山杏苹果酸酶基因的克隆与生物信息学分析

三羧酸转运体系(柠檬酸,苹果酸和丙酮酸)可为脂肪酸生物合成提供原料乙酰辅酶A与还原力NADPH;而苹果酸酶可催化苹果酸发生氧化脱羧而产生NADPH,是调控脂肪酸代谢的重要酶。山杏种子脂肪酸含量丰富、产油率高,是研究植物油脂代谢的良好材料。本研究以山杏为试材,采用RACE克隆和电子拼接相结合的方法,首次从山杏种子中克隆得到苹果酸酶基因(命名为SaME,GenBank上登记号为JX262381),该基因的cDNA编码区全长1923bp、编码640个氨基酸,预测其编码蛋白分子量为70.15kD、等电点为6.38;同时,运用生物信息学方法对SaME基因编码蛋白的理化特性、结构域和亚细胞定位等方面进行预测分析,结果显示,该蛋白定位在细胞的质体膜上,具有苹果酸酶活性,属于NADP-ME超家族。本文对山杏SaME基因的克隆与分析,为进一步探究苹果酸酶对油脂代谢的调控机制奠定了基础。     

可溶性CD14基因克隆及序列分析

针对人可溶性CD14(sCD14）的cDNA序列设计引物,通过反转录PCR技术,从U937细胞中,扩增出编码人可溶性CD14的基因序列,并将其克隆至质粒pGEM－T中,通过PCR、酶切及序列测定鉴定重组载体。结果表明获得了人可溶性CD14基因片段,为下一步进行CD14表达及生物学活性研究奠定了基础。     

梭梭甜菜碱醛脱氢酶基因克隆及序列分析

采用RT-PCR、RACE等方法从超旱生、耐盐植物梭梭(Haloxylon ammodendron)中扩增出BADH基因的cDNA序列(命名为HaBADH),其开放阅读框为1 503 bp,推测的氨基酸序列全长为500个氨基酸残基,并含有醛脱氢酶所具有的高度保守的十肽(VTLELGGKSP)以及与酶功能有关的半胱氨酸残基(C).其核苷酸序列与藜科几种盐生植物如盐爪爪(Kalidium foliatum)、中亚滨藜(Atriplex centralasiatica)、三角叶滨藜(Atriplex triangularis)、菠菜(Spinacia oleracea)、山菠菜(Atriplex hortensis)和甜菜(Beta vulgaris)等的相似性均在85%以上,推导编码蛋白的氨基酸序列一致性均在87%以上,表明BADH基因在藜科植物中是一种比较保守的基因.研究结果为进一步从分子水平探明梭梭的抗旱、耐盐机制,挖掘并利用植物抗逆基因奠定基础.     

建兰花叶病毒运动蛋白基因克隆及序列分析

从建兰花叶病毒（CyMV）石斛兰分离物中提取病毒RNA,用反转录——聚合酶链式反应(RT-PCR)方法获得约500bp的运动蛋白基因片断,插入pGEM-T载体克隆并测序。序列分析表明,该基因片断由474个核苷酸组成,和CyMV美国夏威夷分离物、新加坡分离物相应基因核甘酸序列分别具有97.8%同源性;根据核酸序列推导该片断含有3个部分重叠的开放阅读框架（ORF）,分别编码14kD、12kD和10kD的多肽。     

建兰花叶病毒运动蛋白基因克隆及序列分析

从建兰花叶病毒 (CyMV)石斛兰分离物中提取病毒RNA ,用反转录———聚合酶链式反应 (RT PCR)方法获得约 5 0 0bp的运动蛋白基因片断 ,插入 pGEM T载体克隆并测序。序列分析表明 ,该基因片断由 474个核苷酸组成 ,和CyMV美国夏威夷分离物、新加坡分离物相应基因核甘酸序列分别具有 97.8%同源性 ;根据核酸序列推导该片断含有 3个部分重叠的开放阅读框架 (ORF) ,分别编码 14kD、12kD和 10kD的多肽     

山羊β酪蛋白基因克隆及序列分析

用LongPCR技术克隆山羊 β酪蛋白 (CSN2 )全基因 13.7kb的序列 (GenBank登录号 :AF4 0 90 96 ) .利用PCR RFLP方法鉴定第 14和 192位氨基酸残基相应的核苷酸序列中出现的 2个多态性位点 ,其中第 192位氨基酸残基处的TspRⅠ位点是Saanen奶山羊CSN2基因中新发现的 1个多态性位点 .生物信息学方法分析山羊CSN2基因可见 ,非编码区中的SINE和LINE序列内含多种乳蛋白基因表达调控元件 ,对其基因的顺式表达和转录后调控可能具有重要的作用     

