利用烟草表达人凝血Ⅸ因子(hFIX)的研究

血友病B是凝血Ⅸ因子(hFIX)缺乏所导致的一种出血性疾病,通过输血和hFIX浓缩剂进行治疗疗效显著,但存在治疗费用高和安全隐患,因而获得安全、廉价的人凝血Ⅸ因子对血友病B治疗具有重要意义.植物系统表达外源蛋白在生产成本和安全性方面具有优势.为此,构建含人凝血Ⅸ因子基因(hFIX,2.8kb)植物双元表达载体p35s-2300∷gus∷noster,用农杆菌介导法转化烟草"百日红",通过PCR和Southern blot分析证实获得4株独立转基因植株,hFIX在转基因烟草基因组中的拷贝数为1～4个;RT-PCR和ELISA检测结果表明,hFIX在转录和翻译水平已成功表达,hFIX在转基因烟草叶片中的表达量为2.5～8.8ng/g·FW,并具有免疫活性.为利用植物系统表达hFIX的后续研究作了必要准备,也为利用植物系统表达其他药用蛋白研究提供了一些理论和实验参考.     

利用烟草表达人凝血IX因子 (hFIX)的研究

血友病B是凝血IX因子（hFIX）缺乏所导致的一种出血性疾病,通过输血和hFIX浓缩剂进行治疗疗效显著,但存在治疗费用高和安全隐患,因而获得安全、廉价的人凝血IX因子对血友病B治疗具有重要意义。植物系统表达外源蛋白在生产成本和安全性方面具有优势。为此,本研究构建含人凝血IX因子基因（hFIX,2.8kb）植物双元表达载体p35s-2300：：gus：：noster,用农杆菌介导法转化烟草 "百日红",通过PCR和Southern blot分析证实获得4株独立转基因植株, hFIX在转基因烟草基因组中的拷贝数为1-4个;RT-PCR和ELISA检测结果表明,hFIX在转录和翻译水平已成功表达,hFIX在转基因烟草叶片中的表达量为2.5~8.8ng/g·FW,并具有免疫活性。本研究为利用植物系统表达hFIX的后续研究作了必要准备,也为利用植物系统表达其他药用蛋白研究提供了一些理论和实验参考。     

人凝血IX因子基因乳腺组织特异性表达载体的构建及其在奶山羊乳腺中的分泌性表达

血友病B(Hernophilia B)是由于人凝血IX因子(hFIX)缺乏所致的一种严重出血性疾病。常规治疗方法是通过输血或输入人浓缩凝血IX园子来实现的,因此患者很容易被肝炎病毒甚至爱滋病毒感染。近年来,人们期望通过转基因动物乳腺表达并从乳汁中分离生产hFIX蛋白,以解除血友病患者的痛苦。以转基因动物的乳腺组织即乳腺生物反应器生产外源蛋白具有原核生物,酵母以及离俸真核细胞生产系统所不具备的优点：生产的外源蛋白经过体内加工和修饰,特别是真核蛋白的转译后加工(如糖基化和羧基化)．其生化特性、生物学活性与天然蛋白完全相同^[1];另外从乳汁中生产外源蛋白不需要复杂的工厂设备。因此开展人凝血IX因子乳腺生物反应器的研究具有重要的经济意义和临床应用价值。转基因动物乳腺生物反应器的关键在于外源基因乳腺组织特异性表达载体的构建。我们利用小鼠MAR元件(Matrix attachment regions)．牛的β-casein基因调控顺序,hFIX mini-gene和hFIX cDNA分别建成两种乳腺组织特异性表达载体pMCIXm和pMCIX,经SA脂质体包埋载体DNA后直接转染奶山 羊乳腺小叶,hFIX蛋白在奶山革乳汁中获得瞬间分泌性表达,最高表达量为13.7ng/ml乳汁。其中含hFIX mini-gene的表达载体在奶山羊乳汁中的表达量高于含hFIX cDNA的表达载体．表明hFIX的in-tronl能够提高该基因在活体奶山羊乳腺中的表达。A7单抗和柠檬酸钡吸附检测表明乳汁中的hFIX 蛋白羧基化和活性比率都在90％以上。以上结果肯定了载体构建的正确性．不但为研制hFIX蛋白乳腺生物反应器提供了有效的表达载体,同时也表明利用阳离子SA脂质体包埋质粒DNA直接转染活体物乳腺可以作为验证乳腺表达载体构建正确性的快速检测手段。     

