同源异形盒基因和肿瘤

最近,美国哈佛药学院的Ｆｏｒｄ发现同源异形盒(ｈｏｍｅｏｂｏｘ)基因在细胞周期、发育以及癌症发展中起着重要的链接作用[1]同源异形盒基因是与细胞正常分化、发育相关的转录因子,最初作为果蝇同源异形突变中的重要座位而得名。此后,陆续有170多个同源异形盒基因在各类物种中被发现。同源异形盒基因的共同点是具有183个核苷酸长度的同源区,编码61个氨基酸。同源异形盒基因同源区表达蛋白通过其ＤＮＡ结合活性及其下游基因转录活性发挥作用。Ｌａｗｒｅｎｃｅ等[2]推测哺乳动物同源异形盒表达蛋白的作用目标为编码细胞外层蛋白质的基因,粘…     

发育调控基因的多次性表达和作用

在遗传学家、分子生物学家与胚胎学家携起手来,共同研究发育生物学的基本问题后,人们对于发育的遗传控制的认识有了长足的进步。80年代在果蝇(Drosophila melanogaster)中取得的一系列进展,如控制前后体节形成的一套完整基因系统的发现,同源异形突变(如双胸突变)基因的克隆,同源盒基因被证实在从线虫到人类的发育控制中均起重要作用,等等,使人们对于发育过程的基因控制有了这样的认识轮廓:每一种具体的发育过程主要     

同源异形盒基因是造血细胞分化的一种潜在性调节因子

同源异形盒(homeobox)基因是最先在果蝇中发现的一段长约180碱基对的DNA片段,这些基因影响果蝇的早期发育,并能编码出高度保守的DNA结合区域。近来,在一些脊椎动物中亦分离到同源异形盒基因,这些基因在脊椎动物中的胚胎期表达形式类似于果蝇。因此,一些脊椎动物同源异形盒基因可能控制早期发育,并且可能在成年分化过程中起重要作用。T、B淋巴细胞等血液细胞是从造血干细胞分化来的。实验结果表明,同源异形盒基因可能参与造血细胞分化的控制。     

同源异形域结构及对DNA的识别

同源异形域蛋白是真核生物中一类重要的转录因子.根据同源盒基因及其同源异形域产物的肤链结构可以分为多种家族.文章综述了同源异形域与DNA结合的一般特点.并叙述了Antp、POU等重要类型的转录因子如何识别DNA位点、HTH及其他蛋白质在识别中如何起作用.     

鱼腥藻PCC7120基因组中一个影响异形胞发育和图式形成的新区域

以Tn5 10 87b诱变鱼腥藻PCC712 0 ,筛选不能利用氮气生长、异形胞图式发生变化的突变株。突变株 # 180 1经缺氮诱导 2 4h后无异形胞形成 ,48h后沿藻丝形成少量成熟异形胞 ,占藻细胞总数比例为 2 .8% ,其异形胞发育速度和形成频率均与野生型有显著区别。以ClaⅠ酶切该突变株总DNA、自环化后以电泳冲法转化大肠杆菌 ,回收带有插入位点两侧DNA片段的转座子Tn5 10 87b。经测序确定转座子位于未知功能基因alr0 0 99第 14 8和 14 9碱基之间。为证明突变性状确由alr0 0 99内的插入突变引起而不是由于其他二次突变 ,通过同源双交换将含新霉素抗性基因的C .K2片段定向插入基因组中alr0 0 99的EcoRV位点 ,获得重构的鱼腥藻突变株DR2 14 ,其表型与原突变株 # 180 1相同。以上结果表明alr0 0 99或其下游基因是鱼腥藻PCC712 0基因组中与异形胞发育和图式形成相关的一个新区域。     

同源异形盒基因及其在昆虫幼虫腹足发育生物学研究中的应用

同源异形盒基因(homeobox genes)是一类具有180 bp保守序列的基因,在生物发育的调控中起着重要作用。昆虫幼虫的腹足在位置和数目上均表现出丰富的多样性,使其成为进化发育生物学研究的主要对象之一。通过对昆虫幼虫腹足发育过程中相关同源异形盒基因的研究,既可了解腹足的发育机制,又可加深对同源异形盒基因进化和功能的理解。本文简要介绍同源异形盒基因的概况,重点总结了同源异形盒基因在昆虫幼虫腹足发育方面的研究进展,包括通过相关同源异形盒基因时空表达模式来揭示腹足的附肢起源、腹足发育的调控通路中相关同源异形盒基因的功能和进化等,尤其是腹部Hox家族基因对Distal-less基因的抑制作用及其在不同昆虫类群中的进化,以及该领域目前存在的主要争议,期望为相关研究提供参考。     

