柯萨奇B组病毒在Hep—2细胞内增殖特性的研究

采用ＩＦＡ、ＲＴ－ＰＣＲ法观察了柯萨奇Ｂ组病毒（ＣＢＶ）５型在Ｈｅｐ－２细胞内的增殖动态。ＣＢＶ感染细胞后４ｈ可检出病毒ＲＮＡ,８ｈ可检出病毒抗原,１２ｈ可观察到细胞病变,２０ｈ可检出病毒颗粒。结果为ＣＢＶ增殖特性的研究提供了新的资料,并指出ＰＣＲ是监测ＣＢＶ增殖的敏感方法。     

草鱼呼肠孤病毒在CIK细胞中复制及形态发生的研究

以草鱼呼肠孤病毒(GCRV)感染的草鱼肾细胞系(CIK)为模型,进行了草鱼呼肠孤病毒在细胞内的形态发生的研究.当病毒以感染复数为5～10PFU/CELL感染CIK细胞时,在病毒感染细胞4h以内的切片中,可观察到脱去部分外层衣壳的不完整病毒颗粒.感染细胞8h,可观察到浆胞内病毒发生基质,其内含有大量的直径约50nm的亚病毒颗粒,无外层蛋白结构.感染12～16h后,这些亚病毒颗粒装配上外层蛋白结构,形成直径为72nm左右的成熟的病毒粒子.病毒感染细胞8h后,开始出现典型的病毒包含体,16～20h小时病毒包含体裂解,继而释放出有感染性的子代病毒颗粒.该结果有助于对GCRV致病机理的了解.     

细胞工厂中F基因型腮腺炎病毒SP-A株在人二倍体细胞上的增殖研究

目的利用细胞工厂,探讨F基因型腮腺炎病毒SP-A株在KMB_(17)细胞上的增殖特性,为腮腺炎疫苗的研制提供基础数据。方法分别以体积分数为10%、8%和5%的血清浓度将细胞培养至单层后,观察病毒接种后细胞病变情况,初步确定最低血清含量后;在不含血清培养基条件下,按照不同接种感染复数(multiplicity of infection, MOI)接种细胞,确定病毒增殖峰值后,进一步观察不同吸附条件对病毒增殖的影响;同时进行荧光实时定量PCR,验证病毒增殖变化。结果在体积分数为5%的血清条件下,细胞可生长成致密单层;高MOI(0.500)感染细胞后,在4～5 d内进入增殖高峰,中MOI(0.050)、低MOI(0.005)感染细胞后,在5～6 d进入增殖高峰,维持48 h后,呈现缓慢下降趋势;在比较37℃吸附试验中,非吸附组病毒增殖高峰明显迟于吸附组,荧光实时定量PCR检测结果显示在病毒感染细胞6 d时病毒载量达到峰值。结论 5%新生牛血清即可获得生长状态良好的细胞,MOI对腮腺炎病毒在KMB_(17)细胞株中的增殖有较大的影响,当使用适宜范围的MOI(0.01～0.02),在非吸附的条件下,腮腺炎病毒SP-A株在KMB_(17)株中能够良好地增殖,在病毒培养至7～9 d可获得高滴度的病毒收获液。     

EV71病毒对树鼩原代肾上皮细胞感染模型的建立

目的建立EV71对树鼩原代肾细胞的感染模型。方法胰蛋白酶消化法获得树鼩的原代肾细胞,用EV71感染树鼩肾细胞,测定1、2、4、6和8 d培养上清病毒滴度,分别用Western blot和间接免疫荧光法检测细胞中EV71病毒VP1蛋白的表达,以确定EV71病毒对树鼩原代肾细胞的感染性。结果对分离得到的树鼩原代肾细胞进行传代纯化和形态鉴别,建立以树鼩原代肾细胞为主的细胞培养。用EV71病毒感染树鼩原代肾细胞,感染后48~96 h病毒滴度可达到1.3×10~6TCID_(50)/m L,说明EV71病毒可有效感染树鼩原代肾细胞并有效增殖。Western blot检测发现,EV71病毒VP1蛋白可在感染后2~8 d的树鼩原代肾细胞中有效检出,间接免疫荧光法则在感染后2~6 d细胞的细胞质中检测到病毒VP1蛋白的分布。结论在成功建立树鼩原代肾细胞培养的基础上,确定了EV71病毒对树鼩原代肾细胞的感染性和病毒增殖特性,初步建立了EV71树鼩原代肾细胞感染模型。     

猪瘟病毒中国兔化弱毒疫苗株在原代牛睾丸细胞中增殖特性的研究

以猪瘟病毒中国兔化弱毒疫苗株(CSFV C株)为实验材料,研究该病毒株在原代牛睾丸细胞中增殖的基本特性与规律.找到了一株能够使用免疫荧光技术进行检测的C株猪瘟病毒,并对病毒滴度的测定方法进行了改进,发展完善了荧光斑技术(F-PFU).使用改进的病毒滴度测定方法,对接毒后培养上清中病毒滴度的变化趋势进行检测.在原代牛睾丸细胞中,接毒后5d,几乎所有的细胞都可被病毒感染;释放到培养液中有活性的病毒粒子达到105F-PFU/mL以上,后维持在该水平.对原代细胞中细胞种类随代次增加的变化趋势进行了观察,并对CSFV的增殖特点及生产中出现的一收毒价不稳定、多次收获病毒等现象的机制进行探讨.并对影响猪瘟病毒增殖的因素进行了实验,不仅加深了对猪瘟病毒C株在原代牛睾丸细胞中增殖规律的了解,还为疫苗生产中猪瘟病毒产量的提高提供新的思路.     

