L78部分氨基酸残基对SERCA1a钙转运功能的影响

跨肌浆网膜的钙离子ATP酶SERCA1a可在水解ATP的同时逆浓度梯度从胞浆转运钙离子入肌浆网,引发收缩的骨骼肌细胞舒张.目前对SERCA1a结构与功能的研究,要领先于对其他P型离子转运ATP酶的研究.为了解SERCA1a跨膜螺旋M7与M8膜内侧连接部Linker78(L78)的功能,我们评估了L78部分氨基酸残基突变对SERCA1a反应循环的影响,发现:除G864A之外的所有突变体均可不同程度地降低钙离子转运速率;G862或P863氨基酸残基的突变导致SERCA1a的ATP酶活性显著降低或丧失,并引起由ATP或无机磷酸Pi生成的磷酸化酶中间体EP量显著减少;A893被P取代对SERCA1a的影响与G862、P863突变相似;与野生型SERCA1a相比,G864A与FMQ873-875单突变体ATP酶活性及EP生成量无明显差别.上述结果表明,M7、M8膜内侧连接部L78不仅与跨膜区钙离子转运过程密切相关,而且L78在GPG862-864处及A893附近的正确转折对胞浆结构域P的磷酸化也具有关键的远距离调控作用,提示L78的结构及柔度对SERCA1a构象正常的周期性变化至关重要.     

肌浆网钙ATP酶过表达对心房颤动兔心房及L型钙通道a1c蛋白表达的影响

目的探讨心肌肌浆网钙ATP酶2a(SERCA2a)基因过表达,对兔急性心房颤动(AF)的心房肌L型电压依赖钙通道蛋白alc亚单位(LVDCCalc)表达的影响。方法 48只成年新西兰兔,随机分成为房颤组(AF组,n=12)、9-型腺相关病毒+增强型绿色荧光蛋白组+房颤组(rAAV9+EGFP+AF组,n=12)、9-型腺相关病毒+肌浆网钙ATP酶2a+增强型绿色荧光蛋白组+房颤组(rAAV9+SERCA2a+EGFP+AF组,n=12),并设假手术组作为对照(Control组,n=12)。rAAV9+EGFP+AF组和rAAV9+SERCA2a+EGFP+AF组起搏前30 d开胸心包腔内注射包含报告基因的rAAV9-EGFP和包含靶基因的rAAV9-SERCA2a-EGFP各500μL(1×1012v.g/μL)。转染30 d后,AF组、rAAV9+EGFP+AF组和rAAV9+SERCA2a+EGFP+AF组,以600 BPM刺激频率,持续起搏兔右心房24h制作AF模型。处死各组动物,倒置荧光显微镜下观察右心房肌组织EGFP表达情况,行HE染色对右心房组织形态检查,应用免疫组化技述检测SERCA2a蛋白及LVDCCalc蛋白在心房肌中的表达情况。结果 rAAV9+EGFP+SERCA2a+AF组SERCA2a蛋白及LVDCCalc蛋白表达量显著高于AF组和rAAV9+EGFP+AF组(P<0.05),但与对照组比较差异无显著性。结论心房肌转SERCA2a基因,显著减少了急性房颤心房肌的LVDCCa1c蛋白表达的降低,有逆转急性AF电重构的作用。     

应用Ad Easy腺病毒载体系统构建人肌浆网钙离子ATP酶2a(SERCA2a)

目的:利用Ad easy腺病毒表达系统构建含人肌浆网钙离子ATP酶2a(SERCA2a)基因重组腺病毒,并在HEK293细胞中扩增制备重组腺病毒.方法:将人SERCA2a基因全长c DNA(3700bp)插入到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,成功构建pAd-TrackCMV SERCA2a重组质粒,经Pme I酶切线性化,采用电击法转入到已含Ad easy质粒的电感受态菌BJ5183进行重组.挑选同源重组质粒,Pac I酶切线性化转染HEK293细胞包装成重组腺病毒颗粒,荧光检测有绿色荧光蛋白表达.将重组病毒和SD大鼠心肌细胞共培养,western-blot检测SERCA2a可以在大鼠心肌细胞过表达且影响了胞内SERCA2a的活性.结果:成功包装含人SERCA2a基因的重组腺病毒,并可以有效感染SD大鼠心肌细胞.结论:利用新型腺病毒载体在短时间内成功构建了携带有人SERCA2a基因的腺病毒,为以后进一步研究人SERCA2a基因治疗提供了新途径.     

