胡杨PeNAC121基因启动子的分离鉴定和胁迫应答模式分析

为了探究NAC转录因子家族成员在胡杨（Populus euphratica）逆境胁迫中的响应和调控机制,利用PCR技术从胡杨中克隆了PeNAC121基因的启动子序列,并采用生物信息学工具对该启动子的结构特征进行了分析,最后利用该启动子驱动GUS报告基因在三倍体毛白杨（Populus tomentosa）中表达,并对获得的转基因植株采用不同胁迫处理后进行了GUS染色和酶活性定量分析。结果表明,克隆获得的PeNAC121基因的启动子长度为1 997 bp（起始密码子ATG上游）,启动序列中除了含有大量的光响应元件,还含有多个与非生物逆境胁迫和激素响应相关的元件,如低温响应元件LTR、干旱响应元件MBS、防卫和胁迫响应元件TC-rich repeats、脱落酸（ABA）响应元件、以及赤霉素（GA）响应元件等。基因的组织表达模式检测结果显示,PeNAC121基因主要在茎中表达,在根和叶中的表达较少。GUS组织化学染色和酶活性检测结果表明,胡杨PeNAC121启动子显著受到NaCl、甘露醇、ABA和4 ℃低温的诱导表达。由上述结果推测PeNAC121基因与胡杨的逆境胁迫应答密切相关,表明该基因的启动子是一个能够应答多种逆境胁迫的诱导型启动子。本研究为阐明PeNAC121基因在胡杨逆境响应和调控中的作用机制提供理论参考。     

光信号转导因子HY5调控拟南芥分枝的功能研究

光是影响植物分枝的重要外在环境因素,但光信号因子HY5（ELONGATED HYPOCOTYL5）是否调控植物分枝目前尚不清楚。创制了HY5转基因超表达植株,并获得商业化T-DNA插入突变体纯合植株。通过比较野生型（WT）、超表达植株（HY5-OE）、突变体（hy5-215）的分枝数目发现,与野生型相比,超表达植株分枝数目显著增加,而突变体分枝数目则显著减少。进一步比较这些遗传材料的拟南芥植株分枝的负调控关键因子BRC1（BRANCHED1）转录本水平差异,发现与野生型相比,超表达植株中BRC1转录本显著下调、突变体中显著上调。研究结果表明,HY5通过抑制拟南芥分枝关键负调控因子BRC1的转录水平,进而促进拟南芥的分枝。研究结果为阐明HY5调控分枝的生物学功能提供了一定的理论依据。     

piRNA抑制基因转座的分子机制

转座子是一类可以在染色体上或不同染色体间自由移动的DNA。在高等生物中,处于活跃状态的转座子多为通过RNA中间体进行转座的逆转录转座子。由于逆转录转座子在细胞基因组中占有很高的比例,它的频繁转座能引起细胞基因组结构和功能的改变,导致癌症等严重基因疾病的发生,因此宿主细胞在长期的进化中形成了多种自我保护机制用以控制逆转录转座子活性。属于非编码小RNA的piRNA以其独特的机制在转录及转录后水平控制逆转录转座子RNA中间体的产生,抑制了逆转录转座过程的发生。本文总结了近年来piRNA控制转座子转座相关分子机制的研究进展,以期为转座子及基因调控方面的研究工作提供一些参考。     

内含子中正筛选标记neo基因在转录中的剪切研究

目的:研究插入内含子中的正筛选标记基因neo在转录中的剪切情况。方法:克隆了猪血清白蛋白基因5'端调控序列,以猪基因组DNA为模板,P10/P11为引物,PCR扩增猪血清白蛋白基因翻译终止密码子后2.9kb的3'端调控序列;以pEGFP-1为模板,P400/P401为引物PCR扩增绿色荧光蛋白(EGFP)基因,插入猪血清白蛋白基因5'端调控区之后,在3'端调控序列的内含子中靠近N端的序列中插入正筛选标记基因neo,构建了表达EGFP的真核表达载体pEXp11。转染人肝癌细胞系HepG2,通过G418药物筛选获得稳定转染的抗药性细胞克隆。提取抗性细胞克隆基因组RNA并进行反转录,获得cDNA序列。结果:用引物D400/D401及分别位于neo基因和3'端调控序列上的一对引物D394/D357进行PCR检测,其中D394/D357并未扩增出目的条带。结论:插入内含子中的neo基因在转录过程中可随内含子一起被剪切。     

