甲状旁腺素促进小鼠软骨细胞成软骨和抑制其终末期分化的实验研究

目的探讨甲状旁腺素(PTH)对小鼠软骨细胞成软骨性的促进作用和终末期分化的抑制作用。方法分离和培养新生小鼠胸骨软骨细胞,经PTH处理,倒置显微镜观察细胞形态的变化;Alcian蓝染色和碱性磷酸酶(ALP)染色方法检测软骨细胞蛋白多糖和ALP的分泌;RT-PCT法和Western blot方法检测细胞内成软骨因子和病理性肥大分化因子基因和蛋白的表达。结果新生小鼠胸骨软骨细胞具有自发成熟分化的特征,与对照组相比,经PTH处理的细胞更接近于软骨细胞形态;PTH明显提高软骨细胞Alcian蓝染色的强度,降低ALP染色的强度;PTH显著提高细胞内Sox9和Aggrecan基因和蛋白的表达,明显降低ALP和Runx2基因和蛋白的表达。结论 PTH具有促进小鼠软骨细胞成软骨和抑制其终末期分化的作用。     

使用透明质酸钠复合海藻酸钠水凝胶球3D培养软骨细胞抑制细胞去分化的研究

目的:验证海藻酸钠(Alginate,Alg)水凝胶球添加透明质酸钠(Sodium hyaluronate,HA)后,对大鼠膝软骨细胞体外3D培养时软骨细胞去分化的抑制情况。方法:用Ⅱ型胶原酶消化法获取2周龄SD大鼠膝关节原代软骨细胞,体外培养传代至P2。细胞分为2组,1组用2%海藻酸钠水凝胶球3D培养(Alg组),另一组用2%海藻酸钠+1%透明质酸钠的水凝胶球3D培养(Alg/HA组),采用正交法制作海藻酸钠水凝胶球。培养14天后,两组各取水凝胶球进行死活细胞染色观察细胞状态。其他水凝胶球收集后用4%多聚甲醛固定,30%蔗糖溶液脱水,OCT(Optimal cutting temperature compound)包埋剂包埋切片,采用苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining,HE染色)、甲苯胺蓝染色观察软骨细胞形态;采用阿利新蓝染色观察对比糖胺聚糖(Glycosaminoglycan,GAG)含量;采用免疫荧光染色对比Ⅱ型胶原(Collagen typeⅡ,ColⅡ)含量;采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测软骨细胞ColⅡ和聚蛋白多糖(Aggrecan,ACAN)的表达情况。结果:死活细胞染色显示两组水凝球内软骨细胞状态良好,几乎无死细胞;阿利新蓝染色显示Alg/HA组与Alg组相比软骨细胞分泌更多的GAG;免疫荧光染色显示Alg/HA组比Alg组软骨细胞内含更多的Ⅱ型胶原;Western blot显示Alg/HA组软骨细胞比Alg组ColⅡ的蛋白表达更多。结论:含透明质酸钠的海藻酸钠水凝胶可以更好地维持软骨细胞的表型,抑制软骨细胞去分化。     

荷叶碱对脂多糖诱导的大鼠软骨细胞炎症的抗炎作用研究

目的探讨荷叶碱对软骨细胞的保护作用及对软骨细胞炎症的抗炎作用。方法取体外分离培养3~5天的SD大鼠膝关节软骨细胞,应用10μg/ml LPS诱导软骨细胞建立体外骨关节炎模型。将实验分为3组,即空白组、模型组(LPS)和实验组(LPS+荷叶碱)。通过活/死细胞(Calcein-AM/EthD-I)双染色,实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR),HE染色(苏木素-伊红),番红O染色,免疫荧光染色,检测荷叶碱抑制软骨细胞外基质降解作用及缓解软骨细胞炎症的作用。结果荷叶碱浓度为10μM时,无明显毒性,Calcein-AM/EthD-I染色表明该浓度对炎症诱导的软骨细胞有保护作用。qRT-PCR表明,与模型组相比,实验组的Col2al表达升高,MMP-13和IL-6表达下降。HE染色(苏木素-伊红)、番红O染色、免疫荧光染色结果表明荷叶碱能够维持软骨细胞的形态,促进软骨细胞蛋白多糖的分泌,抑制MMP-13的表达。结论浓度为10μM的荷叶碱对LPS诱导的软骨细胞有较好保护作用及抗炎作用,无毒副作用。     