肌浆网钙ATP酶过表达对心房颤动兔心房及L型钙通道alc蛋白表达的影响

目的探讨心肌肌浆网钙ATP酶2a（SERCA2a）基因过表达,对兔急性心房颤动（AF）的心房肌L型电压依赖钙通道蛋白alc亚单位（LVDCCalc）表达的影响。方法48只成年新西兰兔,随机分成为房颤组（AF组,n=12）、9一型腺相关病毒＋增强型绿色荧光蛋白组＋房颤组（rAAV9＋EGFP＋AF组,n=12）、9一型腺相关病毒＋肌浆网钙ATP酶2a＋增强型绿色荧光蛋白组＋房颤组（rAAV9＋SERCA2a＋EGFP＋AF组,n=12）,并设假手术组作为对照（Control组,,l=12）。rAAV9＋EGFP＋AF组和rAAV9＋SERCA2a4-EGFP4-AF组起搏前30d开胸心包腔内注射包含报告基因的rAAV9一EGFP和包含靶基因的rAAV9-SERCA2a—EGFP各500肛L（1×10”v．g／ptL）。转染30d后,AF组、rAAV9＋EGFP＋AF组和rAAV9＋SERCA2a＋EGFP＋AF组,以600BPM刺激频率,持续起搏兔右心房24h制作AF模型。处死各组动物,倒置荧光显微镜下观察右心房肌组织EGFP表达情况,行HE染色对右心房组织形态检查,应用免疫组化技述检测SERCA2a蛋白及LVDCCalc蛋白在心房肌中的表达情况。结果rAAV9＋EGFP＋SERCA2a4-AF组SERCA2a蛋白及LVDCCalc蛋白表达量显著高于AF组和rAAV9＋EGFP＋AF组（P〈0．05）,但与对照组比较差异无显著性。结论心房肌转SERCA2a基因,显著减少了急性房颤心房肌的LVDCCalc蛋白表达的降低,有逆转急性AF电重构的作用。     

转译优化对EP0基因在cos7细胞中表达的影响

利用COS7细胞暂时表达系统,研究转译起始序列对EPO-cDNA表达的影响。通过DNA重组技术,构建了原EP0-cDNA表达载体pCSV-EP0(1)．其转译起始序列为5’AATTCATGG3’．同时通过定点突变技术,将起始序列改变成5’CCACCATGG3’,而构建了另一表达载体pCSv—EPO(2)。后者经序列分析证明无误后和前者均通过DEAE-dextran法转染COS7细胞,用ELlSA法定量洲量EP0表达水平．转染后48小时及72小时收集含pCSV—EP0(1)的COS7细胞上清．测定结果为1580pg／mI及954pg／mI,而含pCSV—EPO(2)的上清则为25 300pg／m1和17 450pg／ml。这表明经优化起始序列的基因表达远高于未经优化的。     

pEGFP-植酸酶基因质粒重组构建及其在COS7细胞中表达分析

采用PCR技术扩增细菌酸性植酸aPPA2基因ORF序列,其DNA分子为1 299 bp,编码432氨基酸,蛋白质分子量约为48 kD a。此植酸酶基因被克隆到pEGFP-N3表达载体的BamH1和Pst1克隆区域,重组的pEG-FP-aPPA2重组质粒经转化到哺乳类培养细胞COS7中。重组的pEGFP-N3-aPPA2在COS7细胞中正常表达并检测出高的植酸酶活性。本研究提出的pEGFP-N3-aPPA2重组质粒构建和在哺乳类COS7细胞表达体系为植酸酶生产提供了新的技术线路。     

SERCA2a基因转导过表达增强犬心肌细胞收缩功能

本研究旨在探讨心肌肌浆网Ca2+-ATP酶2a(sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase2a,SERCA2a)基因过表达对正常犬离体心肌细胞收缩功能的影响。通过胶原酶消化法分离犬心肌细胞,将分离的心肌细胞分为未转染组、空载体组、SERCA2a转染组,转染载体为含绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒载体,转染后均培养48h。利用免疫印迹法检测各组心肌细胞SERCA2a蛋白表达水平,并通过单细胞收缩动态边缘检测系统测定各组心肌细胞收缩功能的改变。结果显示,与未转染组相比,SERCA2a转染组SERCA2a蛋白表达水平明显升高,基础状态心肌收缩百分比和药物刺激条件下心肌最大收缩百分比均明显升高,达到峰值收缩时间(TTP)和50%舒张时间(R50)亦明显延长,差异具有显著性;而空载体组各项指标均无显著变化。以上结果提示,SERCA2a基因转导过表达能够增强正常犬心肌细胞的收缩功能。     

