利用农杆菌介导法将γ-生育酚甲基转移酶基因导入油菜的研究

将γ-生育酚甲基转移酶基因导入油菜,旨在提高菜油中的维生素E含量。为了使该基因在油菜种子中特异表达,采用油菜种子特异启动子BcNA1,构建了植物表达载体pBIBE。以花油五号和花油六号油菜品种子叶柄为受体,将γ-生育酚甲基转移酶基因(γ-TMT)通过农杆菌介导法转化油菜,获得了22株抗卡那霉素再生植株。经过PCR检测,其中有7株表现为阳性,初步证明γ-TMT已整合到油菜基因组中。     

甘蓝型油菜PEP基因片段的克隆和种子特异性反义表达载体的构建及转基因油菜的获得

丙酮酸羧化酶(PEP)是控制油菜蛋白质/油脂含量比例的一个种子的含油量.本研究利用PCR法从甘蓝型油菜花油5号(H045)克隆了PEP基因片段,并与载体pBI121-B构建了反义PEP基因的种子特异性植物表达载体,通过激光微束穿刺法将其转化到甘蓝型油菜中,目前已获得了转基因植株.     

甘蓝型油菜γ-生育酚甲基转移酶基因的克隆和功能验证

采用RACE技术,从甘蓝型油菜中克隆出一含1044个碱基的开放阅读框架的γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)基因全长cDNA。将其成熟蛋白编码区克隆进pET21b( )多克隆位点,在大肠杆菌BL21(DE3)CodonPlus中表达出一个分子量为36kDa的融合蛋白。酶学分析显示,重组酶具有γ-TMT活性。     

甘蓝型油菜TT1基因反义植物表达载体的构建

拟南芥TT1(transparenttesta1)基因编码一个WIP类型锌指蛋白转录因子,调控内种皮发育和原花青素在内种皮的积累。本研究通过PCR扩增了甘蓝型油菜(Brassicanapus)TT1基因家族(BnTT1)的一段特异保守片段TT1A,并将其亚克隆到中间载体pCambia2301G中,构建了TT1反义植物表达载体pCambia2301G-TT1A,通过PCR鉴定、酶切鉴定和DNA测序证实载体构建成功,并转化到根癌农杆菌LBA4404菌株中形成工程菌株。此表达载体的构建为进一步研究TT1基因在甘蓝型油菜种皮色素合成途径中的分子生物学机理和利用反义TT1基因遗传转化获得转基因新型黄籽油菜奠定了基础。     

轮状病毒VP7基因的克隆及其植物表达载体的构建

应用聚合酶链式反应技术(PCR)扩增了轮状病毒VP7基因,并将其克隆到pMD18-Tvectr载体上,对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析,并测定了DNA全序列.结果表明,克隆片段全长为981 bp.将轮状病毒VP7基因定向的克隆到植物表达载体pBI121启动子下游,构建了植物表达载体.     

小麦γ-TMT基因的克隆与表达分析

γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)是维生素E合成途径的关键酶之一。该研究采用RT-PCR方法,从小麦品种‘中国春’中克隆得到小麦γ-TMT基因的3个同源拷贝,其CDs(codingsequence)序列相似性为99.12%;其中Ta-γ-TMT-6A和Ta-γ-TMT-6B编码区长度为1101bp,编码366个氨基酸,而Ta-γ-TMT-6D因发生无义突变,编码365个氨基酸。生物信息学分析表明,3个蛋白分子量分别为39.58、39.53和39.50kDa,理论等电点分别为6.67、6.41和7.08,都属于亲水性不稳定非分泌型蛋白。系统进化分析表明,小麦Ta-γ-TMT蛋白与糜子Pm-γ-TMT的亲缘关系相对较近。实时定量PCR分析表明,小麦Ta-γ-TMT基因在根、茎、叶、颖壳、种子中均有表达,在叶片中表达量最高;ABA、NaCl、PEG均能诱导Ta-γ-TMT基因的上调表达。该研究结果为进一步探讨小麦γ-TMT基因的功能奠定了基础。     

