线虫基因显微注射和整合技术——设备、操作与指南

秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)是研究动物遗传、个体发育和行为活动的重要模式生物,其主要优点是能够研究从分子细胞水平到整体系统水平的相关生命活动的作用机理．其中基因显微注射和整合是该领域的核心技术,广泛应用于研究线虫的基因表达、功能和基因间的相互作用等．显微注射技术使用尖端开口直径为微米级的玻璃微管,将所研究的目的DNA注射进线虫的性腺．注射的DNA被成熟的卵细胞吸收,以染色体外遗传物质的形式存在．但这种形式并不能稳定遗传,可采用基因整合技术将外源基因整合到染色体上,得到稳定遗传的线虫种系．显微注射是一项精细的实验技术,影响实验成功与否的因素较多,实际操作需要有一定的经验．在实践过程中逐步改进和完善了这项技术,在此主要介绍线虫显微注射技术的操作过程、创新方法以及注意细节．     

外源海岛棉DNA导致陆地棉性状的变异

近年来,将不同生物的具有已知遗传信息的DNA片段导入受体生物细胞内,并使之表达的研究正在方兴未艾。尽管有些人对这类工作的结果提出质疑,引起争论,可这几年来,许多用植物组织培养系统做的遗传转化研究工作相继表明,外源DNA片段可以通过转化的手段导入植物细胞内,部分片段似还可被受体细胞DNA整合乃至表达。 在我国,自1977年底起开展协作,用小麦、水稻、棉花等作为受体亲本,配成各种亲缘不同的组合,进行外源DNA片段的导入研究,初步获得了一些结果。本文报道了利用外源海岛棉DNA注射导入陆地棉后,在其子代中产生变异的情况。     

精子介导转基因动物的制备

近年来 ,通过显微注射DNA至孵育的卵母细胞原核或外源基因转染后的胚胎干细胞进行转基因动物的生产已取得了令人瞩目的成就。在过去的 1 0年中 ,以精子作载体制备转基因哺乳动物或脊椎动物也取得了一些不同程度的进展。这些技术主要包括 :直接将外源DNA与精子共孵育至成熟 ;提取分离的精子DNA或进行预处理至精子发育成熟 ;以及在辅助受精前分离精子细胞等。此外 ,一些显微注射技术 ,如在输精管内进行体内直接转染雄性生殖细胞 ;将体内转染的雄性生殖细胞植入已分离的雄性生殖细胞 ,再显微注射至受体的睾丸 ,这些技术也逐渐成熟起来。研究表明 ,通过体内、体外转染外源DNA的显微操作技术只需将雄性受体与野生型雌性交配就可产生出转基因的后代个体 ,同时也避免了辅助受精和胚胎操作带来的机械损伤 ,因此具有一定的优势。本文综述了精子介导转基因 (SMGT)技术的发展历程、研究现状及前沿进展。     

哺乳动物克隆的研究进展与应用前景

显微注射技术本身固有的缺点在很大程度上限制了转基因动物的研究及应用。近年来,体细胞基因打靶和体细胞克隆的最新研究进展表明,这两种技术相结合将成为制备大型转基因动物的有效途径。     

转基因动物研究现状

导言 1980年Gordon等人将疱疹病毒胸苷激酶基因和SV40早期基因启动子重组到质粒pBR322中,再由显微注射植入小鼠受精卵原核,获得第一只转基因小鼠。原理上任何克隆基因都能永久并入哺乳动物胚胎基因组。显微注射后,外源DNA整合进细胞,随后繁衍成种系。因此通过选育能永久建立携带一个或多个新基因的动物谱系。“转基因”(Transgenic)一词应运而生。在此之前,Jaenisch(1976)观察到逆转录病毒(又称逆病毒)感染小鼠胚胎,使单个前病毒DNA插入小鼠染色体DNA。而后含异源基因的重组感染性逆病毒系统的发展导致了用     