扩增和纯化携带肌浆网钙ATP酶重组腺病毒的实验方法

目的:通过扩增和纯化rAd.SERCA2a,为转SERCA2a基因研究提供实验基础,并为建立基因库提供稳定可靠的实验方法.方法:用100μL 1.9×10<'12>pfu/ml rAd.SERCA2a感染HEK293细胞,出现细胞病变效应时收获细胞,经物理反复冻融方法及两步氯化铯超速离心方法获得纯化的rAd.SERCA2a,紫外分光光度计比色法测定病毒DNA质粒数.结果:rAd.SERCA2a成功在HEK293细胞表达呈现绿色荧光,纯化的rAd-SERCA2a-GFP DNA质粒数为1.3±0.58×10<'12>pfu/mL,OD<,260>/OD<,280>比值为1.57±0.49(n=50).结论:建立了稳定可靠的借助HEK293细胞培养扩增rAd.SERCA2a的实验方法,纯化后的高效价的SERCA2a基因的重组腺病毒可直接用于心力衰竭的实验研究,对重组腺病毒携带其他基因的扩增与提纯方法也具有一定的参考价值.     

过表达CDX1蛋白对直肠癌细胞增殖及能量代谢的影响及机制研究

目的:探讨过表达尾侧同源盒转录因子1(CDX1)蛋白对直肠癌细胞增殖及能量代谢的影响。方法:以直肠癌细胞SW117为研究对象,细胞转染pIRES(空载体组)、pIRES-CDX1(过表达组),同时设置对照组(只加入转染试剂)。培养48 h后,Western blot检测细胞中CDX1、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)表达水平,噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,试剂盒检测细胞中三磷酸腺苷(ATP)含量、丙酮酸激酶活性、己糖激酶活性及培养液上清中乳酸含量。结果:空载体组细胞中CDX1、Cleaved Caspase-3、Akt、p-Akt表达水平及细胞存活率、凋亡率、ATP含量、丙酮酸激酶活性、己糖激酶活性及培养液上清中乳酸含量与对照组相比均没有明显差异。过表达组细胞存活率、p-Akt水平、ATP含量、丙酮酸激酶活性、己糖激酶活性及培养液上清中乳酸含量与对组相比均明显下降,凋亡率及细胞中Cleaved Caspase-3表达水平均明显高于对照组。结论:过表达CDX1蛋白能够促进直肠癌细胞凋亡,抑制直肠癌细胞增殖,影响直肠癌细胞能量代谢,作用机制可能与p-Akt水平有关。     

同一滴度不同方法转染AAV9-SERCA2a基因对大鼠的有效性和毒副作用评价

目的研究同一滴度不同心脏基因转染方法转染携带肌浆网钙ATP酶2a(sarcoplasmic reticulumCa2+ATPase 2a,SERCA2a)基因的9型腺相关病毒(adeno-associated virus serotype 9,AAV9)即AAV9-SERCA2a对SD大鼠心肌的有效性及对机体毒副作用的影响。方法体外成功构建AAV9-SERCA2a-EGFP病毒载体系统,90只雄性SD大鼠随机分为尾静脉注射(tail vein injection,TVI)组、心肌注射(intramyocardial injection,IMI)组、心包腔注射(intrapericardial injection,IPI)组,采用相应方法在体分别转染滴度1×1011vg/mL AAV9-SERCA2a-EGFP、AAV9-EGFP、NS各200μL。转染后30 d,荧光显微镜下观察心肝肾组织绿色荧光表达情况,Western blot检测SER-CA2a基因在大鼠各组织的相对表达量,体表12导联心电图检测心律失常发生率,HE染色观察病理学变化,心脏彩色多普勒超声评价心功能,血液生化学指标检测肝肾功能。结果三组左心室可见大量绿色荧光表达,IMI组荧光局限在注射点,三组肝肾组织均可见微弱荧光;三组心肌SERCA2a蛋白相对表达量显著高于肝肾(P<0.01),TVI组和IMI组心肌SERCA2a蛋白相对表达量明显高于IPI组(P<0.01);TVI组和IPI组心电图正常,IMI组2只大鼠发生室性早搏;三组转染AAV9-EGFP、AAV9-SERCA2a-EGFP与转染NS相比,心功能、组织病理学、血液生化学指标差异均无显著性(P>0.05)。结论三种方法转染滴度1×1011vg/mL AAV9-SERCA2a基因,TVI法和IMI法在心肌的有效性优于IPI法,TVI法和IPI法对机体的毒副作用小于IMI法,综合三种方法的有效性和毒副作用评价,TVI法优于IMI法和IPI法。     