拟南芥IAA酰胺合成酶GH3-6负调控干旱和盐胁迫的反应

生长素是一种重要的植物激素, 几乎参与了植物所有的生命活动过程。GH3-6具有IAA酰胺合成酶活性, 催化氨基酸与IAA形成IAA的氨基轭合物, 发挥暂时或永久灭活IAA的作用。该文探讨了GH3-6基因在拟南芥(Arabidopsis thaliana)逆境适应过程中的功能。结果显示GH3-6基因受干旱、ABA和高盐的诱导表达。与野生型相比, GH3-6基因过表达突变体dfl1-D对干旱的抗性明显减弱, 叶片失水速率更快。在抗盐方面, dfl1-D也显著弱于野生型。在3种逆境(干旱、ABA和高盐)胁迫下, GH3-6基因的高表达抑制了逆境响应基因RD22、KIN1、RD29A和DREB1A的表达。而且在干旱胁迫下, dfl1-D中ABA的含量明显低于野生型。研究结果证明, 高表达GH3-6基因负调控拟南芥对逆境的抗性。     

澳洲坚果MibZIP1基因克隆及表达规律分析

为研究澳洲坚果（Macadamia integrifolia）中bZIP转录因子家族成员在逆境抗性中潜在功能,从‘桂热1号’品种果实中克隆MibZIP1基因。结合转录因子结构分析和不同处理下表达规律进行分析发现MibZIP1基因序列长度1 157 bp,基因编码区长度927 bp,编码308个氨基酸。MibZIP1存在典型bZIP superfamily结构域。系统进化分析鉴定出澳洲坚果MibZIP1、蒂罗花（Telopea speciosissima）TsbZIP60和荷花（Nelumbo nucifera）NnbZIP60亲缘关系较近。组织表达分析结果表明MibZIP1在‘桂热1号’品种叶片中的表达量最低,在‘695’品种枝条中的表达量最高。其在受玉米素、水杨酸、乙烯利和脱落酸处理的“桂热1号”叶片中显著上调表达,在赤霉素和过氧化氢处理的“桂热1号”叶片中表达差异不显著。推测MibZIP1与澳洲坚果抗逆性有关,为研发澳洲坚果新型栽培和激素调控技术提供理论指导。     

家蚕LTR逆转录转座子的鉴定、分类及系统发育分析

转座子是真核生物基因组的重要组成成分。为了研究家蚕Bombyx mori长末端重复序列 (long terminal repeat, LTR)逆转录转座子的分类及进化, 本研究采用de novo预测和同源性搜索相结合的方法, 在家蚕基因组中共鉴定出了38个LTR逆转录转座子家族, 序列长度占整个基因组的0.64%, 远小于先前预测的11.8%, 其中有6个家族为本研究的新发现。38个家族中, 26个家族有表达序列标签 (expression sequence tag, EST)证据, 表明这些家族具有潜在的活性。对有EST证据的6个家族和没有EST证据的5个家族用RT-PCR进行了组织表达谱实验, 结果表明这11个家族在一些组织中有表达, 这进一步证实了这些家族具有转录活性, 基于此我们推测家蚕中大部分的LTR逆转录转座子家族很可能具有潜在活性。对转座子的插入时间进行估计, 结果表明绝大部分元件都是最近1百万年内插入到家蚕基因组中的。我们还比较了黑腹果蝇Drosophila melanogaster、 冈比亚按蚊Anopheles gambiae和家蚕B. mori中Ty3/Gypsy超家族分支的差异, 结果表明不同枝在不同昆虫中有着不同的扩张。家蚕中LTR逆转录转座子的鉴定和系统分析有助于我们理解逆转录转座子在昆虫进化中的作用。     

受逆境诱导的水稻Rim2/Hipa假基因转录本选择性加尾和剪接

我们以往的研究证明水稻受病原菌诱导的Rim2/Hipa因子是水稻基因组所特有的DNA转座子超级家族.本实验通过对病原菌诱导的cDNA文库的筛选和对EST数据库的搜索,发现在众多的Rim2拷贝中,只有Rim2-42因子被表达,其为一个TNP2类转座酶的假基因,其编码区为终止子所打断.序列分析结果表明Rim2转录本被选择性剪接和加尾,而且在两个水稻亚种中的剪接方式有差异,共形成7种不同转录本结构,包括一个未知功能的Rim2-XET嵌合转录本,该嵌合转录本为转录通读(read-through)所形成,而XET基因是可以被逆境所诱导的.这些结果说明Rim2因子家族可能已失去转座的活性.结果也初步表明Rim2-42因子插入到了一个XET基因启动子的下游,该启动子带动了Rim2因子的诱导表达.     

