新生隐球菌通过血脑屏障的研究进展

隐球菌是一种机会感染性真菌,主要侵犯中枢神经系统,隐球菌脑膜炎约占隐球菌感染的80%,死亡率高。研究隐球菌如何侵袭血管内皮细胞,穿过血脑屏障,是揭示隐球菌嗜中枢性的关键。许多因素影响了隐球菌穿越脑血管内皮细胞,如隐球菌毒性因子降解酶、尿素酶使脑血管内皮细胞通透性增加,脑血管内皮细胞CD44分子、HIV-1gp41蛋白能提高隐球菌对大脑血脑屏障的侵入能力等。现就隐球菌通过血脑屏障的机制做一综述。     

隐球菌侵袭血脑屏障相关机制研究进展

隐球菌是一种环境机会致病菌,能够侵袭宿主中枢神经系统并引起致命性的隐球菌性脑膜脑炎。在隐球菌侵犯血脑屏障过程中,有许多重要的致病因素参与,如荚膜、尿素酶、磷脂酶等。其还可以通过多种途径穿越血脑屏障,造成脑部感染。近年来发现隐球菌还可以利用纤溶酶激活基质金属蛋白酶类,使其穿越血脑屏障。该文就隐球菌侵袭血脑屏障的相关机制研究进展作一综述。     

表皮调节素EREG在新生隐球菌穿越血脑屏障机制中的作用研究

目的 测定新生隐球菌侵染血脑屏障过程中表皮调节素EREG(epiregulin)的表达量,探讨EREG在隐球菌穿越血脑屏障过程中的作用。方法 利用新生隐球菌与Transwell小室构建体外血脑屏障模型,以PBS(phosphate buffered solution)为对照组,按照新生隐球菌感染时间分为感染3 h、6 h、12 h三组,通过检测不同感染时间Transwell上室单细胞跨膜电阻及下室菌悬液涂布来判断新生隐球菌对血脑屏障的黏附及穿透能力的改变,并应用western-blot检测该过程中血管内皮细胞EREG的表达量。结果 随着感染时间延长,新生隐球菌对血管内皮细胞的感染程度加剧,穿透血脑屏障的数量增多,血管内皮细胞EREG的表达水平显著增加。结论 新生隐球菌穿越血脑屏障的能力与EREG的表达水平有密切的关系。     

隐球菌感染体外血脑屏障模型的构建与应用

目的构建体外血脑屏障模型,并检测隐球菌不同菌株穿越血脑屏障的能力。方法本研究应用商品化的小鼠脑微血管内皮细胞系b END.3构建体外血脑屏障模型,并验证该模型应用于隐球菌穿越血脑屏障机制研究的可行性。通过构建模型,以非致病性的酿酒酵母作为阴性对照,比较新生隐球菌不同血清型标准株及基因缺陷株穿越体外血脑屏障能力的差异。结果跨膜电阻值(TEER)检测提示体外血脑屏障模型构建成功。检测结果显示酿酒酵母作为阴性对照穿越血脑屏障效率最低,新生隐球菌血清A型标准株H99穿越细胞屏障效率最强,血清D型标准株JEC21穿越细胞屏障效率显著低于H99。较之H99,黑色素酶缺陷株lac1裣穿越体外血脑屏障模型的效率没有显著差异;尿素酶缺陷株ure1裣效率显著下降(P0.05),约为标准株H99通过率的59.9%;荚膜缺陷株cap59裣突破体外血脑屏障模型效率最低,约为标准株H99的18%(P0.001)。结论隐球菌中枢系统感染体外模型成功构建。新生隐球菌突破血脑屏障的能力与其血清型以及荚膜、尿素酶等毒力因子的表达密切相关。     

