大黄鱼肝表达抗菌肽2基因的克隆和原核表达

抗菌肽是在多种细胞中表达具有抗菌活性的肽类物质的总称,在免疫反应中发挥着非常重要的作用.通过同源克隆法克隆到大黄鱼肝脏表达的抗菌肽2(liver-expressed antimicrobial peptide-2,LEAP-2)基因的完整开放阅读框(Opening Reading Frame,ORF).克隆到的大黄鱼LEAP-2全长2236 bp,包含外显子Ⅰ78 bp,内含子Ⅰ880 bp,外显子Ⅱ179 bp,内含子Ⅱ1044 bp,外显子Ⅲ55 bp,编码序列312 bp,编码103个氨基酸.推断的氨基酸序列羧基端区域存在高度保守的4 个半胱氨酸残基,符合LEAP-2超家族的结构特征.同源性对比后显示LEAP-2基因在进化上高度保守,大黄鱼LEAP-2推断的氨基酸序列与牙鲆、黄颡鱼、蓝色鲶鱼和斑点叉尾鮰等鱼类之间的同源性均在95%以上.将大黄鱼LEAP-2 cDNA连接到pET-32a(+),构建了重组表达质粒pET-32a-LEAP-2,将其转化到大肠杆菌BL21上并用1.0 mmol/L IPTG诱导表达,获得了大小约为27 kDa的重组蛋白,与预期的一致.     

大黄鱼Follistatin基因克隆及表达分析

卵泡抑素(follistatin,FST)是转化生长因子β(Transforming growth factor-β)超家族成员之一,在动物肌肉生长中起重要作用。采用RT-PCR、RACE和常规PCR技术克隆了大黄鱼FST基因。获得的基因序列长3195 bp,其中5’非编码区96 bp,3’非编码区47 bp,含5个外显子及4个内含子。该基因开放阅读框972 bp,编码323个氨基酸,其中信号肽31个氨基酸,成熟肽292个氨基酸。Blast结果表明,大黄鱼FST基因与金鲷FST基因的核苷酸及蛋白序列同源性最高,分别达到96%和99%。FST基因在大黄鱼脑、眼、鳃、肾等多个组织中表达,其中鳃组织的表达量最高,脾组织中表达最低。检测水温19℃、25℃、30℃时大黄鱼不同组织FST基因表达量,眼和肌肉组织中FST基因表达量变化显著,推测FST基因可能在鱼类生长发育中发挥重要作用。     

大黄鱼CCT基因的克隆及其表达量随稚鱼生长发育的变化

研究旨在克隆大黄鱼磷脂酰胆碱合成关键基因磷脂酰胆碱胞苷转移酶 (CCT)基因全长, 并检测其表达量随稚鱼生长发育的变化。利用同源克隆技术和RACE技术从大黄鱼肝脏中成功扩增出CCT的全长。同时应用real-time PCR法检测不同日龄大黄鱼稚鱼CCT的表达变化。序列分析表明, CCT全长2419 bp(Genbank登录号: KF006239.1), 包括273 bp 的5'端非编码区, 1107 bp的开放阅读框, 1010 bp的3'端非编码区,共编码369个氨基酸。系统进化树分析表明, 相比其他物种, 大黄鱼CCT基因与红鳍东方鲀的亲缘关系较近。定量结果表明, 孵化后, 大黄鱼仔稚鱼CCT的表达量随日龄的变化先显著升高, 在15日龄时达到最大值,随后显著下降并趋于平稳, CCT基因表达量的变化趋势与大黄鱼稚鱼消化系统的发育密切相关。     

大黄鱼Flotillin-1基因分子特征分析

浮舰蛋白-1(Flotillin-1)是属于SPFH家族的蛋白,是重要的脂筏标志性蛋白.在构建大黄鱼(Larimichthys crocea)肌肉组织cDNA文库的基础上,克隆了Flotillin-1基因,并进一步扩增出内含子.克隆到的序列全长为2497 bp,其中编码区1194 bp,编码397个氨基酸.生物信息学分析大黄鱼Flotillin-1有5类20个功能位点,存在2次跨膜结构,N端和C端都位于细胞膜内.大黄鱼Flotillin-1氨基酸序列具有非常高的保守性,与大西洋鲑和斑马鱼的同源性都在80%以上.在组织中的表达也非常广泛,其中在脾中的表达最强.     