逆转录转座子LINE-1与肿瘤的发生和发展

LINE-1是现今人体内存在的唯一具有自主转座活性的转座子,约有500 000个拷贝,占人类基因组总量的17%。LINE-1是通过转录和逆转录在内的转座过程产生新的DNA拷贝,并使新产生的DNA拷贝插入基因组的不同位置。LINE-1转座会影响基因组中其他基因的表达或调控,因而会对基因组的稳定性产生影响,从而导致基因疾病或肿瘤的发生。本文总结了近年来国际上对LINE-1转座与肿瘤的发生和发展之间关系的研究进展,为肿瘤的治疗和机制研究提供一些线索。     

利用Tn5型转座突变系统筛选高产阿维菌素菌株*

目的: 转座突变技术是发现新功能基因和获得高产天然产物菌株的一种有效策略。通过理性设计和构建Tn5型转座突变系统,并将其应用于阿维链霉菌,筛选高产阿维菌素的工程菌株。方法: 在转座突变载体pUCTN转座插入片段的上游和下游分别引入链霉菌常用的强启动子kasOp*和P21,强化插入位置上游和下游基因的转录表达;在插入片段两端分别添加双向转录终止子T1和T2,有效终止插入序列两端靶基因的转录,引入强启动子和终止子的目的在于增强对转座突变株生理代谢活动的扰动。结果: 通过优化供体菌和受体菌的比例,转座效率显著提高。随机选择500株转座突变株进行发酵和阿维菌素产量测试,筛选到3株突变株的阿维菌素产量明显高于出发菌株产量的50%以上。结论: Tn5转座突变系统为研究阿维链霉菌的基因功能和生理代谢提供了有效的分子遗传工具。     

盐渍条件下野大豆群体的遗传分化和生理适应:同工酶和随机扩增多态DNA研究

黄河三角洲野大豆(Glycine soja Sieb. et Zucc.)盐渍群体的耐盐性高于附近的正常群体。群体内个体间耐盐能力差别很大。盐渍群体有比最耐盐的栽培大豆(G.max (L.)Merr.)品种耐盐能力高得多的个体,也有对盐相当敏感的植株。同工酶分析表明群体内高水半多态性,但酶谱与抗性没有相关性。盐渍与正常群体间的遗传一致性高达0.96。用改良的随机扩增多态DNA(RAPD)方法,10个引物扩增得出群体内多态位点百分数为68/188=0.36。看来,绝大多数位点与耐盐能力无关。上述资料说明,盐渍条件下野大豆自然群体的高度遗传多样性和发育变通性,可能足对盐胁迫强度随时随地变化的环境的适应。     

野生大豆盐碱胁迫相关GsTIFY11b的克隆与功能分析

以耐盐碱野生大豆(Glycine soja L.G07256)为材料, 采用同源克隆方法和RT-PCR技术获得一个TIFY 类基因的全长cDNA(命名为GsTIFY11b)。进化树分析表明, 与其他物种相比, GsTIFY11b与拟南芥的AtTIFY11a基因相似性最高, 达到56%; 序列分析表明GsTIFY11b蛋白除具有 TIFY保守结构域外, 还具有一个N端保守结构域和一个C端保守的Jas结构域; 实时荧光定量PCR结果显示该基因受盐和碱胁迫诱导表达; 将GsTIFY11b转化拟南芥来验证其耐盐碱功能, 获得两个转基因纯合体株系, 盐碱胁迫分析结果表明, GsTIFY11b的超量表达没能提高拟南芥对盐碱胁迫的耐性, 并且与野生型相比, 转基因植株在种子萌发期和苗期表现出对盐胁迫更加敏感。盐胁迫信号通路相关marker基因在转基因拟南芥中的表达特性分析表明, GsTIFY11b可以调控RD29B、KIN1、DREB等基因的转录。在洋葱表皮细胞中瞬时表达GsTIFY11b-GFP融合蛋白的结果表明, GsTIFY11b定位于细胞核中。上述结果表明, 该基因在细胞核中起着转录调节子的作用, 可能是通过调控盐胁迫信号通路中关键基因的表达来改变植物对盐胁迫的耐受性。     

野生大豆盐碱胁迫相关GsTIFY11b的克隆与功能分析

以耐盐碱野生大豆(Glycine soja L.G07256)为材料,采用同源克隆方法和RT-PCR技术获得一个TIFY类基因的全长cDNA(命名为GsTIFY11b)。进化树分析表明,与其他物种相比,GsTIFY11b与拟南芥的AtTIFY11a基因相似性最高,达到56%;序列分析表明GsTIFY11b蛋白除具有TIFY保守结构域外,还具有一个N端保守结构域和一个C端保守的Jas结构域;实时荧光定量PCR结果显示该基因受盐和碱胁迫诱导表达;将GsTIFY11b转化拟南芥来验证其耐盐碱功能,获得两个转基因纯合体株系,盐碱胁迫分析结果表明,GsTIFY11b的超量表达没能提高拟南芥对盐碱胁迫的耐性,并且与野生型相比,转基因植株在种子萌发期和苗期表现出对盐胁迫更加敏感。盐胁迫信号通路相关marker基因在转基因拟南芥中的表达特性分析表明,GsTIFY11b可以调控RD29B、KIN1、DREB等基因的转录。在洋葱表皮细胞中瞬时表达GsTIFY11b-GFP融合蛋白的结果表明,GsTIFY11b定位于细胞核中。上述结果表明,该基因在细胞核中起着转录调节子的作用,可能是通过调控盐胁迫信号通路中关键基因的表达来改变植物对盐胁迫的耐受性。