隐球菌感染体外血脑屏障模型的构建与应用CSCD

目的构建体外血脑屏障模型,并检测隐球菌不同菌株穿越血脑屏障的能力。方法本研究应用商品化的小鼠脑微血管内皮细胞系b END.3构建体外血脑屏障模型,并验证该模型应用于隐球菌穿越血脑屏障机制研究的可行性。通过构建模型,以非致病性的酿酒酵母作为阴性对照,比较新生隐球菌不同血清型标准株及基因缺陷株穿越体外血脑屏障能力的差异。结果跨膜电阻值(TEER)检测提示体外血脑屏障模型构建成功。检测结果显示酿酒酵母作为阴性对照穿越血脑屏障效率最低,新生隐球菌血清A型标准株H99穿越细胞屏障效率最强,血清D型标准株JEC21穿越细胞屏障效率显著低于H99。较之H99,黑色素酶缺陷株lac1裣穿越体外血脑屏障模型的效率没有显著差异;尿素酶缺陷株ure1裣效率显著下降(P<0.05),约为标准株H99通过率的59.9%;荚膜缺陷株cap59裣突破体外血脑屏障模型效率最低,约为标准株H99的18%(P<0.001)。结论隐球菌中枢系统感染体外模型成功构建。新生隐球菌突破血脑屏障的能力与其血清型以及荚膜、尿素酶等毒力因子的表达密切相关。     

新生隐球菌通过S100A10活化尿激酶-纤溶酶系统侵袭血脑屏障的机制研究

目的验证隐球菌可以上调脑微血管内皮细胞S100A10基因来活化尿激酶-纤溶酶系统,从而更易穿过血脑屏障。方法 1将小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3和新生隐球菌B3501共孵育,检测加菌的实验组和不加菌对照组S100A10、UPA基因和蛋白的表达量。2用慢病毒感染血管内皮细胞,比较S100A10基因正常组和沉默组的S100A10和UPA基因和蛋白的表达量。3构建Transwell血脑屏障模型,比较S100A10基因正常组和沉默组隐球菌通过的差异性,用底物显色法检测尿激酶-纤溶酶系统的相关活化情况。结果 1新生隐球菌B3501和bEnd.3共孵育,Real-time PCR显示S100A10和UPA的mRNA高表达;Western-blot显示S100A10目的蛋白和UPA蛋白高表达。2沉默S100A10基因后,S100A10和UPA基因及蛋白表达分别受到抑制。3隐球菌添加到Transwell体外血脑屏障模型中,S100A10基因未沉默组通过血脑屏障的隐球菌数量比S100A10基因沉默组多,尤其是8h、16h、24h,两组差异有统计学意义,P0.05;未沉默S100A10基因的对照组的纤溶酶原和尿激酶的活化程度高于沉默S100A10基因的实验组,其中纤溶酶原在8h、16h、24h,尿激酶在16h、24h,两组差异有统计学意义,P0.05。结论隐球菌能同时使内皮细胞S100A10基因、UPA基因的高表达,活化尿激酶-纤溶酶系统,提高其通过血脑屏障的能力。     

小鼠脑微血管内皮细胞与隐球菌作用前后基因表达谱分析

目的 比较小鼠脑微血管内皮细胞系bEnd.3细胞与隐球菌作用前后基因表达谱的变化,为隐球菌的嗜中枢性研究提供新的线索.方法 采用基因芯片法比较bEnd.3细胞与不同血清型隐球菌作用前后基因表达谱的变化,并进一步通过荧光定量PCR的方法对某些重要基因的变化加以验证.结果 我们对bEnd.3与隐球菌作用前后基因表达进行了对比,共获得差异基因383条,其中263条基因表达下降,120条基因表达上升,并根据比较结果选取了黏附分子CDH 10及硒转运蛋白SELENBP 1两个基因进行荧光定量PCR验证,结果与芯片结果一致.发现bEnd.3与隐球菌作用后CDH 10表达明显下降,而SELENBP1表达明显上升.结论 隐球菌能引起脑血管内皮细胞黏附分子CDH 10表达下降及硒结合蛋白selenbp1表达上升,这可能与其侵袭血脑屏障有关.而SELENBP1的表达上升可能与神经系统症状有关.     