角质细胞生长因子2基因(KGF2)的克隆及其对油菜的遗传转化

近年来,植物表达人源蛋白的研究逐渐增多。本研究以人角质细胞生长因子(KGF2)基因cDNA为基础,根据植物偏好密码子进行改造,并利用PCR方法合成KGF2基因全长cDNA。在此基础上构建了KGF2的植物油体系统表达载体p1390-YO-KGF2,并采用农杆菌介导法对甘蓝型油菜无菌苗的子叶进行转化。通过PCR、Southern杂交和Western blotting检测,证明外源基因KGF2已经转入油菜中并得到成功表达。     

油菜AP2/ERF-B4类转录因子克隆及表达载体的构建

利用油菜UniGene数据库,以拟南芥转录因子保守序列为探针,通过电子克隆方法分离得到一个UniGene库Bna.17538,进一步序列拼接得到一个油菜AP2/ERF-B4亚族的转录因子BnaERFB4-1,长度为672 bp,并进行了相关的生物信息学分析.结果显示BnaERFB4-1是亲水性蛋白,蛋白质三级结构与拟南芥RAP2.6L非常相似,蛋白质无序化程度大于拟南芥RAP2.6L.设计引物通过PCR和RT-PCR方法分别从甘蓝型油菜沪油15幼苗的DNA和cDNA中分离了BnaERFB4-1基因,命名为BnaERFB4-1-Hy15.序列测定和分析显示,来源于沪油15的BnaERFB4-1-Hy15基因与电子克隆的基因序列差异很小,有3个氨基酸位点不同,存在一个内含子.将BnaERFB4-1-Hy15基因通过BamHⅠ和SacⅠ酶切后分别插入酵母表达载体YK3302和植物双元表达载体pYF1404的相应位置,构建了BnaERFB4-1-Hy15基因的酵母体内结合和植物转化载体,为深入研究该基因在油菜抗逆调控中的作用奠定了基础.     

油菜(Brassica napus)Bna-miR1140基因启动子miR1140Pro的克隆与表达模式研究北大核心CSCD

旨在研究Bna-miR1140的表达模式及其调控机理,依据本实验室前期的油菜miRNA芯片实验结果,从油菜栽培种Westar中克隆了Bna-miR1140前体序列上游1.5 kb的片段,并进行了顺式作用元件分析,然后构建了GUS报告基因植物表达载体,通过农杆菌介导法将miR1140 pro∷GUS转化到甘蓝型油菜Westar品种中,经PCR法鉴定获得5株阳性株。对阳性株油菜T1代各组织的GUS化学染色分析表明,miR1140前体序列上游1.5 kb区域具有启动子的功能,能够驱动GUS在油菜中表达,并且GUS基因仅在叶柄及叶腋中特异性表达,说明油菜miR1140Pro为特异性启动子。     

拟南芥γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)启动子的分离及表达特性分析

维生素E是一类人体所必需的脂溶性的维生素,具有重要的生理功能。γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)是维生素E生物合成途径中的关键酶之一,催化γ、δ-生育酚甲基化,生成α、β-生育酚。从拟南芥中分离了γ-生育酚甲基转移酶基因1552bp的启动子序列,构建了含有该启动子和GUS报告基因的植物表达载体,通过农杆菌介导转化拟南芥,获得了转基因植株。GUS组织化学染色结果表明,在γ-TMT启动子的驱动下,报告基因GUS在拟南芥的叶、茎以及花均有表达,且在茎尖、雄蕊和幼叶中表达最强,而在根、种子和种荚中则没有检测到GUS基因的表达,表明γ-TMT基因可能仅在拟南芥某些组织中特异性高表达。     

油菜(Brassica napus)Bna-miR1140基因启动子miR1140Pro的克隆与表达模式研究

旨在研究Bna-miR1140的表达模式及其调控机理,依据本实验室前期的油菜miRNA芯片实验结果,从油菜栽培种Westar中克隆了Bna-miR1140前体序列上游1.5 kb的片段,并进行了顺式作用元件分析,然后构建了GUS报告基因植物表达载体,通过农杆菌介导法将miR1140 pro∷GUS转化到甘蓝型油菜Westar品种中,经PCR法鉴定获得5株阳性株。对阳性株油菜T1代各组织的GUS化学染色分析表明,miR1140前体序列上游1.5 kb区域具有启动子的功能,能够驱动GUS在油菜中表达,并且GUS基因仅在叶柄及叶腋中特异性表达,说明油菜miR1140Pro为特异性启动子。     