PSP94-TNFαD11a融合基因在NIH3T3细胞中的表达及其产物活性分析

 为了分析 PSP94- TNFαD1 1 a融合基因的表达和表达产物的生物学活性 ,将含该融合基因的质粒 pc DNA- PSP94- TNFα D1 1 a转染 NIH3T3细胞 ,72 h后收集细胞培养上清 ,并提取细胞总RNA,经 RT- PCR,得到与目的基因长度相符合的 c DNA片段 ;以 PSP94c DNA为探针 ,对 RT-PCR产物进行 Southern印迹分析 .结果表明 :转染 PSP94- TNFαD1 1 a融合基因的 NIH3T3细胞 ,其 RT- PCR产物杂交信号为阳性 .细胞培养上清用 TNF抗体行 Western印迹和 ELISA分析 ,检测结果为阳性 .生物学活性分析表明 ,细胞培养上清不仅具有 PSP94抑制人前列腺癌细胞 PC- 3生长的活性 ,而且显示出 TNFα对 L92 9细胞的细胞毒作用 .以上结果表明 ,pc DNA- PSP94- TNFαD1 1 a质粒能够正确表达目的基因 PSP94- TNFα D1 1 a,且表达的 PSP94- TNFαD1 1 a融合蛋白具有预期的双重生物学活性 .     

促进CHO细胞生长及其产物hNGF表达的培养条件的初步研究

以稳定表达人神经生长因子（hNGF）的重组工程CHO细胞株为对象,采用无血清流加悬浮培养（Fed batch culture）方式,考察使用基础培养基(无特殊添加物),分别添加丁酸钠、DMSO、KH2PO4的培养基及不同培养温度（32℃和37℃）对细胞生长和重组蛋白表达的影响。每日取样检测细胞密度、细胞活率、葡萄糖浓度、重组蛋白浓度。结果表明细胞培养温度由37℃下降至32℃,细胞生长周期明显延长,重组蛋白产量增加。5mmol/L丁酸钠和2% DMSO的加入虽然提高了重组蛋白的表达量,但严重抑制细胞生长。最大的蛋白比生成速率（qNGF）出现在37℃培养且添加2% DMSO的培养条件下,而最高蛋白表达量则出现于32℃培养添加3.65mmol/L KH2PO4的培养条件下。研究表明,将培养温度设为32℃,在基础培养基中添加3.65mmol/L KH2PO4或1% DMSO是提高hNGF表达水平的有效方法。     

心力衰竭大鼠心肌SERCA2a和miR-25-3p/5p表达的改变及泻肺利水方药的干预作用

目的：观察心力衰竭大鼠肌浆网钙ATP酶（SERCA2a） mRNA和miR-25-3p/5p表达水平的变化及中药泻肺利水方药的干预作用。方法：SD大鼠随机分为对照组、模型组、中药组、卡托普利组和地高辛组（n=10）,阿霉素腹腔注射（总剂量15 ml/kg,2周内分6次注射）建立心力衰竭大鼠模型,5周后分别以蒸馏水（10 ml/（kg·d））、泻肺利水中药（22 g/（kg·d））、卡托普利（19 mg/（kg·d））和地高辛（32μg/（kg·d））连续灌胃35 d,观察大鼠心肌SERCA2amRNA、miR-25-3p/5p的表达水平和SERCA2a活性、血浆脑钠肽水平、心输出量和射血分数。结果：模型组大鼠心输出量和射血分数显著降低,心肌SERCA2a mRNA表达水平和活性降低,miR-25-3p和miR-25-5p的表达水平、血浆脑钠肽水平显著升高;泻肺利水中药能提高心肌SERCA2a mRNA表达水平和活性,降低miR-25-3p和miR-25-5p的表达水平,降低血浆脑钠肽水平,提高心输出量和射血分数;卡托普利能提高心肌SERCA2a mRNA表达水平,降低miR-25-3p和miR-25-5p的表达水平,降低血浆脑钠肽水平,提高心输出量;地高辛能提高心肌SERCA2a mRNA表达水平,降低血清脑钠肽水平,提高心输出量。结论：心力衰竭大鼠心肌SERCA2a mRNA的表达下调,miR-25-3p和miR-25-5p的表达上调;泻肺利水方药可以上调SERCA2a mRNA的表达,下调心肌miR-25-3p和miR-25-5p的表达,改善心功能。     