转基因动物及其在医学研究中的应用

转基因动物(transgenic animal)是指基因组中稳定地整合有以实验方法导入的外源DNA的动物。被导入的外源基因称为转基因(transgene)。1974年美国学者Jeanisch等首次应用显微注射的方法将SV40 DNA注射到小鼠囊胚腔内,在子代小鼠的许多组织中含有该DNA,后来研究证明该DNA以非整合的附加体     

显微注射技术

显微注射技术是50年代发展起来的,现已广泛应用于细胞学和实验胚胎学等学科的研究。对于未来的农业和畜牧业,也有很大的应用价值。此项技术最初用于细胞核的移植,方法是用显微吸管(也即显微注射针头)将细胞核吸入     

胸腺素α原体外诱导小鼠胸腺细胞凋亡的初步探讨

胸腺细胞经ProTα和/或氢化考的松处理以后,采用PI染色法检测亚二倍体细胞百分率、荧光光度计检测细胞内游离Ca~(2 )浓度及琼脂糖凝胶电泳定性检验DNA片段化。结果发现单独或与氢化考的松联合应用,ProTα均可明显促进DNA片断化、提高亚二倍体细胞百分率并且也明显提高细胞内游离Ca~(2 )浓度。本实验说明ProTα能促进胸腺细胞的凋亡。     

同位素标记法专题复习

同位素标记法是利用同位素的电离辐射对乳胶 (含AgBr或AgCl)的感光作用,对细胞内的生物大分子进行动态研究和追踪的一种细胞化学技术。包括: 同位素标记的大分子前体的掺入和细胞内同位素所在位置的显示。常用的同位素有:15N、35S、3H和14C等。研究DNA合成时通常用氚(3H)标记的胸腺嘧啶脱氧     

何谓基因疗法?

问 :何谓基因疗法 ?答 :所谓基因疗法 ,就是采用分子遗传学技术 ,以相应的正常基因去代替有缺陷的基因 ,或选择地使有害基因失活。基因疗法有如下几种 :1)显微注射法　用显微注射 ,将脱氧核糖核酸(DNA)注入到靶细胞的核内 ,所注入的 DNA只要达到被注射细胞的 10 % ,即可形成稳定的新基因型 ;2 )同源重组　是通过基因交换 ,直接用新的基因片段 ,来代替有缺陷的基因片段 ;3)反转录病毒载体　是目前最盛行的 ,利用反转录病毒作载体 ,进行基因转移 ;4 )磷酸钙沉淀法　用于体外生物系统基因转移。基因治疗的首选对象是单基因遗传病 ,其中最主…     

完整的供体细胞膜及供体胞质对小鼠体细胞克隆胚发育的影响

利用显微注射和电融合的方法都可以成功地获得体细胞克隆小鼠, 由于电融合法操作耗时, 融合率低, 因而大多数克隆小鼠是采用注射方法。而注射法需要将供体细胞核从细胞中分离出来, 此分离操作有可能导致对DNA的损伤, 曾有人使用直径较粗的注射管进行完整的供体细胞注射, 这种方法操作相对简单而且对供体核没有损伤。为了研究这种方法在小鼠核移植中是否适用, 本实验使用完整的小鼠卵丘细胞作供体, 进行显微注射, 结果显示, 完整的卵丘细胞注入卵母细胞后, 无论在1小时或者6小时激活, 大部分的重构胚在2细胞期碎裂, 而去掉细胞膜的供体体细胞核注入卵母细胞后, 重构胚可以卵裂并进一步发育。卵母细胞去核后不注射供体也发生碎裂, 大部分的孤雌胚(不去核)在完整的卵丘细胞被注入后同样发生碎裂。在供体卵丘细胞刚破膜后即被注入卵胞质和供核被充分剥离后注入两种情况下获得的重构胚的体外发育中, 前者发育各期的比率显著低于后者。这些结果说明完整的卵丘细胞膜阻碍了卵胞质对体细胞核的重编程作用, 造成碎裂; 注入卵胞质的供体质膜和胞质成分影响了克隆胚的体外发育。     

