运用CRISPR/Cas9技术敲除人源黏着斑蛋白基因

目的:建立CRISPR/Cas9n系统,用于敲除人源黏着斑蛋白(VCL)基因。方法:设计一个靶向人源VCL基因第3个外显子的单向导RNA(sgRNA),分别克隆表达载体后,通过慢病毒转入人MDA-MB-231细胞,通过PCR及Western印迹检测细胞株中VCL基因的敲除效果。结果:测序结果显示靶向VCL基因CRISPR/Cas9重组质粒构建成功;PCR产物测序结果表明本次设计的Cas9/sgRNA能够对VCL基因进行编辑敲除;Western印迹显示Cas9-VCL组的MDA-MB-231细胞内VCL表达水平较对照组显著降低。结论:通过CRISPR/Cas9系统获得了靶向VCL基因的重组质粒,构建的重组质粒能有效敲除VCL。     

CRISPR/Cas9编辑雪兔Corin基因载体的构建

[目的]通过CRISPR/Cas9系统构建雪兔Corin基因编辑载体。[方法]通过在线CRISPR设计工具设计2个靶点,退火制备sgRNA双链,用BbsⅠ酶得到线性p X330载体后,经重组酶连接得到重组质粒。将重组质粒转化到DH5α感受态细胞,再对其进行PCR鉴定及测序比对分析。[结果]通过特异性扩增以及测序结果表明sgRNA准确地连入载体,插入序列无突变,与预期序列高度一致,重组子阳性率为100%。[结论]成功构建了雪兔Corin基因敲除载体,为进一步利用CRISPR/Cas9技术进行雪兔Corin基因编辑工作提供了研究基础。     

CRISPR/Cas9技术特异杀伤癌细胞——癌症治疗新策略北大核心CSCD

CRISPR/Cas9技术,主要用于基因编辑。最近发现,CRISPR/Cas9技术亦可用于特异性杀伤癌细胞。天然状态下,CRISPR/Cas9系统存在于细菌,其功能是识别并切割入侵病毒或噬菌体的DNA,由此导致病毒或噬菌体死亡。因此,对于细菌来说,CRISPR/Cas9是一种＂基因剪刀＂或＂基因武器＂,是细菌重要的＂免疫系统＂。目前,CRISPR/Cas9系统一般用于对单基因或多基因的敲除或插入,以构建细胞或动物研究模型。     

CRISPR/Cas9技术特异杀伤癌细胞——癌症治疗新策略

<正>CRISPR/Cas9技术,主要用于基因编辑。最近发现,CRISPR/Cas9技术亦可用于特异性杀伤癌细胞。天然状态下,CRISPR/Cas9系统存在于细菌,其功能是识别并切割入侵病毒或噬菌体的DNA,由此导致病毒或噬菌体死亡。因此,对于细菌来说,CRISPR/Cas9是一种"基因剪刀"或"基因武器",是细菌重要的"免疫系统"。目前,CRISPR/Cas9系统一般用于对单基因或多基因的敲除或插入,以构建细胞或动物研究模型。     

基于CRISPR/Cas9系统对斑马鱼hoxb4基因的编辑及其突变体基因型的初筛

采用高效基因编辑系统CRISPR/Cas9构建hoxb4基因敲除斑马鱼模型,进行hoxb4基因功能的研究。根据hoxb4基因的一号外显子的正义链及反义链设计3个长20 bp的sg RNA,分别靶向ExonⅠ的192#位点,244#位点及313#位点。化学合成sg RNA的寡核苷酸序列,经过酶切克隆进p T7-g RNA质粒中,构建g RNA的体外转录载体并通过体外转录得到靶位点的g RNA。将质粒p SP6-2s NLS-sp Cas9线性化然后在体外转录得到Cas9的m RNA并进行加A尾,将以上靶位点的g RNA与Cas9的m RNA共注射入单细胞期的斑马鱼胚胎内,提取基因组DNA,PCR扩增出目的基因片段并使用T7EI酶切测效,最后将PCR产物连入p MD19-T simple载体中,挑取阳性克隆进行菌落PC R鉴定,然后经Sanger测序检测突变类型。结果显示,靶位点的sg RN A寡核苷酸双链成功连入p T7-g RNA质粒中且序列正确;其中靶向ExonⅠ的313#位点的sg RNA可成功编辑斑马鱼hoxb4基因,T7 EⅠ检测其敲除效率高达26.5%,并测序得到4种阳性突变型。通过CRISPR/Cas9系统成功编辑斑马鱼hoxb4基因并测序鉴定其突变类型,为HOXb4基因功能的研究提供了可靠的基因敲除方法。     