软骨寡聚基质蛋白过表达对BMP-2诱导骨髓间充质干细胞分化的影响

目的：研究软骨寡聚基质蛋白（cartilage oligomeric matrix protein,COMP）过表达对BMP-2诱导骨髓间充质干细胞成骨及成软骨分化的影响。方法：BMP-2诱导骨髓间充质干细胞分化,通过脂质体转染含人COMP基因的质粒使骨髓间充质干细胞过表达COMP,采用实时定量PCR和Western blotting分析COMP基因过表达、成骨相关基因Ⅰ型胶原、RUNX2、骨钙蛋白以及成软骨相关基因Ⅱ型胶原、SOX9、蛋白聚糖、X型胶原的表达变化;通过茜素红染色观察成骨终末阶段矿化结节的生成情况,阿利新蓝染色观察细胞基质蛋白多糖的合成情况。结果：质粒转染后骨髓间充质干细胞COMP基因蛋白和mRNA表达水平显著提高（P<0.05）。COMP基因过表达后,成骨标记基因RUNX2、Ⅰ型胶原（Col1a1）mRNA水平均显著低于对照组（P<0.05）,RUNX2、骨钙蛋白（Osteocalcin）蛋白表达水平明显低于对照组（P<0.05）,而成软骨标记基因SOX9、蛋白聚糖（Aggrecan）mRNA水平均显著高于对照组（P<0.05）,SOX9、Ⅱ型胶原（Col2a1）蛋白表达均明显多于对照组（P<0.05）。细胞成骨茜素红染色弱于对照组,而阿利新蓝染色强于对照组。过表达组细胞X型胶原（Col10a1）基因表达显著低于对照组（P<0.05）,结论：骨髓间充质干细胞COMP基因过表达可抑制BMP-2诱导其成骨分化,促进骨髓间充质干细胞成软骨分化,并抑制软骨细胞的成熟肥大,为软骨组织工程研究提供新的方向。     

应用原代软骨细胞与SW1353软骨肉瘤细胞系建立体外骨关节炎模型的效果评价

目的通过比较白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)处理对原代软骨细胞与SW1353软骨肉瘤细胞系增殖活力、炎症因子与炎症通路表达水平变化的影响,为骨关节炎体外研究用细胞提供多重选择。方法免疫细胞化学法与甲苯胺蓝染色分别检测细胞中Ⅱ型胶原与蛋白多糖,鉴定所培养的原代细胞是否为软骨细胞。CCK-8法检测IL-1β(10ng/ml)处理24h、48h、72h对原代软骨细胞增殖活力的影响,IL-1β(1、10、20、40ng/ml)处理24h对SW1353软骨肉瘤细胞系增殖活力的影响。IL-1β(10ng/ml)分别处理原代软骨细胞与SW1353软骨肉瘤细胞系细胞24h后,ELISA法检测细胞培养上清中白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)与基质金属蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13,MMP-13)的表达水平。Real-time PCR法检测核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)mRNA表达水平。结果所培养的原代细胞为原代软骨细胞。IL-1β(10ng/ml)处理可显著抑制原代软骨细胞增殖活力,但IL-1β(1、10、20、40 ng/ml)处理对SW1353软骨肉瘤细胞系增殖活力无明显影响。IL-1β(10ng/ml)处理可使IL-6、MMP-13表达水平及NF-κB mRNA的表达量均显著增加。结论IL-1β作用下原代软骨细胞与SW1353软骨肉瘤细胞系均可表现出骨关节炎样炎症反应,二者均可用于骨关节炎的体外实验研究。     