伊曲康唑治疗隐球菌性脑膜炎1例报告并文献复习

隐球菌性脑膜炎是一种严重危害人类健康的疾病,致死率和病残率均较高。伊曲康唑是三唑类广谱抗真菌药物,体外药敏试验显示其具有良好的抗隐球菌活性。但由于伊曲康唑难以通过血脑屏障,在脑脊液中的浓度较低,     

新生隐球菌感染流行病学现状及耐药机制相关研究进展

新生隐球菌是一种广泛存在于环境中的酵母类真菌,主要侵犯中枢神经系统引起隐球菌性脑膜炎。HIV感染是导致隐球菌感染的主要危险因素之一,但近年来关于非HIV患者隐球菌感染的报道不断增加。体外药敏试验证实大部分新生隐球菌对棘白菌素类药物具有内在抗性。两性霉素B和氟康唑是用于隐球菌感染治疗的一线药物,而长期广泛用药引起新生隐球菌对氟康唑的耐药率逐年升高,患者临床治疗失败率居高不下。为进一步加深对新生隐球菌的认识,本文结合国内外流行病学报道及相关研究,从感染现状、生物学特征、诊治方法和耐药性等方面进行综述,以期为新生隐球菌性脑膜炎的临床诊治提供参考。     

蒺藜中甾体皂苷对新生隐球菌生物膜形成的抑制作用

目的 观察蒺藜甾体皂苷类化合物TTS-12对新生隐球菌生物膜形成的影响,探讨其可能的作用机制.方法 光镜观察TTS-12对新生隐球菌生物膜生长形态的影响;MTT法观察TTS-12对新生隐球菌生物膜形成的影响;实时定量RTPCR观察不同浓度TTS-12对新生隐球菌细胞生物膜关键基因PMT4表达的影响.结果 经TTS-12处理的新生隐球菌生物膜结构更疏松,TTS-12可剂量依赖性地降低新生隐球菌生物膜生长动力学指标及PMT4基因表达水平(P＜0.01).结论 TTS-12可抑制新生隐球菌生物膜的形成.通过降低新生隐球菌PMT4基因表达可能是其抑制新生隐球菌生物膜的形成作用机制之一.     

新生隐球菌胞外蛋白水解酶对脑微血管内皮细胞的作用

目的初步探讨新生隐球菌分泌的胞外蛋白水解酶在新生隐球菌穿越血脑屏障致病过程中的作用。方法在含有成熟的脑微血管内皮细胞的培养皿中,分别加入胞外蛋白水解酶相关成分及其特异性抑制剂后,利用相差显微镜动态观察微血管内皮细胞形态学的改变;应用免疫组织细胞化学技术检测基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、微管相关蛋白（Tau-LRP）和低密度脂蛋白受体相关蛋白（LDL—LRP）表达的变化。结果①加入丝氨酸蛋白酶1h后可观察到内皮细胞开始收缩,面积变小,细胞间隙增宽,细胞收缩有时间依从性,至10h时仅为处理前的20％;加入丝氨酸蛋白酶＋抑肽酶后细胞形态学无明显变化（P〉0．05）。②加入隐球菌浓缩上清液1h后内皮细胞开始收缩,至6h时为原来的20％;加入菌株浓缩上清液＋抑肽酶后细胞形态学无明显变化（P〉0．05）。③丝氨酸蛋白酶使内皮细胞的MMP-9、Tau．LRP、LDL—LRP的表达上调,与对照组比较,有显著统计学差异（P〈0．01）。结论新生隐球菌分泌的胞外蛋白水解酶可能通过上调MMP-9和（或）Tau—LRP、LDL—LRP的表达,诱导内皮细胞基质降解和细胞自身微管结构及紧密连接发生变化,最终导致血脑屏障通透性增加,菌体细胞穿越血脑屏障而致病。     

小鼠脑微血管内皮细胞与新生隐球菌GXM作用后基因表达谱分析

目的探索新生隐球菌GXM能否影响脑微血管内皮细胞基因的表达,为进一步研究隐球菌嗜中枢性的分子机制提供线索。方法使用Roche Nimble Gen 12×135K小鼠基因表达谱芯片,筛选小鼠脑微血管内皮细胞系b End.3与不同浓度新生隐球菌GXM作用后差异表达的基因;结合基因本体论(Gene Ontology),使用top GO进行差异基因GO分析,结合GO语义挖掘与隐球菌侵袭中枢神经系统能力相关的差异表达基因的信息;采用荧光实时定量PCR对重要基因PIK3C2G和ADAMDEC1的表达水平变化加以验证。结果 b End.3细胞与新生隐球菌GXM作用前后基因表达对比发现,实验组GXM(90μg/m)组总共有402个基因表达上调,296个基因表达下调,GXM(180μg/m)组总共有421个基因表达上调,564个基因表达下调,细胞膜、细胞骨架、磷酸肌醇-3-激酶活化、1-磷酸肌醇-3-激酶活化、细胞紧密连接等生物过程差异表达基因较为富集;对PIK3C2G基因和ADAMDEC1基因表达水平变化进行荧光定量PCR验证,结果与芯片结果一致,基因表达水平不同程度上升,且与GXM浓度正相关。结论新生隐球菌GXM能够影响脑微血管内皮细胞基因表达,PIK3C2G基因、ADAMDEC1基因表达上调可能和隐球菌穿越血脑屏障有关。     