显微注射法制备转基因家蝇技术的建立

旨在利用显微注射法对早期家蝇(Musca domestica L.)卵注射含有增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因的转座子载体,实现活体基因稳定表达并对其进行验证,为开展家蝇基因功能的研究奠定基础。文中自制适用于显微注射家蝇卵的硼硅酸盐玻璃微量注射针,摸索出家蝇卵壳的软化处理条件,以NanojectⅢ高精度微量注射器为主体构建适用于家蝇的显微注射技术平台;将含有眼部特异表达的3×P3启动子、EGFP的重组质粒PiggyBac-[3×P3]-EGFP与稳定遗传表达辅助质粒pHA3pig helper显微注射到处理过的家蝇卵中,待羽化观察眼部发光情况,检测EGFP的表达及转录水平。结果表明,将家蝇卵在漂白水中漂洗35 s时卵的正常孵化率为55%,处理35 s的卵壳其硬度适宜注射且注射针头不易破碎;羽化后的家蝇眼部带有绿色荧光的占比约为3%,通过分子检测,家蝇的DNA和RNA中均扩增出EGFP特异片段,大小为750 bp。通过该技术平台,能够便捷、有效地实现报告基因在家蝇中的稳定表达,建立以家蝇为主体的生物反应器,为后续家蝇基因功能的研究提供一定参考价值。     

小麦恢复可育基因非配子融合的转移

由于利用了根癌农杆菌作为载体的DNA 转移系统,高等植物中的双子叶植物基因转移 获得了成功。但根癌农杆菌的天然寄生范围仅 限于双子叶植物,因此,单子叶植物的转化尚待 探索其他途经。有人采用单细胞或原生质体摄 取外源DNA,再生成愈伤组织,进而培育成完 整植株‘”。有人为了避开从细胞培养成植株的 某些困难,设想采用配子作为接受外源DNA的 受体,在体外培养花粉,把精子作为显微注射 DNA的靶子,再由花粉管进人子房,通过受精 将外源遗传物质引人到合子,从而形成转化的 胚,再发育为转化的植株［[91。还有人设想,以雌 配子作为显微注射DNA的靶子,将外源DNA 直接注射入卵细胞,然后通过受精,使外源DNA 进人受精卵,发育为转化的胚及转化的植 株^[2,3,5,4,10]。此外,最近有人报道,已经重组了 Ti质粒,可在单子叶植物玉米中作为外源DNA 转移的载体L川。但在单子叶植物的禾本科农作 物中,如小麦、水稻、玉米等,至今仍缺少可行的 外源基因转移技术。     

CRISPR技术在生物传感中的应用——胞内核酸成像、体外核酸检测与胞内DNA记录

核酸分子是生命的遗传物质和生命信息载体。如何观察细胞内外特定核酸序列,快速检测核酸序列和记录检测的细胞活动过程?这些在分子生物学领域重要的科学问题需要强有力的技术来解决。如今,在基因组编辑领域赫赫有名的CRISPR技术开始涉足上述领域。重点介绍CRISPR相关蛋白在生物传感方面的应用,包括细胞内特定基因组序列和RNA的成像、体外核酸快速检测以及细胞内DNA记录。核酸成像与核酸检测是将特定核酸序列的信息,通过CRISPR蛋白的参与转化为易检测的信号(如荧光);而DNA记录则是将细胞的代际或所接触的信号转化为细胞内DNA序列进行储存。这些新兴研究方向的开发和发展将大大促进CRISPR技术在基础科学、合成生物学、分子诊断等领域的应用。     

线粒体DNA的异质性与检测方法

线粒体DNA的异质性在生物学、医学、法医、生物技术等领域有重要的应用。本文从自然发生(包括体细胞突变、父系渗入和杂交)和人工产生(包括转基因、细胞融合、核移植和转线粒体)两大方面系统地介绍了线粒体DNA异质性的产生机制及其遗传。并介绍了线粒体DNA异质性的检测方法,已知突变位点mtDNA异质性的检测方法有原位PCR技术、PCR-RFLP和实时荧光定量PCR技术,未知突变位点mtDNA异质性的检测方法有长PCR技术、时相温度梯度凝胶电泳(TTGE)和变性高效液相色谱(DHPLC)等。最后对克隆生物中线粒体异质性检测的应用实例作了介绍。     

