病病毒pEGFP-p24基因重组表达质粒构建成功。构建的重组质粒将为研究博尔纳病病毒p24基因在真核细胞中的功能和作用提供实验依据。     

一种展示SARS冠状病毒受体结合区的重组枯草杆菌芽孢的制备及免疫原性分析

目的：利用枯草杆菌芽孢呈递技术制备表达SARS冠状病毒S蛋白受体结合区（RBD）的重组芽孢。方法：将枯草杆菌 CotB 基因构建到基因组整合质粒pDG1664中,再将 RBD 基因连接到 CotB 基因的下游,构建成重组质粒pDG1664-CotB-RBD,通过同源重组整合到PY-79枯草杆菌基因组中;利用红霉素抗性筛选重组菌并进行PCR和DNA测序鉴定,Western印迹鉴定重组菌芽孢表面RBD蛋白的表达情况;用表达RBD的重组芽孢以口服方式免疫小鼠,通过ELISA和流式细胞术检测重组芽孢的免疫原性。结果：制备出枯草杆菌基因组整合了RBD抗原基因的重组菌株RS1931,形成的重组芽孢表达相对分子质量约62×103的CotB-RBD融合蛋白;重组芽孢免疫的小鼠血清RBD抗原特异性IgG抗体滴度在末次免疫后2周可达1∶10880,重组芽孢初免后18周的小鼠脾细胞中IFN-γ＋CD4^＋、IL-4＋CD4^＋和IFN-γ＋CD8^＋T细胞比例上调,表明重组芽孢经口服免疫产生良好的体液免疫和细胞免疫应答。结论：针对SARS冠状病毒S蛋白RBD建立了枯草杆菌芽孢呈递技术方法,制备出在枯草杆菌芽孢表面稳定表达外源RBD蛋白的重组株,获得的重组芽孢具有良好的免疫原性,为开发芽孢呈递型SARS疫苗奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫保守蛋白CHP559基因克隆与真核表达

为构建柔嫩艾美耳球虫保守蛋白Et CHP559基因的真核表达重组质粒pc DNA3.1-flag-Et CHP559,并转染DF-1细胞进行表达。利用5'RACE技术克隆获得了柔嫩艾美耳球虫Et CHP559基因全长c DNA序列,该基因全长为1 746 bp,ORF为104-1 327 bp,编码407个氨基酸,编码蛋白的分子量约为46 k D,并利用生物信息学分析该基因编码蛋白的性质、结构等特征,发现该蛋白含有跨膜结构和信号肽。通过RT-PCR扩增得到含完整开放阅读框的基因片段,并将其与真核表达载体pc DNA3.1-flag连接,构建了真核重组表达质粒pc DNA3.1-flag-Et CHP559,所构建的真核重组表达质粒pc DNA3.1-flag-Et CHP559经过PCR和双酶切鉴定,可见一条大小约为1 224 bp的目的条带;重组质粒转染DF-1细胞后,免疫印迹检测可见大小约为47 k D的目的蛋白条带,间接免疫荧光实验显示在DF-1细胞中检测到绿色荧光。这些研究结果表明已成功获得了Et CHP559的全长序列,并成功构建了Et CHP559的真核重组表达质粒,在真核细胞DF-1中获得表达,为深入研究Et CHP559的功能奠定了基础。     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.     

Cause of Senescence of Nine Sorts of Flowers

The levels of endogenous phytohormones and respiratory rate in nine sorts of flowers such as Cymbidium faberi Rolfe, Nopalxochia ackermannii Kunth and others were investigated both at full bloom and senescence and meanwhile the effect of exogenous phytohormones on prolonging the blossoms and promoting ethylene production were tested. There is a high content of endogenous ethylene in all the long-lived flowere, about 3–16 folds higer than the short-lived ones. There is a high level of ABA at full blooming flowers of short-lived flowers, in which there is no or only some cytokinins in it, but the ratio of CTK (6BA+zeatin)/ABA is smaller(l.7). The endogenous ABA reached a much higher level at senescence in all nine sorts of flowers, so it is reasonable to consider that it is ABA which plays an important role of regulation in controlling flower's senescence. There is a much higher level of GA3 and zeatin in the long-lived flowers which is not demonstrated in the shortlived ones. The respiratory rate is one of the factors controtling the longevity of flowers, but it does not play a decided role. Application of 6BA and zeatin prolongs distinctly orchid’s longevity, however exogenous IAA through the promotive action on ethylene production, evidently extends the longevity of the flowers of the Nopalxochia ackermannii Kunth.     

真菌类遗传学分析的知识结构教学

本文以认知结构理论为指导,讨论了真菌类遗传分析与高等动植物遗传分析的内在联系,认为利用这种内在联系进行教学可收到好的效果并说明了作者的具体教学过程。 Abstract:In the paper, the relationship between genetic analysis of Fungi and genetic analysis of high animal and plant was discussed.A good results were obtained when we adopted this method in the teaching.     

医疗机构合理用药评价模型的构建研究

目的 针对医疗机构的合理用药水平进行评价研究。方法 根据医疗机构合理用药的具体要求,构建医疗机构合理用药评价指标体系,采用基于模糊群决策的方法和多指标评价分析法构建医疗机构合理用药评价模型。结果 构建了基于模糊群决策的医疗机构合理用药评价模型,并通过实例分析证明了评价模型的可行性。结论 建立的基于模糊群决策的医疗机构合理用药评价模型能够对医疗机构的合理用药水平进行科学评价,为提高医疗机构合理用药水平奠定基础。     

棉铃虫钙粘蛋白N端多肽多克隆抗体制备及对Bt抗性的初步检测

用重组表达的棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)中肠钙粘蛋白N端多肽片段制备兔多克隆抗体,并利用其对Bt抗性进行鉴定。通过RT-PCR方法对棉铃虫中肠钙粘蛋白N端多肽的基因片段Cad285进行PCR扩增,将其克隆到pET-30a原核表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,得到35ku的重组融和蛋白,融合表达的包涵体经过变性、Ni-NTA柱亲和纯化、复性等方法处理包涵体,获得可溶性纯化蛋白,用纯化后蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA检测其效价高于1∶16000;利用最终获得的多克隆抗体对室内纯合Bt抗/感品系的棉铃虫中肠钙粘蛋白进行Western blot分析,结果显示敏感和抗性品系之间有明显差异,表明其能够应用对Bt抗性进行初步检测。     

龙胆科药用植物化学成分的研究现状

龙胆科植物在我国的分布范围很广,且多数为药用植物,其多数种属的药用植物,至今其化学成分尚未被系统研究。综述了目前龙胆科药用植物的化学成分的研究现状及一般提取方法,对近年来发现的环烯醚萜及裂环烯醚萜类化合物进行了总结,为本科药用植物的更深入研究提供了参考。     

青蒿素生物合成机理研究现状

本文总结了目前有关青蒿素生物合成机理方面的研究,主要包括青蒿素生物合成中生理因子的影响,青蒿素生物合成中间体及前体,青蒿素生物合成细胞定位等。指出了存在的一些问题及今后的研究发展前景。