CRISPR/Cas9介导的疾病模型构建与基因修复研究进展

近年来,可编程核酸酶介导的基因编辑技术迅猛发展。CRISPR/Cas9技术源于细菌和古生菌的适应性免疫系统,主要由Cas9内切酶和向导RNA（guide RNA,gRNA）组成。Cas9内切酶在gRNA的指导下造成DNA的双链断裂,从而使研究人员能够精准高效地操纵特定基因组位点。同时,该系统可以揭示基因在疾病进程中所扮演的未知角色,在临床治疗中有应用潜能。现总结了CRISPR/Cas9技术在疾病模型构建与基因修复领域应用的研究进展。     

CRISPR/Cas9切割痘病毒DNA抑制病毒复制

当前,CRISPR/Cas9系统靶向痘苗病毒的相关研究鲜有报道。该文采用了CRISPR/Cas9基因组定点编辑技术,以痘病毒为研究对象。在重组痘病毒WR-EGFP中针对EGFP基因序列设计不同靶点g RNAs,转染Cas9/g RNA质粒,同时感染WR-EGFP痘病毒,随后观察EGFP荧光表达、提取病毒基因组,通过PCR进行切口鉴定并运用错配酶切法验证CRISPR/Cas9对痘病毒靶点DNA切割的切口修复情况。与单独感染WR-EGFP组相比,转染了Cas9/g RNA174和Cas9/g RNA175质粒的EGFP荧光强度明显降低,表明CRISPR/Cas9抑制WR-EGFP病毒中EGFP基因的表达。相对定量PCR及错配酶切实验结果显示,CRISPR/Cas9切割靶点导致WR-EGFP病毒基因组产生了切口,并且存在DNA错配修复现象。最后,通过结晶紫染色法测定痘病毒的滴度,结果显示,经CRISPR/Cas9处理组的痘病毒滴度显著下降,即CRISPR/Cas9能够使痘病毒的复制能力显著地降低。综上所述,CRISPR/Cas9切割痘病毒基因组DNA并且抑制痘病毒复制。     

快速构建CRISPR/Cas9基因组靶向编辑系统

CRISPR/Cas9核酸酶作为一种新的基因组靶向编辑技术,已成功应用于多种动植物基因组修饰研究. CRISPR/Cas9作用后的阳性细胞筛选和富集是该技术的关键之一. 本研究以鸡EAV-HP（endogenous avian retrovirus-HP）基因和MSTN（myostatin）基因为例,从靶位点的选择、表达载体构建、双基因报告载体构建和核酸酶活性验证4个方面,系统研究了CRISPR/Cas9核酸酶技术平台. 结果表明,利用寡聚核苷酸直接退火方法,构建表达载体和报告载体的阳性率分别高达100%和89.5%. 报告载体的PuroR（puromycin resistant gene）和eGFP（enhanced green fluorescent protein）基因的成功表达表明,构建的CRISPR/Cas9系统能有效切割靶序列,并用于后续阳性克隆的筛选和富集. 本方法摒弃了传统分子克隆的PCR扩增和酶切处理目标基因的方法,而是利用寡聚核苷酸直接退火获得含有黏性末端的目标DNA,简化了载体构建过程,低成本且快速获得CRISPR/Cas9基因组靶向编辑系统.     

人核糖核酸酶抑制因子基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建含有人核糖核酸酶抑制因子（hRI）基因的重组腺病毒载体。方法以含有全长cDNA的pT7-RI为模板,PCR扩增hRI,经T载体克隆后,酶切亚克隆到穿梭质粒pAdTrack—CMV上,在BJ5183细菌内和pAdEasy-1同源重组。筛选阳性克隆,酶切、PCR及测序鉴定,线性化后脂质体法转染293细胞进行包装、扩增。通过观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。结果酶切鉴定及PCR结果证明hRI基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度为1．5×10^10 pfu/ml。结论应用细菌内同源重组法成功构建了含hRI基因的重组腺病毒载体。     