油菜叶绿体多顺反子定点整合表达载体的构建

根据拟南芥叶绿体基因组序列设计PCR引物,从我国甘蓝型油菜栽培品种F4叶绿体基因组中克隆了长度为1.5kb的trnI和trnA2个基因序列,核酸序列分析表明它们与拟南芥基因的同源性高达94%和99%,这两个克隆的油菜叶绿体基因组序列trnI和trnA被用于构建叶绿体定点整合表达载体。利用烟草叶绿体基因强启动子Prrn和终止子TpsbA,以及筛选标记基因aadA和目的基因HSA,构建了多顺反子表达盒Prrn-aadA-HSA-TpsbA,将表达盒置于油菜叶绿体trnI和trnA序列之间,最后构建成油菜叶绿体多顺反子定点整合表达载体pIPaHTA。酶切鉴定及序列分析证实,构建的表达载体具有预期的调控元件及结构,这为后期油菜叶绿体转化体系的建立奠定了基础。     

甘蓝型油菜BcNA1基因启动子在转基因烟草中对GUS基因表达的调控

通过PCR扩增,从甘蓝型油菜（Brassica napus)品种H165中克隆了种子贮藏蛋白基因BcNAl的启动子,将此启动子与GUS基因相连构建了植物表达载体,利用农杆菌介导法将其导入烟草,对转基因烟划GUS基因检测分析表明,BcNAl基因启动子能特异地启动GUS基因在种子中的表达;而且GUS酶的活性随着转基因烟草种子的发育而变化。同时还间接证明BcNA1基因的启动子在转基因烟草中的遗传传递方式符合盂德尔遗传定律。     

甘蓝型油菜BnCOP1基因的原核表达和纯化

COP1蛋白是植物光信号调节网络中介导光信号转导的一个关键因子,对植物生长发育起重要调控作用.通过RT-PCR方法从甘蓝型油菜中克隆BnCOP1基因编码区全长序列,并将其连接到冷诱导原核表达载体pCold TF上,构建原核重组表达载体pCold TF/BnCOP1,转化大肠杆菌BL(21)star.通过IPTG法低温诱导表达融合蛋白.结果表明,重组质粒在大肠杆菌中获得高效表达,融合蛋白分子质量约为128 kD,融合蛋白在上清液和包涵体中均有表达,可溶性部分经亲和层析纯化和Western blotting检测证实获得了高纯度的重组蛋白,这些结果为进一步研究油菜BnCOP1的结构和功能奠定了基础.     

青花菜ProDH基因的克隆及功能鉴定

脯氨酸是水分胁迫植物中最常见的渗透保护物质之一,脯氨酸脱氢酶(ProDH)是存在于线粒体内的催化脯氨酸降解的关键酶,构建RNAi表达载体转化青花菜可以抑制脯氨酸分解提高其抵抗干旱胁迫和盐胁迫的能力。本研究利用同源重组和RACE技术克隆青花菜脯氨酸脱氢酶基因(ProDH),以酶切、连接的方法利用载体pFGC1008构建植物RNAi表达载体pFGC-PDHi。序列分析表明,本文首次克隆了1595bp的青花菜脯氨酸脱氢酶基因cDNA全长,该序列编码498个氨基酸;序列比对发现该核酸序列与拟南芥、甘蓝型油菜、芜菁分别有83.26%、89.07%和97.73%的同源性,其氨基酸序列和拟南芥、甘蓝型油菜、芜菁分别有89.78%、91.38%和98.80%的同源性。测序和酶切鉴定表明青花菜ProDH基因RNA干扰表达载体已经构建成功,并将其转化青花菜得到转化株,经PCR检测,转化株均为阳性株,证明干扰载体的T-DNA区已经成功地整合到了青花菜基因组中。研究还发现在外源的L-脯氨酸存在时,转化株的脯氨酸脱氢酶的活性受到了明显的抑制。本研究为青花菜的抗旱育种提供了非常有价值的新种质材料。     