GGCX基因在兔骨关节炎软骨退变中的作用机制

通过将GGCX慢病毒转染软骨细胞,探讨骨关节炎患者软骨组织中γ-谷氨酰羧化酶(GGCX)基因过度表达对兔骨关节炎(OA)软骨细胞分化的影响及其机制。首先从OA兔体内分离软骨细胞,用茜素红染色标记软骨细胞。然后将分离的软骨细胞分为正常对照组、GGCX过表达组和载体组3组。编码GGCX的慢病毒用于过表达GGCX,流式细胞分析检测出病毒转染后细胞凋亡。实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法用于检测GGCX、基质金属蛋白酶13 (MMP13)、Ⅹ型胶原、Ⅱ型胶原、肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素-1β。慢病毒编码GGCX提高了OA软骨细胞中中GGCS的表达水平,mRNA和蛋白水平都显著升高(p0.05)。GGCX过表达显著增加Ⅱ型胶原,而mRNA和蛋白水平均降低MMP13、Ⅹ型胶原、TNF和IL-1β表达(p0.05)。相对于载体,GGCX过表达抑制了OA软骨细胞的细胞凋亡。GGCX过表达可调节细胞外基质的平衡,促进软骨细胞蛋白多糖合成,这与细胞凋亡减少有关。     

白藜芦醇对软骨细胞去分化现象的作用机制

该实验观察白藜芦醇(Resveratrol,Resv)对兔关节软骨细胞去分化现象的作用并探讨其可能的机制。首先,在无菌条件下取4周龄兔关节软骨细胞,行软骨细胞鉴定后将细胞随机分成5组:空白组、0μmol/L Resv组、2.5μmol/L Resv组、5μmol/L Resv组和10μmol/L Resv,体外单层培养传代至第5代。分别取P1、P3、P5代细胞在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,倒置相差显微镜下观察到各组P1代软骨细胞形态基本一致,P3、P5代2.5μmol/L Resv组细胞形态变化不大,其余各组细胞出现胞体变大,胞浆变淡,镜下胞核不明显等衰老的形态变化;Alcian Blue染色检测蛋白聚糖(Aggrecan)含量和β-半乳糖苷酶染色检测衰老软骨细胞,各组P1代细胞Alcian Blue染色和β-半乳糖苷酶染色无明显差别,P3、P5代2.5μmol/L白藜芦醇组较其他组明显深染、衰老软骨细胞数明显减少;RT-PCR检测蛋白多糖(Aggrecan),沉默信息调节因子1(SIRT1),抑癌基因p53、p21以及P16的表达,2.5μmol/L Resv组的Aggrecan和SIRT1基因表达明显上调,P53、P21及P16基因表达显著下调。综上所述:低浓度白藜芦醇(2.5μmol/L)可能通过上调SIRT1,下调P53、P21、P16基因的表达抑制软骨细胞去分化的现象。     

γ-谷氨酰羧化酶基因过表达对兔骨关节炎软骨细胞分化的影响

通过将GGCX慢病毒转染软骨细胞,探讨骨关节炎患者软骨组织中γ-谷氨酰羧化酶(GGCX)基因过度表达对兔骨关节炎(OA)软骨细胞分化的影响及其机制。本研究首先从OA兔体内分离软骨细胞,用茜素红染色标记软骨细胞。然后将分离的软骨细胞分为正常对照组、GGCX过表达组和载体组3组。编码GGCX的慢病毒用于过表达GGCX,流式细胞分析检测出病毒转染后细胞凋亡。实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法用于检测GGCX、基质金属蛋白酶13 (MMP13)、Ⅹ型胶原、Ⅱ型胶原、肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素-1β。慢病毒编码GGCX提高了OA软骨细胞中中GGCS的表达水平,mRNA和蛋白水平都显著升高(p0.05)。正常对照组的凋亡率为26.12%,载体组的凋亡率为26.12%左右,GGCX过表达组的凋亡率为18.17%,GGCX过表达可明显减少软骨细胞细胞凋亡(p0.05)。GGCX过表达显著增加Ⅱ型胶原,而mRNA和蛋白水平均降低MMP13、Ⅹ型胶原、TNF和IL-1β表达(p0.05)。相对于载体,GGCX过表达抑制了OA软骨细胞的细胞凋亡。GGCX过表达可调节细胞外基质的平衡,促进软骨细胞蛋白多糖合成,这与细胞凋亡减少有关。     