甜瓜鲨烯合酶基因克隆及酶分子结构分析

葫芦素类是主要分布于葫芦科植物中具有多种医药活性的四环三萜类化合物,目前药用葫芦素原料主要从甜瓜蒂中提取。该研究从甜瓜中克隆葫芦素类合成关键酶——鲨烯合酶(SQS)的基因,并对其序列进行了生物信息学分析。结果表明:DNA测序和BLASTRefSeqGene分析表明,克隆的甜瓜SQS基因片段具有完整的该酶基因开放阅读框架(ORF)序列。ORF分析显示,甜瓜SQS由417氨基酸残基构成,等电点为7.56。对推衍的甜瓜SQS氨基酸序列分析结果提示,该酶二级结构以α螺旋为主。结构域预测结果表明,SQS属于异戊二烯合酶家族,具有法呢酰基二磷酸及镁离子的结合位点。三级结构预测提示,甜瓜SQS为单体酶,其活性中心主要由几个α螺旋围绕形成的穴状结构。磷酸化位点分析显示,S~(48)处于酶活性中心相关~(47)VSRSF~(52)的模体中,而S~(196)是正选择位点,提示这两处磷酸化位点可能是甜瓜SQS酶活性调节的关键部位。以甜瓜SQS基因ORF序列构建系统发生树的系统发生分类结果与形态学分类结果一致。该研究结果为葫芦素类的生物合成调控研究提供了新的线索和实验依据。     

葡萄PRC1-like核心组分基因克隆及序列分析

克隆葡萄PRC1-like核心组分基因并预测其功能。在NCBI中分别查找与拟南芥PRC1核心组分基因同源性最高的葡萄序列,采用CTAB法提取葡萄品种‘赤霞珠’(Cabernet sauvignon)嫩叶中总RNA,运用RT-PCR技术进行克隆,得到葡萄PRC1-like核心组分基因的CDS序列,并通过各种在线软件对葡萄PRC1-like核心组分基因及其编码的蛋白质进行生物信息学分析。获得4个葡萄PRC1-like核心基因,这些基因CDS全长分别为1 614 bp、1 362 bp、1 293 bp和1 275 bp,分别编码568个、453个、430个和424个氨基酸,预测其蛋白质的相对分子量分别为64.17 kD、50.69 kD、47.99 kD和47.71 kD,推测这些蛋白均为亲水性不稳定蛋白,与已知拟南芥PRC1相应的核心蛋白具有高度的同源性,亚细胞定位预测结果表明这些蛋白主要存在于细胞核中。推测葡萄PRC1-like在葡萄发育中起着重要作用,这为进一步阐明葡萄PRC1-like的功能及作用机制提供了理论依据。     

白花柽柳质膜水孔蛋白基因克隆及序列分析

植物水孔蛋白在植物体内形成水选择性运输通道,在植物种子萌发、细胞伸长、气孔运动、受精等过程中调节水分的快速跨膜运输。有的水孔蛋白还在干旱胁迫应答中起重要作用。本文根据白花柽柳的PEG6000胁迫处理构建的SSH消减文库的水孔蛋白基因表达序列标签(EST),设计基因特异性引物进行5′RACE,克隆出一个1 043 bp的核苷酸序列。应用生物信息学软件进行分析,预测该序列编码287个氨基酸,具有6个跨膜区,有MIP家族信号序列SGXHXNPAVT,高等植物PIP高度保守序列GGGANXXXXGY和TGI/TNPARSL/FGAAI/VI/VF/YN,这是质膜水孔蛋白基因的典型的结构特征。经NCBI比对,与Arabidopsis thaliana (MIP-C),同源性达到95%,预测该蛋白的相对分子量是30.9KD,理论等电点是8.84。     

籽粒苋中PPDK基因的克隆及表达特性分析

为寻找能提高植物光合效率的基因资源,以高光效植物籽粒苋(Amaranthus hypochondriacus L.)为试材,利用同源克隆和RACE技术克隆了丙酮酸磷酸二激酶(Pyruvate orthophosphate dikinase, PPDK)基因,基因cDNA全长为3 224 bp,其中5′非翻译区为71 bp,阅读框为2 868 bp,3′非翻译区为285 bp,推导的蛋白质为956个氨基酸,分子量约106 kDa。序列分析表明,克隆的基因含有PPDK基因的功能结构域。表达模式分析显示克隆的PPDK基因在绿色组织中特异表达,为PPDK基因的长转录本,初步确定已克隆得到为籽粒苋中的PPDK基因,将其命名为AhPPDK。     

木瓜凝乳酶基因的克隆及序列分析

通过设计一对特异性的引物,采用RT－PCR方法从未成熟的木瓜组织中扩增得到木瓜凝乳酶基因,并将其重组到pPIC9K载体中,转化大肠杆菌并筛选阳性克隆,序列测定并利用BLAST软件进行核酸及氨基酸序列相似性分析,结果表明：通过序列组成及特征结构分析,扩增得到的基因为木瓜凝乳酶基因。     