棉花GhZIP4基因的克隆及表达分析

根据EST拼接的序列设计引物,利用RT-PCR和PCR方法,从陆地棉‘苏棉18’-cDNA和基因组DNA中分别克隆获得了GhZIP4基因片段.结果表明:(1)GhZIP4基因cDNA序列全长1 487 bp,包含1 269 bp ORF,编码422个氨基酸残基,其氨基酸序列具有典型的ZIP蛋白特征,预测具有8个跨膜结构域,第Ⅲ和第Ⅳ跨膜结构域间存在可变区,在可变区有2个富含His的结构域“HRHSHPHG”和“HSHGHGHD”.(2)氨基酸进化树分析显示,GhZIP4同拟南芥ZIP家族AtZIP4的相似性较高.(3)GhZIP4 DNA序列编码区全长1 778 bp,包含4个外显子和3个内含子,所有外显子/内含子交接点都遵从gt/ag剪接规则.(4)半定量分析显示,GhZIP4基因在茎中表达量最高,表明该基因有可能在某些金属离子地上部和根部的动态平衡分布过程中具有重要作用.     

高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆、结构分析及其功能的研究

从高山被孢霉ATCC1 62 66总DNA中扩增出大小为 1 374bp和 1 947bp的两条特异片段 ,序列分析表明后者在细胞色素b5和组氨酸Ⅰ之间含有一大小为 5 73bp的内含子和两条分别为 1 97bp和 82 8bp的外显子。推导的氨基酸二级结构分析表明 ,该基因有两个长的跨膜疏水区和 3个组氨酸保守区。分别根据D6D内含子及组氨酸Ⅱ区、Ⅲ区的序列设计引物 ,制备不同的探针与高山被孢霉的基因组杂交 ,证明在其基因组中确实存在两个Δ6 脂肪酸脱氢酶基因 ,其中一个基因含有内含子。把不含有内含子的核基因MAGL6 1克隆到的酿酒酵母表达载体pYES2 0中 ,转化到酿酒酵母INVSc1中。对筛选得到的酵母工程菌株进行脂肪酸GC分析 ,检测到了γ 亚麻酸 ,说明克隆的D6D基因MAGL6 1能在酿酒酵母中进行功能性表达。     

温度和病菌感染对大黄鱼HSP67B2基因表达的影响

热激蛋白普遍存在于生物体内,是进化上非常保守的蛋白家族,可作为分子伴侣,并抑制细胞凋亡,提高生物体的耐热性.克隆了大黄鱼HSP67B2基因,并分析了温度和病菌对其表达的影响.获得的大黄鱼HSP67B2序列全长2325 bp,包括4个外显子和3个内含子,其中开放阅读框为525 bp,编码174个氨基酸.随着温度的改变,大黄鱼不同组织HSP67B2基因的表达呈现出不同的变化.24℃时HSP67B2在肌肉和肝组织中表达量最高,29℃时在肠和眼表达量最高.用恶臭假单胞菌感染大黄鱼,48 h时HSP67B2在肠和脾中表达量明显升高;而感染7 d后,肝、肠和脑中表达量明显升高.     

草鱼CD81基因的克隆及功能分析

为研究白细胞表面分化抗原81(CD81)的功能, 对草鱼CD81进行了克隆, CD81全长共1376 bp, 其中5'非翻译区87 bp, 3'非翻译区581 bp, 开放阅读框为708 bp, 包括8个外显子, 7个内含子, 编码235个氨基酸。实验采用实时荧光定量PCR的方法检测了CD81在健康草鱼不同组织中的表达情况及草鱼出血病病毒(GCRV)攻毒前后的表达变化情况。结果显示草鱼CD81在所有被检测组织中均有表达, 在头肾中表达量最高。在GCRV攻毒前后草鱼鳃、脾、肝、肠及头肾5个组织中的CD81表达量均有明显变化。同时, 采用绿色荧光蛋白(GFP)来示踪CD81的亚细胞表达部位, 激光共聚焦显微镜显示, 同人类一样, 草鱼CD81定位于细胞膜上。       

棉花咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因的克隆及表达

根据棉花纤维特异表达cDNA文库分析得到的咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)基因EST序列设计引物,采用RT-PCR技术首次从棉花中克隆了一个CCoAOMT基因,命名为GhCCoAOMT1(GenBank登录号为FJ848871).研究结果表明:GhCCoAOMT1基因cDNA全长960 bp,具有一个753 bp的开放阅读框,5'非编码区为9 bp,3'非编码区为198 bp,编码250个氨基酸,预测分子量约为28.306 kDa,等电点为5.39.利用PCR方法克隆了GhCCoAOMT1基因的基因组序列,长度为1 311 bp,包含5个外显子和4个内含子.氨基酸同源性分析发现,GhCCoAOMT1与来自毛白杨、烟草和苎麻的CCoAOMT同源性较高.半定量RT-PCR检测表明,GhCCoAOMT1基因在棉花各个组织中都有表达,其中茎部的表达量最高,其次表达量依次为根>花瓣>子叶>10 d纤维>雄蕊>胚珠>叶.     