SBi4211阻断HIV-1 gp41促进新生隐球菌对人脑微血管内皮细胞的黏附作用

【背景】目前艾滋病和新型隐球菌性脑膜炎共病因素导致其高发病率和死亡率的机制尚不明确。【目的】探索S100B抑制剂SBi4211对HIV-1 gp41促进新生隐球菌黏附人脑微血管内皮细胞的影响和可能机制。【方法】黏附实验分析SBi4211是否能阻断HIV-1 gp41诱导下新生隐球菌黏附人脑微血管内皮细胞。使用免疫印迹方法进一步检测在此过程中SBi4211对脑微血管内皮细胞上新生隐球菌透明质酸受体CD44表达的影响。【结果】SBi4211可显著抑制HIV-1gp41对新生隐球菌黏附脑微血管内皮细胞的增强作用,且呈时间、剂量效应(P0.05);免疫印迹结果显示SBi4211可抑制新生隐球菌和/或HIV-1 gp41增加脑微血管内皮细胞上新生隐球菌透明质酸受体CD44的表达。【结论】SBi4211可通过下调受体CD44来阻断HIV-1 gp41对新生隐球菌黏附人脑微血管内皮细胞的增强效应,这为了解HIV-1与新生隐球菌共病机制及其防治策略提供了新思路。     

隐球菌性脑膜炎的诊断与治疗

隐球菌性脑膜炎是由隐球菌属,特别是新生隐球菌及格特隐球菌引起的机会性感染,在免疫抑制者及正常人群均可发病。隐球菌性脑膜炎早期诊断困难,即便接受治疗,患者死亡率仍然很高。在过去几年中,快速及时的检测及早期隐球菌抗原检查取得了重大进展。对晚期HIV感染者行血隐球菌荚膜抗原筛查并进行抢先治疗,有望阻止其进展为临床感染。目前抗真菌药物主要包括多烯类、唑类及氟胞嘧啶,未来药物研究的重点是疗效更好、毒性更小的新型口服抗真菌药。本文总结近几年隐球菌性脑膜炎的相关诊断及治疗进展,旨在对隐脑患者诊疗提供帮助。     

昆仑雪菊挥发油化学成分及对新生隐球菌抗菌作用

【目的】探究昆仑雪菊挥发油对新生隐球菌抗菌活性及细胞膜的影响。【方法】采用水蒸气蒸馏法提取昆仑雪菊挥发油并用GC-MS分析挥发油中的化学成分,采用微量稀释法测定昆仑雪菊挥发油对新生隐球菌的最低抑菌浓度(MIC),研究昆仑雪菊挥发油对新生隐球菌生物量和芽管萌发的影响,以及昆仑雪菊挥发油对细胞膜中麦角固醇合成和细胞膜渗透性的作用。【结果】昆仑雪菊挥发油对隐球菌的最小抑菌浓度为0.781μL/m L,昆仑雪菊挥发油对新生隐球菌的生物量和芽管萌发都有一定的抑制作用,其抑制作用与浓度呈正相关的趋势。昆仑雪菊挥发油能减少新生隐球菌细胞膜中麦角固醇的合成,并使新生隐球菌细胞膜的渗透性发生改变。【结论】昆仑雪菊挥发油通过破坏新生隐球菌细胞膜而对其达到抑制作用。     