CRISPR/Cas9系统敲除TET2基因对HepG2细胞增殖和凋亡的影响

为了进一步探讨TET2蛋白在肝癌的发生发展过程中发挥的生物学功能,本研究使用CRISPR在线设计工具(http://crispr.mit.edu/),针对TET2的外显子设计g RNA,构建靶向TET2基因的CRISPR/Cas9基因敲除质粒,转染HepG2细胞。T7E1酶切检测TET2基因的编辑效率,Western blotting检测TET2蛋白表达水平;MTT法、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒分别检测HepG2细胞的增殖活性及凋亡水平的改变。T7EI酶切分析显示敲除效率为31.4%;TET2基因表达量的降低抑制了HepG2细胞的增殖,促进了细胞的凋亡。CRISPR/Cas9质粒系统能够在细胞水平对TET2基因进行编辑,靶向TET2基因的CRISPR/Cas9质粒系统降低了TET2的表达、抑制HepG2细胞的增殖、促进HepG2细胞的凋亡。本研究表明CRISPR/Cas9技术为研究TET2的功能和作用机制提供了有效工具,为研究TET2蛋白在肝癌的发生发展过程中发挥的生物学功能提供实验依据。     

基于CRISPR/Cas9系统的人成神经瘤SK-N-SH细胞CAPNS1基因的靶向敲除

利用CRISPR/Cas9技术靶向构建CAPNS1基因敲除人成神经瘤细胞SK-N-SH细胞系。在NCBI数据库查找人CAPNS1基因,获得该基因CDS区,根据CRISPR/Cas9敲除靶位点设计原则即g RNA设计原则,设计3条sg RNAs,以p GK1.1为载体,构建人CAPNS1基因敲除载体,并运用共转染的方法转染到SK-N-SH细胞,构建CAPNS1基因敲除SK-N-SH细胞系。结果发现,菌落PCR筛选均能扩增出100 bp大小的片段,单克隆为阳性,DNA测序显示sg RNA序列正确插入质粒,序列比对结果正确;质粒转染SK-N-SH细胞后,制备单克隆,CruiserTMEnzyme酶切后疑似为阳性克隆,进一步的单克隆测序结果显示CAPNS1基因敲除SK-N-SH细胞系构建成功;此外,在CAPNS1-/-组,CAPNS1蛋白及calpain1和calpain2蛋白水平明显降低。以上结果表明CAPNS1基因敲除SK-N-SH细胞系构建成功。     

CRISPR/Cas基因组编辑技术及其在神经退行性疾病中的应用研究进展

CRISPR/Cas系统实质上是一系列由RNA引导的核酸内切酶,其存在于约40%的细菌和90%的古细菌中,是细菌或古细菌为抵抗病毒或质粒而演化出的一种获得性免疫,主要作用是沉默入侵的外源核酸。近年来,CRISPR/Cas系统凭借其简单、高效且可编辑的靶向基因修饰能力,开启了基因编辑的新纪元。神经退行性疾病一直是困扰人类的重大疾病,而CRISPR/Cas系统的出现为治疗神经退行性疾病提供了新的思路和方法,现介绍CRISPR/Cas系统基因编辑的机制及其在神经退行性疾病中的应用。     

缺口酶Cas9 D10A和Cas9 H840A在大肠杆菌基因组编辑中的应用

目前Ⅱ型CRISPR/Cas9工具被广泛应用于基因组编辑中,利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对大肠杆菌(Escherichia coli)基因组进行编辑,可应用于代谢工程及细菌耐药性等研究领域中。利用单缺口核酸酶Cas9 nickase (Cas9n)工具对宿主细胞基因进行修饰,可降低由于双链断裂对宿主带来的毒性。但目前利用CRISPR/Cas9n对大肠杆菌基因组编辑的研究较少,不利于缺口酶Cas9 D10A和Cas9 H840A在大肠杆菌基因组编辑的应用。本研究在前人报道的细菌双质粒Cas9基因编辑系统(pCas/pTarget)基础上,通过分子突变的方法构建缺口酶Cas9突变体质粒pCas-D10A和pCas-H840A,以及携带修复模板或无修复模板的靶向大肠杆菌sseA基因的质粒pTargetT-△sseA(993 bp)和pTargetT-△sseA,系统研究了两种缺口酶编辑大肠杆菌内源性基因sseA的有效性和效率。在稳定表达pCas质粒的MG1655菌株中转入携带修复模板的pTargetT-△sseA(993 bp)质粒,通过菌落PCR及DNA测序方法验证基因编辑的有...     