靶向钠钾ATP酶α1亚单位shRNA质粒表达载体的构建与筛选

构建编码人钠钾ATP酶(Na+/K+-ATPase)α1 mRNA的短发夹RNA(shRNA)质粒表达载体shRNA-ATP1A1(ATP1A11、ATP1A12和ATP1A13),并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体.设计、合成靶向ATP1A1的3对DNA序列,分别插入Pgenesil-3中构建3个shRNA表达载体,经限制性内切酶酶切和DNA测序鉴定确认.筛选并确定最佳细胞接种量及重组质粒转染量,半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞荧光检测Na+/K+-ATPase α1表达变化;MTT法和流式细胞术检测沉默效果最明显的ATP1A13对HepG2增殖活性和细胞周期的影响.构建的质粒表达载体酶切鉴定均可扩增出预期条带,测序符合设计要求,构建成功.ATP1A12和ATP1A13对所转染的HepG2细胞中Na+/K+-ATPase α1 mRNA和蛋白质表达均有抑制作用,其中ATP1A13最为明显(P<0.05).ATP1A13可抑制HepG2细胞的增殖;转染48和60 h,HepG2细胞细胞周期呈现S期阻滞;实时定量PCR检测ATP1A13敲低HepG2Na+/K+-ATPase α1mRNA呈时间依赖性,72 h后表达降低约90%.试验成功构建靶向钠钾ATP酶α1亚单位的shRNA质粒表达载体,其中shRNA-ATP1A13可显著抑制HepG2细胞增殖引起细胞周期S期阻滞.     

Cdk-5过度表达对Tau蛋白磷酸化的影响

目的 实验旨在细胞水平研究cdk-5过度表达对微管相关蛋白tau的磷酸化的影响。方法 利用基因转染技术建立过度表达cdk-5的鼠成神经瘤细胞株(N2a细胞株),免疫沉淀及酶活性检测法检测cdk-5的酶活性,免疫荧光技术和免疫印迹技术检测细胞内tau蛋白的磷酸化状况。结果 在N2a细胞株转染组中,cdk-5表达增加,并使得抗体tau-1显色减弱,PHF-1显色增强,提示tau蛋白在Ser199/202,Ser396／404位点过度磷酸化。与此同时,cdk-5酶活性较未转染组提高3.5倍。结论 这些结果提示细胞水平的cdk-5的过度表达会导致cdk-5酶活性增加和tau蛋白过度磷酸化,而过度磷酸化的tau蛋白可能参与了AD的病理过程。     

重组人粒细胞集落刺激因子Cdna在哺乳动物细胞中高效表达的研究

利用PCR反应、DNA测序、基因重组等技术,构建了两个表达人粒细胞集落刺激因子cDNA的重组质粒pED－GCSF和pEF－GCSF,两质粒分别转染COS7细胞作瞬时表达,转染CHO－dhfr－细胞作稳定表达。结果两质粒在COS7细胞和CHO细胞均获得了表达,pED－GCSF转染COS7细胞48h、72h的表达量分别为5.2×10⁴pg/ml和2.3×10⁵pg/ml,pEF－GCSF转染COS7细胞后48h、72h的表达量分别为2.8×10⁵pg/ml和1.4×10⁵pg/ml。转染CHO－dhfr－细胞,随着加入的氨甲喋呤(MTX)浓度升高,CHO－dhfr+克隆数减少,但平均每个克隆的rhG－CSF表达量升高,在0.5μmol/L MTX下最高表达rhG－CSF细胞株的量是4.46μg/ml/3d。且表达的rhG－CSF注射小鼠腹腔可提高小鼠外周血白细胞的数量。     