检测柯萨奇B病毒RNA的原位RT-PCR技术

建立I检测柯萨奇B病毒（CBV）RNA的原位RT—PCR技术（直接法）,并对CBV（1～6型）感染Hds细胞中的病毒RNA进行检测,同时对照检测了经核酸酶（DNase和RNase）处理后的病毒感染Hthe细胞和非感染的Hds细胞。实验结果表明,经原位RT－PCR扩增后,CBV感染的Hem细胞呈蓝黑着色,阳性信号充满细胞;而非病毒感染的Hem细胞不着色;核酸酶消化实验证实,经RNase作用后CBV感染Hem细胞的原位RT－PCR阳性信号消失,DNase和RN＿共同作用时,阳性信号也消失,但DNase作用个影响阳性信号。说明原位RT～PCR的阳性信号是CBV特异性…     

一株人源性轮状病毒的分离及适应性培养

目的:研究轮状病毒野毒株的分离方法、组织培养适应条件及相应生物学性质.方法:对收集的样品采用胶体金、PCR、PAGE进行轮状病毒定性检测.阳性样品按常规方法处理并进行组织培养分离,对不同传代样品做基因组图谱、基因序列、病毒增殖动力学分析评价,采用轮状病毒P[8]G1型阳性血清进行病毒中和鉴别试验.结果:通过检测为A组轮状病毒,基因组为4∶2∶3∶2排列,基因分型G1P [8]型,在MA104细胞中传代后转至Vero细胞上适应培养可观察到CPE;电镜观察可见典型轮状病毒形态.毒株在Vero细胞上增殖到第10代,复制稳定,且感染性滴度达到7.25 log CCID50/ml,增殖高峰为96h.中和鉴别试验证实病毒培养液只包含轮状病毒,无其他病毒污染.结论:从腹泻样品中分离得到一株人源轮状病毒毒株,命名为ZTR-68株,该分离株具有良好的组织培养适应性,遗传稳定性,为进一步研究其生物学性质和疫苗制备提供了基础.     

蜱传脑炎病毒对人单核细胞的致病性北大核心CSCD

【目的】确定蜱传脑炎病毒(Tick-born encephalitis virus,TBEV)对人单核细胞的感染性及对其复制增殖的影响。【方法】用蜱传脑炎病毒感染单核细胞THP-1,观察细胞病变情况。取不同时间点的细胞培养上清,测定病毒滴度,并用Real Time RT-PCR方法检测病毒核酸;用流式细胞法检测细胞感染率,以确定TBEV在THP-1细胞中的复制增殖情况;同时进行细胞活力检测,以确定TBEV感染后THP-1细胞的变化。【结果】TBEV病毒感染THP-1细胞后,可进行复制增殖,流式细胞法可检测到细胞内的病毒,感染病毒后的单核细胞活力显著降低。【结论】TBEV可在单核细胞THP-1中复制增殖,并可造成细胞活力的显著降低,提示单核细胞可能在TBEV感染机体并扩散至各组织器官过程中发挥了重要作用。     

文山松毛虫质型多角体病毒在Sf21细胞中离体增殖试验

研究了文山松毛虫质型多角体病毒(DpCPV-W)在Sf21细胞中的离体增殖行为,并进行了空斑试验,结果显示DpCPV-W毒株能够在Sf21细胞中增殖,也能在Sf21细胞上形成空斑,并能产生形态正常的病毒多角体.在DpCPV-W中加入基因工程增效蛋白,能显著增加病毒粒子对离体细胞的感染率,增幅达145%.生物测定表明,离体增殖的病毒多角体与虫体增殖的多角体的毒力相当.因此,Sf21细胞可以作为文山松毛虫CPV增殖行为研究的离体细胞系统,也可通过空斑纯化技术对文山松毛虫CPV生产防治的病毒种进行单个病毒粒子的分离纯化.     

生物反应器培养轮状病毒基因重配株Ls条件的优化

目的轮状病毒基因重配株Ls(G3型)在生物反应器微载体培养Vero细胞条件的优化。方法采用3 L生物反应器微载体培养Vero细胞,观察Ls株在不同病毒感染复数(0.001、0.002、0.010、0.040 MOI)、不同温度(34.5℃和35.5℃)、不同病毒收获时间(24和48 h)对病毒增殖的影响。根据病毒滴度和收获量筛选出最适MOI、培养温度及病毒的收获时间。结果以0.002 MOI接种Vero细胞,温度为34.5℃培养病毒,滴度最高达7.50 lg CCID50/m L;48 h可连续收获4次病毒液,且收获总量及病毒滴度均高于24 h。结论通过对Ls株在生物反应器微载体Vero细胞培养条件的优化,获得的病毒液滴度高及连续培养多次收获量增加的有效方法,为进一步规模化培养奠定了基础。     

三重RT-PCR同步检测马铃薯多种病毒影响因素

根据病毒外壳蛋白区序列设计PVX、PVS特异性引物对,根据P1基因区序列设计PVA特异性引物对,应用三重RT-PCR同步检测马铃薯X病毒,马铃薯A病毒及马铃薯S病毒,分别得到562bp、255bp、182bp大小的扩增片段。试验从反转录反应、PCR反应及循环条件3方面讨论了试剂和循环条件对三重RT-PCR同步检测3种病毒的影响。结果表明反转录反应中dNTPs浓度、3种病毒下游引物浓度比例对整个反应影响较大;其次是PCR反应中MgC12浓度和退火温度;反转录时间,循环条件对RT-PCR影响较小。