人正常及骨关节炎软骨细胞体外培养的对照研究

摘要目的：研究人正常软骨细胞及骨关节炎软骨细胞的体外分离、培养及鉴定方法,对其生物学特性进行对照并评价其生物学活性。方法：取人创伤性截肢与骨关节炎全膝置换的无菌膝关节软骨,采用两步酶消化法分离培养人关节软骨细胞,并进行传代培养。通过倒置相差显微镜下观察细胞形态,绘制生长曲线,测细胞增殖,甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色对细胞进行对照研究。结果：骨关节炎软骨细胞形态似成纤维细胞,生长速度明显较正常软骨细胞慢。MTT测细胞增殖显示,第2．4、6代骨关节炎软骨细胞在相同时间点大都比同代正常软骨细胞增殖速度慢（P〈0．05）。甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫组化染色显示,骨关节炎软骨细胞染色较正常软骨细胞浅,经多次传代后基本无着色。结论：正常软骨细胞5代以内细胞生长良好,生物学特性明显,5代以后出现去分化现象。骨关节炎软骨细胞增殖慢,生物学特征退变旱,符合软骨细胞退变的表现。这为骨关节炎在软骨细胞水平的研究提供了实验基础。     

MiR-127-5p通过靶向调节adipoR1促进骨关节炎软骨细胞的增殖

脂联素（adiponection）与骨关节炎（osteoarthritis, OA）的发病密切相关,且主要通过其受体adipoR1发挥作用。而骨关节炎中脂联素的表达是否受miRNA表达的影响却未见报道。本文旨在研究miR-127-5p对骨关节炎软骨细胞中脂联素及细胞增殖的影响。分离培养人原代OA软骨细胞及对应正常细胞,甲苯胺蓝染色和II型胶原免疫细胞化学染色进行鉴定。 Real-time PCR结果表明,OA软骨细胞中miR-127-5p的表达与正常软骨细胞中的相比较显著下降。MiR-127-5p转染可显著降低荧光素酶报告基因的荧光强度（P<0.05）,表明adipoR1为miR-127-5p的靶向基因。MiR-127-5p mimic转染软骨细胞后,MTT法研究结果表明,miR-127-5p mimic 可显著促进软骨细胞增殖,Western 印迹结果表明,脂联素及其受体（adipoR1）表达显著上升,p65的表达以及p38、ERK1/2以及IkBα的磷酸化水平显著下降。ELISA结果表明,MMP-1、MMP-3、MMP-13的含量显著下降。实验结果提示,miR-127-5p通过靶向下调adipoR1及脂联素的表达,促进软骨细胞增殖,并且抑制NF-κB信号通路,进而抑制炎性反应。     

microRNA-15a模拟物对人关节软骨细胞增殖与凋亡的影响

目的：近年来研究表明,关节软骨细胞凋亡在骨关节炎发病过程中起到了重要的作用,本文旨在探讨microma-15a模拟物对于原代人膝关节软骨细胞增殖与凋亡的影响。方法：取人外伤性截肢后的膝关节软骨,采用双酶消化法分离获得人膝关节软骨细胞,并进行体外培养,通过甲苯胺蓝染色和II型胶原免疫细胞化学染色进行软骨细胞鉴定。将培养的软骨细胞传代后取第l代细胞,分为实验组和对照组,实验组采用mir．15a模拟物（has．mir-15amimics）转染软骨细胞,上调软骨细胞内mir-15a的表达量;对照组分为阴性对照组、空白对照组。采用MTT法测定细胞增殖曲线,流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果：原代细胞中细胞呈多角形、圆形与梭型,贴壁生长;甲苯胺蓝染色胞质呈深蓝色,II型胶原染色胞质呈黄褐色,为特异性染色。经统计学分析,实验组与对照组相比增殖速率明显下降（P〈0．05）。实验组凋亡率（7．13％±0．57）与阴性对照组凋亡率（2．66％±0．15）相比明显增高（P〈0．05）。结论：采用双酶消化法成功分离并培养具有生物学特性的原代人膝关节软骨细胞,通过转染mir-15a模拟物外源性增加关节软骨细胞内mir．15a表达量可显著促进其凋亡并抑制其增殖,为阐明骨关节炎发病机制提供了新的理论依据,为’临床治疗提供了新的靶点。     