牦牛HSFY基因的克隆及其结构分析

Y染色体上的热休克转录因子(HSFY)是精子发生障碍的候选基因之一。通过克隆牦牛HSFY基因,并与普通牛Y染色体上的84条HSFY序列比对。结果表明:牦牛HSFY基因由2个外显子和1个内含子组成,与普通牛基因组中的相应序列的一致性高达99.54%。牦牛、普通牛的该基因具有4处插入/缺失,且序列与其相邻序列极为相似。在1 012-1 020 bp(Ⅰ)处有AAAGAAGA/TG等9个核苷酸缺失,位于内含子内;在1 071-1 073 bp(Ⅱ)、1 249-1 251 bp(Ⅲ)处分别有AAG、CCA/C等3个核苷酸缺失,位于第二外显子内,分别导致赖氨酸和组氨酸的缺失;在1 708-1 710 bp(Ⅳ)处有CAA 3个核苷酸缺失,位于3’末端非编码区。在普通牛的84条HSFY基因序列中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ插入/缺失分别有29、3、2、1次。未发现Ⅱ、Ⅲ同时缺失的拷贝,但Ⅱ、Ⅲ缺失均伴有Ⅰ缺失,且导致了蛋白三维结构的变化。牦牛HSFY是在睾丸中表达的多拷贝基因,经密码子偏好性分析,该基因编码的蛋白质偏好使用以A或T结尾的密码子。     

人促红细胞生成素基因组基因和cDNA的克隆及其在COS－7细胞中的表达

利用ＰＣＲ技术,从正常人胎肝染色体ＤＮＡ中克隆到长度为１５７２ｂｐ的人促红细胞生成素（ＥＰＯ）基因组基因片段,它包含除第一个外显子和第一个内含子外所有外显子及内含子。再人工合成１３ｂｐ外显子１的编码区,并与１５７２ｂｐ片段拼接,从而得到除第一个内含子的人促红细胞生成素基因组基因。将克隆得到的ＥＰＯ基因插入载体ｐＳＶ２－ｄｈｆｒ得到ｐＳＶ２－ＥＰＯ表达载体,转染ＣＯＳ－７细胞后获得高效表达。利用自行研制的小鼠抗人ＥＰＯ单抗及兔抗人ＥＰＯ多抗,对表达产物进行ＥＬＩＳＡ定量测定,细胞分泌ＥＰＯ量高达２５１±７Ｕ／ｍｌ．Ｋｒｙｓｔａｌ法测得体外生物活性２４１．５±６．５Ｕ／ｍｌ．用ＥＰＯ单抗免疫沉淀结合ＳＤＳ－ＰＡＧＥ对转染细胞的表达产物做了进一步鉴定,清晰地看到了ＥＰＯ条带。从高效表达ＥＰＯ的转染细胞中分离纯化ｍＲＮＡ,用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增并克隆到ＥＰＯ的ｃＤＮＡ,这为ＥＰＯ在其它系统中的表达及ＥＰＯ的功能与结构的研究打下了基础。     

热带爪蟾Hoxa11基因克隆及序列的进化分析

 H oxa1 1基因是控制脊椎动物肢发育的重要基因 .根据人和鼠 H oxa1 1基因外显子 区和 区的保守序列设计了简并引物 ,采用 PCR法从热带爪蟾基因组 DNA中扩增和克隆到了H oxa1 1基因 ,并测定了核苷酸序列 .克隆的热带爪蟾 H oxa1 1基因片段长 1 598bp,由外显子 、内含子和外显子 三部分组成 ,其中外显子 60 4 bp,外显子 49bp.将该片段的核苷酸序列与人、鼠、斑马鱼 H oxa1 1基因的相应区域进行比较 ,发现该基因的内含子长度存在明显差异 .斑马鱼、热带爪蟾、鼠和人的内含子长度分别为 632 bp,945bp,1 42 1 bp和 1 41 2 bp,随动物进化阶梯的提高而变长 .外显子 区则高度保守 ,都是 49bp,外显子 区在长度上呈现约 1 0 %的变异 .将热带爪蟾 H oxa1 1基因编码的氨基酸序列与人、鼠、斑马鱼进行比较 ,它们之间分别有 67.0 %、66.5%和 46.0 %的同源性 .热带爪蟾与哺乳动物的同源性高于鱼类 ,可能反映了脊椎动物从鳍到肢的进化过程中 ,H oxa1 1基因经历了较多的变异 .     