鼠伤寒沙门菌spvBC基因编辑株的构建

利用λRed重组系统和pBAD原核表达载体构建鼠伤寒沙门菌spvBC质粒毒力基因修饰菌株,为深入探究沙门菌毒力基因spv的功能和致病机制及宿主抗感染免疫提供工具菌。以pKD4为模板,PCR扩增含spvBC同源臂的卡那霉素抗性基因以构建同源打靶片段,再将其电转入含有质粒pKD46的鼠伤寒沙门菌中进行同源重组,随后将质粒pCP20电转导入阳性转化子,消除卡那霉素抗性基因,PCR鉴定敲除株的构建。PCR扩增含酶切位点的spvBC基因片段,扩增产物与原核表达载体pBAD/gⅢ分别双酶切后连接构建pBAD-spvBC重组质粒,PCR筛选阳性菌落并测序鉴定。将构建成功的pBAD-spvBC重组质粒电转导入spvBC敲除株中,Western blot测定不同浓度L-阿拉伯糖诱导SpvB和SpvC蛋白表达情况。PCR结果表明鼠伤寒沙门菌spvBC基因敲除成功;PCR及测序结果表明pBAD-spvBC重组质粒构建成功,Western blot结果表明13 mmol/L L-阿拉伯糖可诱导SpvB和SpvC蛋白正常表达。λRed重组系统可用于沙门菌质粒上大片段基因的敲除,pBAD原核表达载体可用于沙门菌质粒上大片段基因的回补,丰富了细菌质粒的基因修饰和编辑策略。     

体外验证SSA报告载体系统对CRISPR/Cas9的切割效率

目的根据单链退火(single strand annealing, SSA)修复途径原理,构建萤火虫荧光素酶荧光报告基因系统,体外检测SSA报告载体对CRISPR/Cas9的切割效率及gRNA的特异性和剪切活性。方法基于SSA修复DNA双链断裂损伤需要断裂末端包含一段同源重复序列的原理,构建4个萤火虫萤光素酶luciferase基因报告质粒,其中luciferase基因被分成前后两个片段;PCR先扩增luciferase基因319～1 653 bp片段并连接至巨细胞病毒(cytomegalovirus, CMV)启动子表达质粒,随后再分别连接luciferase基因不同长度前段序列,分别为1～579 bp、1～858 bp、1～1 188 bp和1～1 317 bp,每个片段中均含有一段重复序列,并且被终止密码子提前终止为无活性的luciferase基因;设计了261、540、870和900 bp等4个同源臂,将特异性的gRNA连入两段序列中,并加入有活性的Cas9/gRNA,通过检测荧光活性来检测gRNA的特异性和剪切活性。结果成功构建了4个荧光报告质粒pLuc-N1-1～4;用海参荧光素酶作为内参,在293T细胞转染4个荧光报告质粒,在24 h时检测4个质粒的相对荧光强度,均无荧光活性物质产生;在荧光报告质粒中加入特异性的靶点序列,并表达Cas9/gRNA,这些报告基因具有显著荧光强度升高(P0.000 1),且不受同源臂长度影响。结论成功构建的基于luciferase基因的SSA报告系统,可提供一种简单而快速方法来评估和比较gRNA在CRISPR/Cas9系统引入的indel突变诱导效率,为选择最有效gRNA减少不确定性,大大扩展CRISPR/Cas9介导的模式动物基因工程的实际应用提供可能性。     

人乳头瘤病毒16型和11型L1基因双价重组杆状病毒转移质粒的构建及鉴定

目的：构建人乳头瘤病毒16型与11型L1基因双价重组杆状病毒转移质粒并对其进行鉴定。方法：采用：PCR法从尖锐湿疣组织标本中扩增人乳头瘤病毒11型晚期基因L1,并对其进行克隆测序;利用基因重组技术将人乳头瘤病毒16型和11型L1晚期基因共同装入杆状病毒转移载体中,分别位于强启动子Ppolh和弱启动子P10之下;利用酶切和PCR技术对双价重组杆状病毒转移质粒进行鉴定。结果：PCR扩增法获得尖税湿疣组织中感染的人乳头瘤病毒11型的L1基因,得到人乳头瘤病毒16型L1和11型L1基因双价重组杆状病毒转移质粒,经酶切电泳鉴定验证重组成功。结论：本研究成功构建了双价重组杆状病毒转移质粒,为进一步构建双价L1蛋白表达系统进而建立双价基因工程亚单位疫苗打下基础。     