新生隐球菌SER5基因的敲除与功能验证研究

目的构建新生隐球菌SER5基因缺陷株,并初步探究其功能。方法敲除SER5基因,通过体外应激应答、黑色素诱导、荚膜诱导、尿素酶测定、生长曲线测定、酵母双杂交实验考察SER5在新生隐球菌中的功能。结果成功构建SER5基因缺陷株,SER5基因缺失后对新生隐球菌的体外应激、荚膜、分解尿素及生长没有显著的影响,但新生隐球菌黑色素合成有显著的降低,通过酵母双杂交实验筛选出可能与Ser5相互作用的19种不同的蛋白编码基因。结论新生隐球菌Ser5影响新生隐球菌黑色素生成,可能与内质网蛋白、内质网稳定蛋白、VAMP7、磷脂转运蛋白、Gmt1、Vti1a等存在相关作用,提示Ser5参与新生隐球菌黑色素的合成或转运过程。     

重庆地区149例艾滋病合并新生隐球菌性脑膜脑炎病例的回顾性研究

目的本研究旨在描述重庆地区住院患者艾滋病合并新生隐球菌性脑膜炎诊断病例的人口学特征、实验室检查概况、治疗方案以及预后影响因素。方法收集整理2016年1月～2018年1月重庆市公共卫生医疗救治中心收治的艾滋病合并隐球菌脑膜炎的病例资料。诊断方法以脑脊液隐球菌培养作为参照进行评估。结果共纳入149个病例。患者的平均年龄为42.54±12.94岁,发病以男性(72.5%)为主,CD4~+T淋巴细胞计数中位数为24.00个/μL,有84.50%的患者HIV RNA≥4 lg拷贝/mL;脑脊液隐球菌墨汁染色的阳性率为98.00%,灵敏度96.80%,特异度100.00%,诊断符合率为61.1%,隐球菌培养的阳性率为63.10%;住院患者死亡率为12.08%(18/149)。青年组(18～44岁)、中年组(44～60岁)、体重下降在2 kg以内、抗真菌治疗前初始脑脊液氯化物正常或降低为艾滋病合并新生隐球菌性脑膜炎住院患者院内结局的保护因素,而头痛、意识障碍、乏力、基线CD4~+T淋巴细胞计数为5～12细胞个数/μL、初始脑压大于250 mm/H_2O为危险因素,其中年龄在18～44岁是艾滋病合并隐脑住院患者的独立保护因素,而意识障碍、乏力为住院患者的两个独立危险因素,差异均有统计学意义。结论艾滋病合并新生隐球菌性脑膜炎的住院患者院内病死率高,临床表现复杂,预后影响因素多,需引起医务工作者的高度重视,加强对该疾病的综合管理。     

靶向金纳米棒对隐球菌活性影响的体外实验研究

目的：设计对隐球菌荚膜特异性标记的靶向金纳米棒,研究靶向金纳米棒的体外光热作用对隐球菌活性的影响。方法晶种生长法制备金纳米棒,偶联隐球菌荚膜抗体,检测表征,与隐球菌体外孵育,近红外激光照射,检测隐球菌活性变化。结果成功制备与荚膜抗体偶联的金纳米棒,体外近红外照射后,隐球菌活性较未偶联抗体的金纳米棒组显著降低。结论靶向性金纳米棒显著增强了近红外激光对隐球菌的光热效应,可用于治疗隐球菌感染的新尝试。     

肺泡巨噬细胞表面甘露糖受体在免疫抑制大鼠肺隐球菌感染中的实验研究

目的探讨免疫抑制大鼠肺泡巨噬细胞(AM)表面表达的甘露糖受体在AM吞噬隐球菌过程中的作用。方法建立免疫抑制(FK506)大鼠模型,流式细胞法检测AM表面甘露糖受体mRNA的表达量,观察免疫缺陷对AM表面甘露糖受体表达的影响。将实验(FK506)组与对照(正常)组大鼠的AM分别与荧光标记的新生隐球菌共培养,观察AM对隐球菌的吞噬情况。结果成功建立免疫抑制大鼠模型,免疫抑制大鼠表达的甘露糖受体与正常大鼠无统计学差别,对隐球菌的吞噬亦无差别。结论免疫抑制状态不是影响甘露糖受体表达的主要因素。     

新生隐球菌与血管内皮细胞相互作用的研究进展

隐球菌性脑膜脑炎的发病率在逐年上升,而隐球菌与血管内皮细胞的相互作用是其侵犯其他深部组织的前提,能够在血管内皮细胞内繁殖并造成其损伤是隐球菌致病的重要因素。本文就两者的相互作用作一综述。