人羊水祖细胞的分离和基因修饰

探讨从孕中期羊水中分离出人羊水祖细胞的有效方法和FIX基因修饰后的效果,为血友病B的产前治疗提供可行的基础。从镜下分离出呈致密克隆生长的梭形细胞集落,经培养传代后,通过第3代慢病毒载体将hFIX导入该细胞,经酶联免疫反应(ELISA)等方法检测hFIX的表达并检测凝血活性。用这种方法得到的羊水祖细胞呈成纤维细胞样,倍增时间为39.05 h,该细胞在不仅在蛋白水平表达干细胞表面分子SSEA4,TRA1-60,在基因水平还可检测到NANOG,OCT4,SOX2mRNA的表达。羊水祖细胞导入hFIX cDNA后,能合成并分泌hFIX蛋白,传代后48 h在上清液中的浓度为20.37%±2.77%,凝血活性16.42%±1.78%。上清液中的浓度在第4天达到平台期,为50.35%±5.42%,凝血活性可达45.34%±4.67%。ELISA检测显示转染后的羊水细胞表达的hFIX蛋白的水平呈现基本稳定趋势,波动幅度较小;同时检测FIX凝血活性也与蛋白浓度呈正相关。从羊水中可以分离得到具有多能性祖细胞,转染了hFIX的羊水祖细胞在体外能持续合成有凝血功能的hFIX蛋白,为血友病B产前治疗的新方法提供了实验依据。     

山羊β-酪蛋白基因启动子指导的转基因小鼠乳汁高效表达人凝血因子IX

为探讨应用转基因动物乳腺生物反应器高效表达人凝血因子IX(human clotting factor IX,hFIX)的可行性,构建了包括山羊β-酪蛋白基因启动子和外显子l、内含子1、外显子2共约6.7kb片段以及hFIX全长cDNA序列和部分经改造的内含子l的乳腺表达载体,通过转基因技术获得12个原代转基因小鼠(9♀,3♂),整合率为11.2%.经EuSA和western b1ot鉴定8只转基因母鼠乳汁中有hFIX的表达并拥有很高的凝血活性,其中一只的表达量高达52.9mg/L,其凝血活性亦高达279.2%.FISH实验表明不同的转基因小鼠外源基因整合于小鼠的不同染色体上.结果证明所构建的山羊β-酪蛋白基因启动子乳腺表达载体能有效指导hFIX基因在小鼠乳腺中高效表达,并能保持hFIX的生物活性.     

人凝血因子IX突变型研究现状

血友病B是一种性连锁隐性遗传病,其发病机制是位于X染色体上的人凝血因子IX(hFIX)基因发生了突变,导致血浆中hFIX含量或活性大幅下降,从而使得内源性凝血途径受到阻碍,无法进行正常的凝血。文章综述了hFIX基因及其编码蛋白质的结构和功能,并分类详细论述了血友病B中发现的几种主要突变类型。其中包括奠基者效应造成的突变、调控区的突变、编码区的突变、内含子剪切位点的突变及另外两种较为特殊的突变,同时介绍了这些突变所造成的生物学效应。最后还简要介绍了一种能提高hFIX蛋白凝血活性的突变类型(第338位Arg→Ala),并对其应用作了展望。     