TGF-β1调控GATA3促进骨关节炎中软骨细胞钙化

[目的]探究TGF-β1与GATA3对骨关节炎中软骨细胞钙化的影响。[方法]收集外伤及骨关节炎患者的膝关节软骨组织并分离软骨原代细胞,将软骨细胞分为正常组和研究组。用SB-431542或K-7174干扰软骨细胞中TGF-β1/GATA3的表达。用钙化诱导培养基使软骨细胞发生钙化。通过蛋白免疫印迹实验和实时荧光定量PCR实验分析软骨细胞中TGF-β1/GATA3的表达。通过茜素红染色统计细胞钙化水平。[结果]与正常组软骨细胞比较,OA组患者软骨细胞TGF-β1和GATA3的表达水平和钙化水平显著增加(1.01±0.02 vs 2.98±0.03;0.91±0.05 vs 2.33±0.11;P<0.05);与PBS组比较,K-7174组软骨细胞的ALP和COLX的表达水平(2.18±0.05 vs 0.91±0.06;2.83±0.03 vs 0.46±0.01)以及钙化细胞数量显著降低(0.63±0.03 vs 0.25±0.01;P<0.05);与PBS组比较,SB-431542组软骨细胞的ALP和COLX的表达水平(1.01±0.02 vs 0.46±0.05;1.05...     

Wnt/β-catenin信号通路活化的人滑膜细胞对软骨细胞的影响

目的:研究Wnt/β-catenin信号通路活化的人滑膜细胞对软骨细胞的作用探讨骨关节炎(OA)发生及进展的可能途径和分子机制。方法:β-catenin过表达慢病毒载体转染正常人滑膜细胞,荧光显微镜观察病毒转染情况.Western blot方法:检测滑膜细胞核内β-catenin蛋白表达。Transwell小室共培养人滑膜细胞与正常人软骨细胞,倒置显微镜观察滑膜细胞对软骨细胞生长形态变化的影响。酶联免疫吸附(ELISA)法检测不同时间点共培养体系中软骨细胞培养上清液中MMP-7的变化找出MMP-7变化最明显的时间点。同时在最佳时间点ELISA方法:检测软骨细胞培养上清液CTX-Ⅱ、COMP的水平。结果:慢病毒转染滑膜细胞后茨光显微镜下可见多数滑膜细胞表达荧光.Western blot检测发现滑膜细胞胞浆及胞核中β-catenin表达明显上调(P0.01)。通路活化的人滑膜细胞与软骨细胞共培养后,光镜下观察软骨细胞生长形态变化不明显,但随共培养时间的延长软骨细胞生长受到抑制胞体边缘发白壁强度降低。ELISA结果:显示通路活化的人滑膜细胞与软骨细胞共培养后软骨细胞上清液中MMP-7表达明显升高,与正常组相比有显著差异(P0.01)软骨细胞上清液MMP-7的变化有一定的时间依赖性在共培养2h、6h、12h时逐渐升高;24h时略有降低且在共培养6h时变化最为明显。而共培养6h时通路激活组软骨细胞培养上清液中COMP、CTX-Ⅱ水平与正常对照组相比均明显升高(P0.01)。结论:β-catenin过表达慢病毒转染正常人滑膜细胞可成功激活Wnt/β-catenin信号通路,Wnt/β-catenin信号通路活化的滑膜细胞可影响正常软骨细胞的生长,并引起滑膜-软骨体系内环境异常,促使软骨基质的降解这可能是滑膜炎促进OA发生、发展的机制之一。     