苋菜凝集素基因的克隆及在转基因烟草中抗蚜性研究

通过ＰＣＲ从苋属植物千穗谷（Ａmaranthus hypochondriacus)的总ＤＮＡ中扩增出苋菜凝集素（ＡＨＡ）的核基因片段。序列分析结果表明该基因为２４５３bp,含有－１５３８bp的内含子和两个分别为２１２bp和７０３bp的外显子。采取反向ＰＣＲ的方法获得仅含该基因的编码区克隆。以此为基础与二元表达载体pBin438构建含内含子与不含内含子ＡＨＡ基因的植物表达载体pBAHAg和pBAHAc并通过土壤农杆菌介导转了化烟草,转化再生植株的ＰＣＲ和Southern blot分析表明,ＡＨＡ基因已整合到烟草的染色体中,有单贝和多拷贝的整合。用与ＡＨＡ蛋白高度同源的ＡＣＡ蛋白的抗血清进行了免疫斑点（Immunodot blot)检测,结果初步表明转基因烟草有ＡＨＡ蛋白的表达,虫试结果表明转pBAHAg和pBAHAc烟草对蚜虫的平均抑制率分别达５７．２％和４８．８％,有的高达９０％以上,含内含子和不含内含子的ＡＨＡ基因在转基因植株中的抗蚜性不同。     

The isolation and characterisation of a mutant of the C4 plant Amaranthus edulis deficient in NAD-malic enzyme activity

A mutant of Amaranthus edulis (Speg.) lacking activity of the C₄ leaf form of NAD-malic enzyme (ME; EC 1.1.1.39) has been isolated. Homozygous mutant (5% wild-type ME activity) and heterozygous (50% wild-type ME activity) F₂ plants were shown to contain both the α and β NAD-ME subunits in similar amounts to those detected in the wild-type leaves. The rate of photosynthetic CO₂ assimilation was reduced in the homozygous mutant to 5% of that observed for the wild-type leaves. Other C₄ enzymes were not down-regulated in the mutant plants. There was little difference in photosynthetic rate of the heterozygous plants compared to the wild-type, suggesting that NAD-ME exerts little control over the rate of C₄ photosynthesis, and that in the wild-type the enzyme has a very low control coefficient. The activity loss in the heterozygote may therefore be compensated by regulatory mechanisms that increase the activity of the enzyme in vivo. Data for bundle-sheath strands indicated that although the homozygous mutants were able to oxidise malate via the Krebs cycle, they were unable to convert malate to pyruvate and alanine via NAD-ME. Received: 2 April 1998 / Accepted: 7 May 1998     

羊驼催乳素基因cDNA克隆及序列分析

实验通过克隆分析羊驼催乳素基因的部分序列,对羊驼催乳素基因的结构和功能进行初步探索和揭示。从GeneBank中已报到的脊椎动物催乳素基因保守区设计一对引物,采用Trizol法提取羊驼胎盘总RNA,利用RT-PCR技术扩增出长度约为510 bp的片断。测序后在NCB I工作平台中进行BLASTn同源性比较,得出结论:羊驼催乳素基因与已登录的哺乳动物催乳素基因同源性均超过85%,最高达97%。借助DNAstar分子生物学分析软件绘制了相关动物的遗传进化图,并对羊驼的种属地位进行了进一步验证。。     

粘质沙雷氏菌几丁质酶chiB基因的克隆与序列分析

采用改进的方法提取粘质沙雷氏菌基因组DNA,通过PCR扩增,得到大小为1 500 bp特异性DNA片段(chiB基因),以pUC18质粒构建了pUC-ch iB克隆载体,转化至感受态细胞E.coliDH5α培养,并筛选出重组质粒。经测序分析,证明克隆片段与文献报道相一致。     

橡胶草HMGR基因的克隆及表达分析

通过比较9种植物的9条甲羟戊酸途径关键酶3-羟基-3甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（HMGR）氨基酸同源区域,设计简并引物,利用RT-PCR和RACE技术首次从橡胶草（Taraxacum kok-saghyz）中克隆了一个HMGR基因,命名为TKHMGR。通过氨基酸序列同源性比对与系统进化分析表明,TKHMGR属于HMGR基因家族的新成员。同时,利用荧光定量方法分析了该基因在不同组织的表达情况。     

蚯蚓纤溶酶基因的克隆与序列分析

目的:获取蚯蚓纤溶酶(EFE)的基因,并对其进行序列分析。方法:从赤子爱胜蚓中提取总RNA,然后利用RT-PCR技术扩增EFE的基因,并将其插入pUCm-T载体,经PCR和酶切鉴定后进行序列测定及分析。结果:DNA序列分析表明,所克隆的EFE基因全长为738bp,其中编码区段为735bp,共编码245个氨基酸残基,成熟肽为238个氨基酸残基。与GenBank中已报道的粉正蚓的EFE序列F-Ⅲ-2的同源性最高,两者在核苷酸序列上有2处不同,即第137位(T→C)和第632位(G→T),密码子也因而分别由GTC、GGT变为GCC、GTT,导致第46位、211位的氨基酸残基分别由缬氨酸、甘氨酸变为丙氨酸和缬氨酸。结论:从赤子爱胜蚓中成功克隆了1条EFE基因F245。序列测定及同源性分析表明,蚯蚓纤溶酶F245与已报道的多条EFE基因序列具有高度同源性,且具备完整的编码区。该序列的克隆为用基因工程的方法生产单一成分的高酶活性EFE奠定了基础。