人星状病毒非结构蛋白基因nsP1a/1真核表达载体构建及其在293T细胞中的表达

目的将人星状病毒非结构蛋白ns P1a/1基因连接到真核表达载体上,转染人胚肾上皮细胞48 h后检测其表达。方法设计特异性引物PCR扩增人星状病毒非结构蛋白ns P1a/1片段,分别插入真核表达载体pc DNA3.1(+)和p EGFP-N2载体,构建重组表达质粒pc DNA3.1(+)-ns P1a/1-His和p EGFP-N2-ns P1a/1。在转染试剂PEI的介导下将重组表达质粒分别转染293T细胞,转染48 h后分别在荧光显微镜下观察EGFP的表达以及通过Western blot检测ns P1a/1基因的表达。结果重组表达质粒pc DNA3.1(+)-ns P1a/1-His和p EGFP-N2-ns P1a/1构建成功;转染p EGFP-N2-ns P1a/1后48 h能够在荧光显微镜蓝色激发光下观察到较强的黄绿色荧光;转染pc DNA3.1(+)-ns P1a/1-His后48 h收集细胞进行Western blot检测,能够检测到ns P1a/1-His融合报告基因的表达。结论成功构建了人星状病毒非结构蛋白ns P1a/1基因真核表达质粒,并在人胚肾上皮细胞293T细胞获得表达,为进一步深入研究ns P1a/1在人星状病毒抵御宿主细胞抗病毒天然免疫中是否发挥作用奠定了基础。     

分泌重组抗体的CHO细胞体外培养条件的优化

目的：对生物反应器细胞培养时培养时培养基组成进行优化。方法：以稳定转染了抗CD3人源化抗体的CHO细胞为模型,以无血清培养基经生物反应器高密度细胞培养后分子量小于50kDR的超滤液为基础培养基,在细胞培养板中考察添加氨基酸、丁酸钠、柠檬酸铁等多种成分对细胞生长状态和蛋白表达量的影响、结果：2mmol/L丁酸钠可以有效地诱导蛋白的表达,丁酸钠和柠檬酸铁对于促蛋白表达有协同作用,适量添加培养过程中消耗较快的氨基酸可提高细胞数和蛋白的表达量。结论：利用所述方法可快速优化培养基成分,显著提高生物反应器中细胞的蛋白表达量。     

过量表达Stat3诱导COS7细胞显著的形态变化

信号转导和转录激活蛋白Stat3在细胞的生长、分化、存活和运动过程中扮演重要角色。通过免疫细胞化学染色 ,免疫沉淀结合免疫蛋白质印迹法 ,以及瞬时转染由Stat3特异识别DNA元件所指导的报道基因等技术 ,证明COS7细胞中存在活性Stat3蛋白的表达。Stat3cDNA和报道基因在COS7细胞中的共转染实验表明 ,外源的Stat3蛋白具有DNA结合活性 ,并可增强报道基因的表达。同时 ,过量表达Stat3的COS7细胞呈现显著的细胞形态变化 ,如细胞体积增大、胞体伸出突起 ,有些突起有分枝和伪足。这些结果提示 ,Stat3蛋白在细胞的粘附和迁移 ,以及细胞骨架的重建过程中可能具有重要功能。     

稳定表达脑心肌炎病毒先导蛋白N2a细胞系的建立与鉴定

为建立稳定表达脑心肌炎病毒先导蛋白的N_2a细胞系,本研究应用脂质体介导DNA转染法,将表达脑心肌炎病毒(EMCV)先导(L)蛋白的重组质粒pNTAP-B-L转染至N_2a细胞中,通过筛选G418抗性单克隆细胞,建立能够稳定表达融合蛋白TAP tag-L的N_2a细胞系;利用免疫印迹试验(Western blotting)和间接免疫荧光试验(IFA)对融合蛋白TAP tag-L的表达及细胞内定位情况进行鉴定检测。结果表明EMCV的L基因已经整合进N_2a细胞基因组DNA中且L蛋白在获得的阳性N_2a细胞中稳定表达,表达产物TAP tag-L主要分布在细胞浆内。建立的稳定表达L蛋白的N_2a细胞系,为进一步研究先导蛋白功能及EMCV感染过程中与宿主细胞(N_2a)相互作用蛋白的筛选奠定了基础。