73例中国人血友病甲基因突变的分析

我们用Southern blotting、PCR、变性梯度凝胶电泳(DGGE)和DNA测序等方法对73例血友病甲患者(经上海瑞金医院测定血浆FVⅢ:C和vWF:Ag诊断,其中无亲缘关系患者65例,按FVⅢ:C水平分为轻、中、重三型。FVⅢ:C< 2%为重型,共47例;FVⅢ:C 2%-5%为中型,共9例;FVⅢ:C5%-25%为轻型,共1 7例)进行FVⅢ基因突变检测。共检出内含子22倒位23例,均为重型,约占重型的49%,与国外报道相似。余下50例(其中无亲缘关系者45)用PCR-DGG E分析所有外显子及其侧翼内含子序列,发现异常条带则进行DNA测序。在17例患者中检出突变13种,其中无义突变5种,均为重型;错义突变6种,除1例外都是轻中型;小缺失2例,都是重型;其中,AA466Lys(AAG)-Thr(ACG)、719Tyr(TAC)-Stop(TAG)、AA826 Asp(GAC)-Glu(GAA)、312Ile(ATC)-xxC及AA1551-1552del(AGAA)为新发现的突变。有亲缘关系的患者都有相同的基因突变,而在无亲缘关系患者未发现相同突变。基因突变与临床表现基本相符。 Abstract:We use Southern blotting,PCR,denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE)and DNA sequencing to detect gene mutations of haemophilia A in Chinese population.73 cases(47 severe)(FVIII:C<2%),9 moderate(FVIII:C 2%~5%),17 mild(FVIII:C 5%~25%)of haemophilia A were first screened with Southern blotting,23 were found to be the intron 22 inversion type,all being severe cases.The remaining 50 cases without intron 22 in version were examined with PCR-DGGE.Genomic DNA were amplified using GC-clamped primers covering all the exons and all flanking intron regions.Abnormal bands were sequenced.13 different mutations were identified,including 5 nonsense mutations,6 missense mutations and 2 small deletions.5 mutations,AA466Lys(AAG)-Thr(ACG),AA719Tyr(TAC)-Stop(TAG),AA826Asp(GAC)-Glu(GAA),AA312Ile(ATC)-xxC and AA1551-1552del(AGAA)have not been reported before.Generally the genetic defects correspond to the clinical conditions.     

南宁市HIV-1/AIDS人群治疗前pol区遗传特性及蛋白结构分析

为探讨南宁市某县艾滋病病毒1型(HIV-1)感染人群中治疗前pol区遗传特性及蛋白结构变化情况,本研究通过RT-PCR扩增pol区部分序列并进行测序,将序列同源比对构建系统进化树;分型确定毒株亚型和斯坦福大学HIV耐药性数据库比对,分析耐药相关位点;SWISS-MODEL蛋白质同源数据库进行建模分析氨基酸的突变对蛋白质结构和功能的影响。本研究在90份HIV-1标本中获得46个pol区有效序列,共发现4种亚型,其中CRF01_AE占76.08%(35/46)、CRF08_BC占15.22%(7/46)、CRF07_BC占(3/46)6.52%、CRF59_01B1占2.17%(1/46);46个序列中有4例(8.69%)出现耐药突变位点,没有针对核苷酸反转录酶抑制剂(NRTI)的耐药突变;针对蛋白酶类抑制剂(PIs)1例,PR蛋白酶的柔性部位I47V位点发生突变,β折叠结构的I84V位点发生突变,都是异亮氨酸突变为缬氨酸;针对非核苷酸反转录酶抑制剂(NNRTI)有3例,2例位于活性中心的Y181C位点由酪氨酸突变为半胱氨酸,1例位于转角处的E138G位点由谷氨酸突变为甘氨酸。研究表明,南宁市某县HIV-1病毒CRF01_AE重组亚型比例最大,未经抗病毒治疗HIV1感染者中已经出现pol区耐药突变株,突变位点主要位于活性中心及柔性部位,传播水平已经处于中等流行状态。深入分析蛋白质与抑制剂相互作用机制,有助于为艾滋病抗病毒及耐药性监测方案提供科学依据。     