RANKL在人乳牙根生理性吸收不同时期不同细胞的表达

目的：探讨核因子KB受体活化剂配体（receptor activator of the nuclear factor—κappa Bligand,RANKL）在人乳牙根消失不同时间段牙髓细胞内的表达及分化。方法：临床选取牙根生理早中晚期的乳牙各10颗,用原位杂交方法检测RANKL细胞因子在人的乳牙根消失的时候不同时期牙髓细胞内的mRNA表达情况。结果：牙髓细胞、成牙本质细胞RANKL原位杂交染色阳性,表达比对照组高（P〈0．05）。消失比较早的时候与消失中、晚的时候,比较各种细胞内RANKL表达差异有统计学意义（P〈0．05）,而消失中间的时候和消失比较晚的各种细胞内的RANKL表达差异无统计学意义（P〉0．05）。结论：RANKL参与了乳牙牙根的消失过程,牙髓细胞、成牙本质细胞可能促进了破骨细胞分化成熟。     

马的骨髓间充质干细胞诱导为软骨 细胞和成骨细胞及其鉴定

本研究旨在将建立的马(Equuscaballus)骨髓间充质干细胞诱导分化为成骨细胞和软骨细胞。通过原代细胞培养获取马的骨髓间充质干细胞,并对第3代(P3)纯化细胞进行干细胞特性鉴定,之后诱导其向不同细胞分化并对诱导分化的细胞进行染色和特异性基因表达的鉴定。实验结果显示,获得的马骨髓细胞表达了干细胞转录因子和间充质干细胞表面标记物,确定获得的细胞为马骨髓间充质干细胞。P3代细胞经诱导培养后由长梭形转变为"骨结节"形态的成骨细胞和"铺路石"形态的软骨细胞。茜素红将诱导的成骨细胞团染成红色,并随着时间的递增红色"骨结节"逐步增大;阿尔新蓝则将蛋白聚糖和透明质酸等含量丰富的诱导细胞染为蓝色,并且随着诱导天数的增加被染成蓝色的软骨细胞逐渐增多,而对照组细胞未见着色。实时荧光定量PCR检测发现,成骨细胞中Col和ALPL基因的表达量随诱导时间的延长发生明显变化;普通PCR结果显示,在诱导的软骨细胞中扩增获得了collagenⅡ、aggrecan和Sox9软骨特异基因,而对照组细胞不表达特异基因。综上所述,本实验建立了马骨髓间充质干细胞并成功将其诱导分化为成骨细胞和软骨细胞,为骨组织缺损修复和软骨细胞的治疗提供了实验基础。     

8-异戊烯基柑橘素促进体外培养成骨细胞成熟矿化的研究

研究8-异戊烯基柑橘素对体外培养大鼠颅骨成骨细胞(rat skull osteoblasts,ROB)的分化成熟及生物矿化的影响.取新生大鼠颅骨多次酶消化法得到成骨细胞,培养于含10%FBS的MEM培养液中,3天后首次换液,待细胞铺满皿底传代培养.以碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)为检测指标,96孔板梯度筛选作用最佳浓度,在最佳浓度作用并成骨性诱导培养的第3、6、9、12天测ALP活性、钙盐沉积量;第12天进行ALP和钙化结节组织化学染色及计数;成骨性诱导后不同时间点提取Total RNA,RT real-time PCR法检测成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、成骨相关转录因子Osterix、Runx-2和骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的基因表达情况;成骨性诱导的第4、8、12天裂解获得细胞总蛋白,蛋白质印迹法检测人Ⅰ型胶原蛋白(COL-Ⅰ)的蛋白质表达量.研究结果表明:1×10-6 mol/L能显著促进成骨细胞的成熟分化,表现为提高ROB的ALP活性、促进钙盐沉积、增加钙化结节数量;提高bFGF、IGF-1、Osterix、Runx-2和BMP-2 mRNA表达水平;促进COL-Ⅰ的合成.由此可知终浓度为1×10-6 mol/L 8-异戊烯基柑橘素能显著促进ROB的分化成熟及生物矿化,证明8-异戊烯基柑橘素能促进成骨细胞的分化成熟及生物矿化,作为促进骨修复和抗骨质疏松的有效成分具有较大的药用价值.     