大黄鱼CD53基因克隆和分子特征分析

白细胞表面抗原CD53属于四跨膜蛋白超家族,在免疫反应中起着重要作用。在构建大黄鱼（Larim ichthyscrocea）肌肉组织cDNA文库的基础上,克隆了CD53基因。克隆到的CD53基因全长1210bp,其中5-′UTR 113bp,3′-UTR 422bp,CDS 675bp,编码224个氨基酸。生物信息学分析显示大黄鱼CD53存在4次跨膜结构,N端和C端都位于细胞膜内,膜外有两个亲水环,跨膜区域为疏水区域,两个N-糖基化位点都位于靠近C端的亲水环上。大黄鱼CD53氨基酸序列具非常高的保守性,与三刺鱼、斑马鱼、虹鳟等多种鱼类的相似性在70%以上。在检测的10种组织中,CD53只在大黄鱼的脾、骨骼肌、肾、肝、肠组织中表达,其中在肠组织中表达最强。     

大黄鱼KLF6基因分子克隆和特征分析

KLF6具有抗细胞增殖的特性,在抑制肿瘤细胞方面起着重要作用.在获得KLF6基因EST序列的基础上,克隆到了KLF6基因,全长1185 bp,其中5′端198 bp,3′端333 bp,开放阅读框654 bp,编码217个氨基酸.与KLF转录因子家族其它成员一样,大黄鱼KLF6的C-端含有3个连续的C2H2型锌指结构域.其氨基酸序列高度保守,与其它鱼类的同源性在90%以上.在检测的大黄鱼骨骼肌、肝脏、眼、脑、脾、心、鳃、肠和肾等9种组织中,KLF6都有不同程度的表达,其中肾、肝脏、鳃、脾脏和脑等组织中的表达量较高.KLF6表达范围的广泛性提示其在多种组织中参与细胞功能活动的调控.     

黄河裸裂尻鱼细胞色素C氧化酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ亚基基因的克隆及序列特征分析

采用RT-PCR技术克隆获得了黄河裸裂尻鱼(Schizopygopsis pylzovi)CO Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ基因的编码序列,并对此进行了初步分析.结果表明,黄河裸裂尻鱼CO I基因全长为1 551 bp,开放阅读框(ORF)由基因全长组成,编码516个氨基酸;COⅡ基因全长为691 bp,开放阅读框为690 bp,编码2...     

东亚钳蝎毒液透明质酸酶全基因序列的克隆和结构分析

本研究通过以东亚钳蝎毒腺为研究材料,采用TRIzol法分离透明质酸酶的全基因序列,并从中分离出4个东亚钳蝎透明质酸酶序列,分别命名为BmHYⅠ、BmHYⅡ、BmHYⅢ和BmHYⅣ。BmHYⅠcDNA全长是1423 bp,包括42 bp的5’非翻译区,1230 bp的开放阅读框,编码了一个410个氨基酸,还有151 bp的3’非翻译区;BmHYⅠ中包含5个糖基化位点;与其它物种蛋白质比对结果显示,BmHYⅠ中有10个高度保守半胱氨酸残基形成5个二硫键。BmHYⅠ在二级结构中形成了13个螺旋和14个折叠,其中折叠主要分布在N端和C端。系统进化树结构表明,东亚钳蝎BmHYⅠ与其它蝎子物种透明质酸酶亲缘关系最近,其次是蜘蛛,最后是脊椎动物。而BmHYⅡ、BmHYⅢ和BmHYⅣ序列缺少终止密码子,蛋白序列与BmHYⅠ具有高度同源性。本研究结果为进一步透明质酸酶的功能提供数据参考。     

猪α-1,3-半乳糖转移酶基因打靶载体的构建

目的:构建猪α-1,3-半乳糖转移酶(GGTA1)基因的正负筛选打靶载体。方法:以原代猪胚胎成纤维细胞基因组DNA为模板,采用长程PCR方法扩增出GGTA1基因的2条片段;以长约2kb包含部分第9外显子的片段为同源短臂,在XbaⅠ和ClaⅠ位点插入pLoxP质粒正筛选标记neo基因的3'端;以长约5.4kb包括部分第8外显子、全部第8内含子及部分第9外显子的片段为同源长臂,于NotⅠ位点插入该质粒中neo基因的5'端;2.7kb的负筛选标记tk基因位于载体中同源短臂的3'端外侧。结果与结论:酶切、PCR及测序结果表明,同源臂被正确连接至质粒pLoxP,成功构建了猪GGTA1基因正负筛选打靶载体pSL/GT。