定点突变提高木聚糖酶Umxyn10A的热稳定性

木聚糖酶是微生物半纤维素降解体系中的一种关键酶,被广泛地应用在工业中的多个领域。本研究为了提高木聚糖酶Umxyn10A (ABL73-883.1)的热稳定性,将Umxyn10A与GH 10家族4种耐热木聚糖酶进行多序列同源比对以及三维结构的同源建模分析,选定了Umxyn10A第31位氨基酸位点进行定点突变,将氨基酸Ala (A)突变为Phe (F)。分别将Umxyn10A和Umxyn10AA31F在大肠杆菌中进行重组表达,分析2种重组酶的酶学特性,结果发现,Umxyn10AA31F的最适反应温度为85℃,较野生重组酶提高了5℃;在65℃下的半衰期为105 min,较野生重组酶(15 min)提高了6倍;在70℃下突变重组酶的半衰期为15 min,较野生重组酶(5 min)提高了2倍;与此同时突变重组酶的pH耐受区间较原酶也有一定的增大。结果表明,将第31位氨基酸位点Ala突变为Phe能够显著的提高Umxyn10A的热稳定性。     

青枯雷尔氏菌胞外多糖合成缺失突变株构建及其生物学特性

【目的】由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的植物青枯病是一种毁灭性土传病害。胞外多糖(extracellular polysaccharides,EPS)是青枯雷尔氏菌关键的致病因子之一。通过构建胞外多糖缺失突变株,研究胞外多糖在青枯病致病中的作用。【方法】从青枯雷尔氏菌FJAT-91的基因组中克隆出胞外多糖合成结构基因epsD同源臂,克隆至自杀性质粒p K18mobsacB,再将庆大霉素抗性基因(Gm)插入同源臂中间,获得重组质粒p K18-epsD。将重组质粒转化至青枯雷尔氏菌FJAT-91感受态细胞中,通过同源重组敲除epsD基因,获得EPS合成缺失的突变株FJAT-91Δeps 。研究突变株与野生菌株在菌落形态、胞外多糖合成、运动能力、定殖能力的差异性。【结果】突变菌株FJAT-91ΔepsD与出发菌株FJAT-91相比:胞外多糖产量显著减少,生长较慢;泳动能力(swimming motility)和群集运动能力(swarming motility)显著降低;在番茄苗根部和茎部的定殖能力显著降低;弱化指数(AI)为0.905,鉴定为无致病力菌株。【结论】胞外多糖在青枯雷尔氏菌的致病中起着关键的作用,本课题研究成果为开发植物疫苗提供了优良的材料与研究基础。     

鱼腥蓝细菌PCC 7120游离DnaA的增加降低异形胞频率

研究在模式生物鱼腥蓝细菌Anabaena sp. PCC 7120中,以DnaA为研究对象,探究蓝细菌细胞周期中复制起始和异形胞分化之间的关系。结果显示:在有氮环境中, DnaA蛋白缺失或过表达并不影响细胞增殖和异形胞的分化。在缺氮环境下, DnaA缺失突变株Malr2009的异形胞分化频率(8.57%)与野生型(8.64%)间无显著差别,且该菌株增殖速率与野生型相比也无显著差异, DnaA蛋白缺失没有影响蓝细菌突变株(Malr2009)的异形胞分化频率和增殖速率。但DnaA蛋白过表达菌株Oalr2009的异形胞分化频率降低了20%,其在第12天A750约为1.2,细胞增殖速率快于野生型(第12天时A750约为0.9),增殖速率提高了30%。综上结果表明在鱼腥蓝细菌PCC 7120中,虽然DnaA不是细胞生长过程所必需的,但在缺氮条件下,游离DnaA增加会抑制异形胞分化频率。     

Leber遗传性视神经病变家系的线粒体基因突变分析

为探讨Leber遗传性视神经病变（Leber′s hereditary optic neuropathy,LHON）家系线粒体DNA（mtDNA）常见致病原发突变的频谱,用聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）和单链构象多态性（single-stranded conformational polymorphism,SSCP）以及DNA测序的方法,对13个家系22位临床诊断为LHON的患者及其母系亲属21人的线粒体DNA进行检测,同时检测71例正常人作为对照。临床拟诊为LHON的13个家系中,11个家系存在mtDNA位点11778 G→A突变,另2个家系存在14484位点T→C突变。说明中国LHON病人存在线粒体DNA 11778或14484位点突变,其中14484位点突变在国内尚未见报道。 Abstract:The purpose of the study is to investigate the frequency of common pathogenic primary mitochondrial DNA mutations in pedigrees of Leber′s hereditary optic neuropathy (LHON).Mutations were determined by polymerase chain reaction (PCR),single-stranded conformational polymorphism (SSCP) and DNA sequencing.Twenty-two patients with suspicion of LHON and twenty-one their maternal relatives underwent molecular genetic evaluation.Seventy-one normal individuals underwent molecular genetic evaluation as control at the same time.Members from 13 families with suspicion of LHON,11 families had nucleotide position nt11778 G→A mutations.Another 2 families had nt14484 T→C mutations.It is concluded that the point mutations at nucleotides 11778 and 14484 are primary LHON mutations,but the point mutation of nt14484 is rare in Chinese.     