淫羊藿素促进BMSCs成软骨分化的研究北大核心CSCD

研究淫羊藿素在GDF-5诱导BMSCs成软骨分化过程中的作用。全骨髓贴壁法分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),取P3代细胞随机分成4组:对照组,淫羊藿素(Icaritin)组,Growth differentiation factor 5(GDF-5)组,Icaritin+GDF-5联合组。连续诱导培养14 d,倒置相差显微镜观察细胞形态,Alcian Blue染色检测细胞的蛋白聚糖改变,RT-PCR检测软骨分化标记基因Aggrecan、COL2、Sox9及COL1的表达情况,Western Blot检测COL2和COL1蛋白表达水平。结果提示,与对照组及GDF-5组相比,Icaritin+GDF-5联合组蛋白聚糖染色更深;软骨分化标记基因Aggrecan、COL2、Sox9明显增加;Ⅱ型胶原蛋白表达量均明显增加。淫羊藿素能够促进GDF-5诱导BMSCs成软骨分化。     

Wnt/beta-catenin 信号通路活化的人滑膜细胞对软骨细胞的影响

目的：研究Wnt/beta-catenin 信号通路活化的人滑膜细胞对软骨细胞的作用,探讨骨关节炎（OA）发生及进展的可能途径和分子 机制。方法：beta-catenin 过表达慢病毒载体转染正常人滑膜细胞,荧光显微镜观察病毒转染情况,Western blot方法检测滑膜细胞核 内beta-catenin 蛋白表达。Transwell 小室共培养人滑膜细胞与正常人软骨细胞,倒置显微镜观察滑膜细胞对软骨细胞生长形态变化 的影响。酶联免疫吸附（ELISA）法检测不同时间点共培养体系中软骨细胞培养上清液中MMP-7 的变化,找出MMP-7 变化最明 显的时间点。同时在最佳时间点ELISA 方法检测软骨细胞培养上清液CTX-II、COMP的水平。结果：慢病毒转染滑膜细胞后,荧 光显微镜下可见多数滑膜细胞表达荧光,Western blot检测发现滑膜细胞胞浆及胞核中茁-catenin 表达明显上调（P<0.01）。通路活 化的人滑膜细胞与软骨细胞共培养后,光镜下观察软骨细胞生长形态变化不明显,但随共培养时间的延长软骨细胞生长受到抑 制,胞体边缘发白,贴壁强度降低。ELISA 结果显示通路活化的人滑膜细胞与软骨细胞共培养后软骨细胞上清液中MMP-7表达 明显升高,与正常组相比有显著差异（P<0.01）,软骨细胞上清液MMP-7 的变化有一定的时间依赖性,在共培养2 h、6 h、12 h时逐 渐升高,24 h 时略有降低,且在共培养6 h 时变化最为明显。而共培养6 h时通路激活组软骨细胞培养上清液中COMP、CTX-II水 平与正常对照组相比均明显升高（P<0.01）。结论：茁-catenin 过表达慢病毒转染正常人滑膜细胞可成功激活Wnt/茁-catenin 信号通 路,Wnt/茁-catenin 信号通路活化的滑膜细胞可影响正常软骨细胞的生长,并引起滑膜- 软骨体系内环境异常,促使软骨基质的降 解,这可能是滑膜炎促进OA 发生、发展的机制之一。     

淫羊藿素促进BMSCs成软骨分化的研究

研究淫羊藿素在GDF-5诱导BMSCs成软骨分化过程中的作用。全骨髓贴壁法分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),取P3代细胞随机分成4组:对照组,淫羊藿素(Icaritin)组,Growth differentiation factor 5(GDF-5)组,Icaritin+GDF-5联合组。连续诱导培养14 d,倒置相差显微镜观察细胞形态,Alcian Blue染色检测细胞的蛋白聚糖改变,RT-PCR检测软骨分化标记基因Aggrecan、COL2、Sox9及COL1的表达情况,Western Blot检测COL2和COL1蛋白表达水平。结果提示,与对照组及GDF-5组相比,Icaritin+GDF-5联合组蛋白聚糖染色更深;软骨分化标记基因Aggrecan、COL2、Sox9明显增加;Ⅱ型胶原蛋白表达量均明显增加。淫羊藿素能够促进GDF-5诱导BMSCs成软骨分化。