人凝血因子IX突变型研究现状

血友病B是一种性连锁隐性遗传病,其发病机制是位于X染色体上的人凝血因子IX（hFIX）基因发生了突变,导致血浆中hFIX含量或活性大幅下降,从而使得内源性凝血途径受到阻碍,无法进行正常的凝血。本文综述了hFIX基因及其编码蛋白质的结构和功能,并分类详细论述了血友病B中发现的几种主要突变类型。其中包括奠基者效应造成的突变、调控区的突变、编码区的突变、内含子剪切位点的突变及另外两种较为特殊的突变,同时介绍了这些突变所造成的生物学效应。最后还简要介绍了一种能提高hFIX蛋白凝血活性的突变类型（第338位Arg→Ala）,并对其应用作了展望。     

用无选择标记的转基因烟草表达胸腺素α1（Tα1）

胸腺素α1（thymosin α1,Tα1）作为免疫调节剂在T细胞成熟、分化和功能发挥方面扮演着重要角色,临床主要被用于免疫缺陷、病毒感染和自身免疫性疾病（HBV、HCV、HIV和癌症等）的治疗。由于组织提取Tα1原料限制、化学合成价格昂贵和传统表达系统（原核或转基因动物）存在安全隐患,使Tα1临床应用受限。用烟草表达Tα1,首先按植物偏爱密码子设计合成tα1基因（124bp）并重组串联成4×tα1,构建植物双元表达载体p35s∷4×tα1（含twin T-DNAs）,用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导法转化烟草。PCR和Southern blot结果证实获得了14转基因烟草,并发现靶基因4×tα1与筛选基因npt II在转基因烟草T0代基因组中发生了分别整合。对177株T1代转基因烟草检测,获得了2株仅整合4×tα1而无筛选标记npt II的植株。ELISA结果显示,4×Tα1在转基因烟草叶片中的表达量介于180.46（81#）~756.87 ng/g·fw（86#）,Western blot证实植物源4×Tα1具有免疫活性。MTT实验结果显示,植物源的4×Tα1蛋白具有促进BALB/c鼠脾淋巴细胞增殖的功能,为用安全植物表达系统生产包括Tα1在内的药用蛋白提供重要参考。     

异源表达大豆转录因子GmNF-YA19提高转基因烟草抗旱性

核因子（NF-Y）广泛存在于真核生物中,是一类能够在植物非生物胁迫反应中发挥重要调控作用的转录因子。探究大豆GmNF-YA19的抗旱性及作用机制,为GmNF-YA19在抗旱植物育种中的应用奠定基础。运用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)对GmNF-YA19在非生物胁迫下的表达量进行检测,克隆GmNF-YA19,构建GmNF-YA19植物表达载体并转化烟草,对转基因烟草的抗旱性进行鉴定。RT-q PCR结果显示GmNF-YA19在大豆中能够响应干旱、高盐、低温及外源ABA,且干旱胁迫下GmNF-YA19的表达量升高最显著。以大豆叶片cDNA为模板,通过PCR克隆GmNF-YA19。序列分析结果显示,GmNF-YA19编码一个含有213个氨基酸的蛋白质,预测分子量22.99 kD,预测等电点9.40。Gm NF-YA19蛋白序列包含一个保守的CBF结构域。蛋白系统进化分析表明,GmNF-YA19蛋白与OsNF-YA7蛋白、AtNF-YA4蛋白和AtNF-YA7蛋白亲缘关系较近。共获得4棵转基因烟草植株。在干旱胁迫下,GmNF-YA19的异源表达增强了转基因烟草的抗旱性。与野生型烟草相比,...     

人凝血因子Ⅸ突变型研究现状

血友病B是一种性连锁隐性遗传病,其发病机制是位于X染色体上的人凝血因子Ⅸ(hFIX)基因发生了突变,导致血浆中hFIX含量或活性大幅下降,从而使得内源性凝血途径受到阻碍,无法进行正常的凝血.文章综述了hFIX基因及其编码蛋白质的结构和功能,并分类详细论述了血友病B中发现的几种主要突变类型.其中包括奠基者效应造成的突变、调控区的突变、编码区的突变、内含子剪切位点的突变及另外两种较为特殊的突变,同时介绍了这些突变所造成的生物学效应.最后还简要介绍了一种能提高hFIX蛋白凝血活性的突变类型(第338位Arg→Ala),并对其应用作了展望.