异形胞分化蓝细菌dnaA温度敏感型突变体的构建

以能分化异形胞的蓝细菌(Anabaenasp.PCC7120)为材料,采用重组PCR在体外对控制DNA复制起始的dnaA基因进行定点突变后克隆到整合质粒中,再通过三亲本杂交将整合质粒转移到Anabaena PCC7120中,以分离和筛选温度敏感型突变体。结果成功获得Anabaena PCC 7120 dnaA高温敏感性突变体。研究表明,利用重组PCR技术可在体外实现对Anabaena PCC 7120的dnaA的定点突变,并可通过同源重组双交换成功实行整合质粒中突变基因对野生型基因的置换,使突变基因插入到细胞染色体中,进而成功构建温度敏感型突变菌株。     

圆瓣姜花花部维管束解剖及其系统学意义

用石蜡切片技术研究了圆瓣姜花(Hedychium forrestii Diels)的花部维管束系统解剖结构,探讨了同源异形的各轮花器官维管束来源和属性.结果表明,圆瓣姜花的2枚花瓣状结构为外轮雄蕊成员;唇瓣是三重结构,其中脉源十1枚外轮雄蕊维管束系统,两侧脉源于2枚内轮雄蕊维管束系统;上位腺体为隔膜蜜腺.本研究支持Thompson和Gregory关于姜科唇瓣是三重结构的观点;与其他姜科植物一样,圆瓣姜花子房延长部形成的上位腺体属于隔膜蜜腺而不是雄蕊成员.与已研究过的姜花属植物比较,姜花属花器官维管束系统的来源与走向是一致的,同源异形现象在姜花属植物花的进化中扮演极为重要的角色,可为解释花器官属性提供重要线索.     

Kit基因无义突变导致W-3Bao小鼠显性白斑形成

Kit(W)基因是一种原癌基因,在小鼠中该基因位于第5号染色体距着丝粒约42 cM处,其编码的蛋白质是具有酪氨酸激酶活性的干细胞生长因子受体,为酪氨酸激酶受体信号通路的跨膜分子。在人类及小鼠,kit及其配体kitl突变都可能引起不同程度的贫血、肥大细胞减少、毛色变白和生育能力下降或丧失等症状(Rajaraman et al.,2002;Broudy,1997;Rajaraman et al.,2003;Kapur et al.,1999),同源的kit基因突变在猪及禽类都表现为显性的白色斑点(邓素华等,2000)。在先前的研究中,本课题组通过ENU诱变获得6种白斑突变小鼠,通过连锁分析法以微卫星为连锁标…     

胞质异质性——人类肿瘤组织线粒体基因突变的普遍现象

为了探讨不同肿瘤组织中线粒体基因体细胞性突变的胞质异质性和同质性状态,利用32对重叠引物对149例肿瘤组织和匹配的正常组织的全线粒体基因进行PCR扩增,并同时进行时相温度梯度凝胶电泳扫描突变筛选,基因测序确定突变类型与异质状况。结果表明,不同肿瘤组织中线粒体基因体细胞性突变的异质率不同,口腔癌（65%）和食道癌（64%）具有较高的异质率,其次为乳腺癌（45.9%）。4种转换形式的发生频率Hm→Hm > Hm→Ht > Ht→Hm > Ht→Ht。碱基转换的主要转换形式为Hm→Hm,碱基颠换则以Hm→Ht。认为胞质异质性是人类肿瘤组织线粒体基因突变的普遍现象。Abstract: To explore the status of heteroplasmy and homoplasmy of Mitochondrial DNA somatic mutations in different tumors. DNA from 149 tumors and corresponding normal tissues were extracted and entire mitochondrial genome was amplified using 32 pairs of overlapping primers. The somatic mutations were screened by temporal temperature gradient gel electrophoresis and their heteroplasmic statute were identified by sequencing. The results showed that the incidence rate of heteroplasmy of mitochondrial DNA somatic mutations varies in different tumors. There is a high rate of heteroplasmic mutation in oral cancer (65%) and esophageal cancer (64%), followed by breast cancer (45%). The frequency of four transfer types is Hm (homoplasmy)→Hm (heteroplasmy) > Hm→Ht > Ht→Hm > Ht→Ht. The main transfer forms of transition and transversion mutations are Hm→Hm and Hm→Ht respectively. Heteroplasmy is a common phenomenon in mitochondrial DNA somatic mutations of human tumors.     