CRISPR/Cas基因编辑系统在原核微生物细胞工厂构建中的开发与应用

随着能源和环境问题的日益突出,化学品以及燃料的合成方式正逐渐由传统的化学法合成转变为以细菌为基础的生物炼制过程,其中最关键问题是需要开发出合适的基因工程工具用于构建相应的产品生产菌株。成簇的规律间隔短回文重复序列(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromic repeats,CRISPR)/CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated proteins,Cas)系统是一种存在于细菌和古细菌中的免疫系统,能够用于抵御病毒和外源质粒的入侵,近年来被开发成为一种高效、便捷、精确的基因编辑工具,显示出巨大的应用潜力。本文立足于CRISPR/Cas系统的原理与最新分类,结合实例综述了CRISPR/Cas基因编辑系统在原核微生物细胞工厂构建中的建立与优化策略,以及主要的应用方向,并探讨该系统所面临的主要问题并提出了一些可行的解决方案。     

CRISPR/Cas系统抵抗人类病毒感染的研究进展

CRISPR/Cas系统是细菌抵抗噬菌体感染的一种机制,细菌利用小RNA分子作为引导序列,引导核酸内切酶对噬菌体基因组进行序列特异性的剪切。利用这一特点,CRISPR/Cas已被改造并广泛用于人类细胞的基因编辑。近年来,CRISPR/Cas系统在抵抗人类病毒感染中的应用潜力备受关注。CRISPR/Cas系统可直接剪切病毒基因组,或编辑对病毒复制高度依赖的宿主因子。此外CRISPR/Cas系统还被开发为高度敏感的病毒检测工具。本文就CRISPR在抵抗人类病毒感染方面的研究进展进行综述。     

应用CRISPR/Cas9技术建立IGF-ⅡR基因定点整合的SKBR3细胞系

目的:采用CRISPR/Cas9系统建立胰岛素样生长因子受体2(IGF-ⅡR)基因定点整合的SKBR3细胞系,为探究IGF-ⅡR对人表皮生长因子受体2(HER-2)阳性乳腺癌细胞曲妥珠单抗耐药性的影响机制提供细胞模型。方法:根据AAVS1基因序列设计并合成6对小向导RNA(sgRNA),用UCA CRISPR/Cas9快速构建及活性检测试剂盒分别与pCS载体连接,筛选效率最高的sgRNA构建Cas9/sgRNA表达载体;用Asi SⅠ+Bstz17Ⅰ酶切将IGF-ⅡR片段连入hAAVS1-KI载体,构建IGF-ⅡR打靶载体,Eco RⅠ+ScaⅠ、NcoⅠ、BglⅡ酶切鉴定并测序验证;将Cas9/sgRNA载体和IGF-ⅡR打靶载体电转SKBR3细胞,经嘌呤霉素筛选,PCR鉴定,获得IGF-ⅡR基因定点整合的混合克隆细胞系;采用半固体及有限稀释方式制备单克隆。结果:构建了作用于AAVS1位点靶序列的Cas9/sgRNA载体,sgRNA活性检测显示sgRNA2具有最高效率;构建了作用于AAVS1位点靶序列的Cas9/sgRNA载体,sgRNA活性检测显示sgRNA2较sgRNA1、sgRNA3-6优势显著,具有最高效率;酶切鉴定并测序确认IGF-ⅡR打靶载体构建成功;电转染最佳条件为1200 V、20 ms、2个脉冲;嘌呤霉素最佳筛选浓度为0.5μg/mL;IGF-ⅡR打靶载体及pCS-sgRNA2质粒成功转染HER-2阳性乳腺癌细胞SKBR3,PCR鉴定及测序验证混合克隆片段基因型正确。结论:获得IGF-ⅡR基因在AAVS1位点定点整合的混合克隆细胞系,为进一步探究IGF-ⅡR对HER-2阳性乳腺癌细胞曲妥珠单抗耐药性影响的机制奠定了基础。     

CRISPR/Cas12a系统：核酸检测的多功能工具

规律成簇的间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）是原核生物的适应性免疫系统,对抗外来遗传物质（如质粒和噬菌体）的攻击。近年来,科学家们发现了一种新型基因编辑工具,一种强大的分子剪刀CRISPR/Cas12a系统,该系统在对靶标DNA进行切割的同时还具有对体系内单链DNA进行任意切割的活性,并将其转移到体外检测系统。本文对CRISPR/Cas12a系统组成、结构、Cas12a与Cas9的对比和CRISPR/Cas12a系统在核酸检测中的应用进行了综述。