重组DNA技术

重组DNA(recombihant DNA),顾名思义,即将两种不同的DNA分子,经过裁剪并重新组合,创造出一种新的、杂合的DNA分子,然后将它转化或转导至受体细胞并在其中进行复制以及表达。这一技术通常叫作基因工程,广义来讲也称为遗传工程。1972年,美国生物化学家P.Berg等人首先将XDNA上剪切下来的一段基因,成功地拼接到SV_(40)病毒DNA分子上,从而开创了这一崭新的技术。随后,这一技术在现代生物学的研究和     

显微分光光度法测定Co~(60)辐照后大白鼠外周淋巴细胞核内DNA含量变化

显微分光光度法是利用分光光度法的原理,以一定波长的单色光在显微镜下对生物样品微细结构中的化学物质进行定量测定。显微分光光度法测定的不是一个细胞,而是一个细胞群体内的某种物质(如DNA),其中各个细胞内的物质含量不完全相同,然而,一个细胞群体的某物质含量有一定的分布,通常用组织图来表示,正常细胞胞核的DNA含量只与染色体的数目有关,如呈规律性的成倍增加,即为2倍体、4倍体等。用这种方法,可以鉴定正常细胞受到某种外界环境刺激后所发生的变化,如癌变等。我们采用这种技术探测大白鼠受Co~(60)γ射线照射后外周血淋巴细胞核内DNA含量的变化。一、材料和方法选择体重为150g—200g的雄性大白鼠,每16—20只为一批,进行Co~(60)r照射,剂量     

单细胞拉曼光谱在微生物研究中的应用

拉曼显微光谱是一种能够提供0.5–1.0μm空间分辨率的单个微生物细胞内化学结构信息的研究技术。近几年来,拉曼显微光谱被越来越多地应用于微生物单细胞的研究中,它可以快速无损地检测微生物细胞内的特征化学组分。典型的单个微生物细胞的拉曼光谱包含核酸、蛋白质、碳水化合物、脂质和色素(例如类胡萝卜素)等信息,这些信息能够表征微生物细胞的基因型、表型和生理状态。所以单细胞拉曼显微光谱是一种可用于区分微生物样品的"全生物指纹"技术,它可用于研究单个微生物细胞生命阶段的转变、鉴定微生物单细胞中的色素及其他化合物的含量变化等。本文综述了目前拉曼显微光谱在微生物单细胞研究上的应用,主要包括与稳定同位素标记(stable isotope probing,SIP)、拉曼成像、光谱分类和细胞分选技术结合来探究微生物单细胞对物质吸收后特征峰的变化、推导物质循环过程、进行微生物分类鉴定和探索基因型与表型的关系。拉曼显微光谱作为微生物单细胞研究的手段之一,在代谢过程的研究、活细胞分选和细胞对物质的利用上具有广泛的应用前景。     

哺乳动物体细胞核移植表观遗传重编程研究进展

体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer, SCNT)是唯一能赋予体细胞基因组全能性的生殖工程技术,对动物种质资源保存、畜牧业发展和生物医学研究等具有重大意义。尽管该技术已经取得了许多研究进展,但哺乳动物克隆胚胎的发育效率依然很低,严重限制其在畜牧业和生物医学上的应用。导致克隆胚胎发育效率低的主要原因是体细胞重编程错误或重编程不完全,主要表现为:印记基因Xist表达异常、DNA甲基化异常,组蛋白修饰异常等。本文简要介绍了体细胞核移植技术,系统总结了哺乳动物克隆胚胎发育效率低的主要影响因素,以期为提升体细胞克隆效率相关研究与实践提供理论参考。     

梨实生树不同发育区的叶片细胞学研究

采用显微分光光度计和显微图像分析仪比较研究了8年生梨实生树(Pyrus pyrifliaNakai)童区和成年区叶片细胞核 DNA含量、RNA含量和细胞、细胞核面积大小的差异。梨实生树从童区向成年区转变后,叶片内细胞核DNA含量上升,细胞内RNA合成加强,细胞和细胞核面积增大;同时,叶肉组织结构分化程度提高,叶面积增大,叶片加厚。