结核分枝杆菌同源重组基因敲除系统的构建和应用

【目的】结核分枝杆菌同源重组效率很低,突变株的构建需要半年之久。本研究的目的在于构建一种用于在结核分枝杆菌中进行基因快速敲除、且易于筛选的高效同源重组系统。【方法】野生型结核分枝杆菌转化含有SacB反向选择标记、且能诱导表达两种同源重组酶gp60和gp61的质粒pSL002。然后分别将靶基因的两个同源臂克隆入到含有hyg(潮霉素)抗性基因和gfp(绿色荧光蛋白)基因的重组质粒pSL001中,再将靶基因同源臂-loxP-hyg-gfp-loxP片段从pSL001切下,转化含有pSL002的野生型结核分枝杆菌,一步得到双交换突变株。再将含有SacB反向选择标记、且表达Cre重组酶的质粒pSL003转化入结核分枝杆菌双交换突变株中,切除两个loxP之间的hyg抗性基因和gfp基因,得到无痕缺失突变株。最后利用含有2%蔗糖的琼脂糖平板去除含有SacB反向选择标记的质粒pSL002和pSL003。【结果】在结核分枝杆菌中成功构建了高效同源重组系统,利用该系统构建了rv1364c、pstP跨膜区、pstP胞外区三个突变株,得到双交换突变株的效率为25%-62.5%,从双交换突变株得到无痕缺失突变株的效率为100%。通过gfp作为荧光标记基因,利用NightSea BlueStar蓝光手电筒和滤光眼镜,可以对平板上的基因缺失株直接进行快速判定。【结论】该同源重组系统利用gp60和gp61重组酶,在时间上将在结核分枝杆菌中无痕缺失突变株的构建从6个月缩短到3个月。这是目前为止在结核分枝杆菌中构建突变株最快且效率最高的方法,为加速分枝杆菌功能基因组的研究提供了新的遗传工具。     

同源异形基因浅说

同源异形基因是决定果蝇体节形成的发育基因,其同源异形盒子编码同源异形结构域蛋白,在进化上极为保守,从低等到高等动物的基因组中都有存在。其表达具严格的时、空特异性,可控制细胞的分化状态及表型,推测可能是通过对其他基因的调节而发挥作用。最近表明线虫及哺乳类细胞中的转录因子也具有同源异形蛋白,初步证明它们也是转录因子,这对解释同源异形蛋白的功能、探索基因表达的调节机制有重要意义。     

胚珠器官特征的决定

胚珠是花中重要的生殖器官。通过同源异形现象、同源异形突变体和同源异形基因研究的发展,介绍花器官特征决定的模型——ABC模型、ABCDE模型和四因子模型,以此说明胚珠在花器官中作为第5轮花器官的支持证据,同时简要介绍胚珠特征决定基因在模式植物拟南芥、矮牵牛和水稻中的研究概况。     

基于结构B因子分析指导的头孢菌素C酰化酶动力学稳定性改造

【目的】筛选Pseudomonas sp.SE83 acy Ⅱ定点饱和突变库,获得动力学稳定性提高的头孢菌素C(CPC)酰化酶突变体,并对突变酶进行初步的结构-功能关系分析。【方法】靶标酶Pseudomonas sp.SE83 acy Ⅱ与Pseudomonas diminuta N176具有较高的同源性,通过分析N176的结构B因子,构建CPC酰化酶SE83定点饱和突变库;基于pH指示剂显色法,采用Biomek FX~P自动工作站建立CPC酰化酶高通量筛选方法,获得优良突变酶,对其活性、稳定性等酶学性质进行表征;利用SWISS-MODEL对突变体进行同源建模,探讨突变体结构与功能的关系。【结果】通过B因子分析和同源结构比对,共找出9个靶标位点;经过3轮筛选,发现R218及K226位点突变显著提高酶的热稳定性,其中最显著的R218Q和K226V在40°C的半衰期分别为野生型的3.77和2.77倍,催化效率k_(cat)/K_m分别为野生型的1.8和3.1倍。同源建模分析表明氢键作用和疏水相互作用的增加可能是突变体稳定性提高的原因。【结论】B因子指导的酶分子改造是一种高效可靠的动力学稳定性改造策略,突变体R218Q和K226V均可提高CPC酰化酶的稳定性和催化效率,对进一步的CPC酰化酶分子改造具有一定的参考价值和指导意义。