甘蓝型油菜A基因组候选BAC克隆的筛选及其插入片段大小分析

选择甘蓝型油菜A基因组10个连锁群上特有的85个SSR分子标记,合成其引物序列,采用四维PCR法筛选甘蓝型油菜-新疆野生油菜二体异附加系BAC文库,成功筛选到甘蓝型油菜A基因组39个BAC克隆,其插入片段介于50～300 kb之间,平均为120 kb。甘蓝型油菜A基因组10个连锁群BAC克隆的获得,对后续开展甘蓝型油菜A基因组染色体识别、基因染色体定位、遗传距离与物理距离间关系分析等均具有重要价值。     

大白菜抗软腐病基因BrWRKY33植物表达载体的构建

利用农杆菌侵染法获得抗软腐病转BrWRKY33基因大白菜,首先要构建植物表达载体。本实验根据BrWRKY33基因的序列及pROK2表达载体的酶切位点设计引物(FN/RN),获得BrWRKY33基因,然后将该基因连接到克隆载体pGEM-TEasy,重新构建了克隆载体T-WRKY。经测序及酶切验证,选取PCR反应中错配率最低的产物,构建了表达载体pROK2-WRKY,并将该表达载体转入到根癌农杆菌EHA105中,并对其转化子进行了鉴定。结果表明,PCR扩增获得目的基因BrWRKY33全长约1443bp,PCR及酶切结果鉴定表明克隆载体T-WRKY已经重新构建成功。表达载体的PCR及BamHⅠ和KpnⅠ双酶切鉴定表明有4个重组子表现阳性,表明目的基因已经插入到pROK2表达载体,表达载体构建成功。PCR鉴定表明表达载体pROK2-WRKY已经转入根癌农杆菌EHA105中。本实验结果将为进一步研究大白菜抗软腐病基因的转化奠定基础。     

油菜沪油15中AP2/ERF-B3亚族转录因子的克隆和生物信息学分析

AP2/ERF转录因子家族广泛存在于植物中,参与植物细胞周期、生长发育以及生物和非晌镄财认喙鼗虮泶锏骺?本文利用油菜UniGene数据库.以拟南芥AP2/ERF-B3亚族转录因子保守序列为信息探针,分离得到2个油菜AP2/ERF-B3亚族的转录因子BnaERFB3-1和BnaERFB3-2.通过PCR和RT-PCR方法分别从双低甘蓝型油菜沪油15的DNA和cDNA中克隆了上述基因.序列分析显示.克隆的BnaERFB3-1-Hv15和BnaERFB3-2-Hv15转录因子与电子克隆的基因序列差异很小,均只有1个氨基酸位点不同.且都没有内舍子.从氨基酸序列的相似性、组成成分、理化性质、疏水性/亲水性、序列比对、进化树、功能域、二级结构、三级结构、无序化特性等方面进行了预测和较为全面的分析.结果显示BnaERFB3-1-Hv15和BnaERFB3-2-Hv15是亲水性蛋白,在蛋白质的三级结构上与AtERF5相似,BnaERFB3-1-Hv15和BnaERFB3-2-Hv15蛋白无序化程度大于拟南芥AtERF5.通过分析EST丰度显示,BnaERFB3-1的表达集中在种子中,而BnaERFB3-2的表达则集中在根中.另外.将上述基因分别构建入酵母表达载体和植物双元表达载体,为深入研究该基因在油菜抗逆调控中的作用奠定了基础.     

Floral-dip转化法将PEPC基因ihpRNA干扰表达载体导入甘蓝型油菜

根据磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)基因控制油菜籽中蛋白质与脂肪酸合成的原理,构建了PEPC基因片段ihpRNA干扰表达载体,该载体包含了一个PEPC基因片段正反向序列的回文结构．表达RNA干扰的载体结构（ihpRNA）,在大肠杆菌体内进行克隆的过程中易被大肠杆菌自身携带的某种酶剪切,剪切位点不确定,可能是一种随机性的剪切．通过反复实验,最终获得了一个与我们设计一致的PEPC基因片段正反向序列结构, RNA干扰表达载体构建获得成功．利用花序浸渍法(floral-dip)转基因将构建的PEPC基因ihpRNA干扰表达载体转移到甘蓝型油菜中,并通过抗性筛选、PCR特异扩增、PCR-Southern杂交和克隆测序,对获得的转基因植株进行了鉴定,转化率达到了069%,说明floral-dip方法有效地实现了ihpRNA干扰表达载体的遗传转化