Identification of flowering genes in strawberry, a perennial SD plant

Background  

We are studying the regulation of flowering in perennial plants by using diploid wild strawberry (Fragaria vesca L.) as a model. Wild strawberry is a facultative short-day plant with an obligatory short-day requirement at temperatures above 15°C. At lower temperatures, however, flowering induction occurs irrespective of photoperiod. In addition to short-day genotypes, everbearing forms of wild strawberry are known. In 'Baron Solemacher' recessive alleles of an unknown repressor, SEASONAL FLOWERING LOCUS (SFL), are responsible for continuous flowering habit. Although flower induction has a central effect on the cropping potential, the molecular control of flowering in strawberries has not been studied and the genetic flowering pathways are still poorly understood. The comparison of everbearing and short-day genotypes of wild strawberry could facilitate our understanding of fundamental molecular mechanisms regulating perennial growth cycle in plants.     

新生SD大鼠岛源性胰岛祖细胞的分离培养与诱导分化

目的：分离培养新生大鼠岛源性胰岛祖细胞,观察GLP-1（7-36）NH2诱导其向成熟细胞分化作用。方法：分离与纯化胰岛,在含20μg／LEGF和20μg／LbFGF的RPMI1640培养基中分离和扩增胰岛祖细胞．用20nmol／LGLP-1（7-36）NH2诱导分化。用原位杂交、免疫细胞化学染色、二硫腙（DTZ）染色和放射免疫分析等方法对的胰岛祖细胞分化前后细胞特征进行初步鉴定。结果：胰岛祖细胞表达Nestin,不表达PDX-1、InsulinmRNA、Insulin、Somatostatin。以GLP-1（7-36）NH2诱导分化后,部分细胞表达PDX-1、胰岛素mRNA、胰岛素、生长抑素,胰岛样细胞团（Ic＆）形成,其周边细胞DTZ着色。分化3周后培养基中胰岛素释放明显增加。结论：在新生SD大鼠胰岛存在有一类胰岛祖细胞,可以被分离并在体外不断扩增。GLP-1（7-36）NH2可以诱导胰岛祖细胞形成有胰岛素分泌功能的胰岛样细胞团。     

戊巴比妥钠、水合氯醛、氨基甲酸乙酯麻醉对雌性SD大鼠血液学指标的影响

目的观察戊巴比妥钠、水合氯醛、氨基甲酸乙酯三种麻醉药物对雌性SD大鼠血液学指标的影响。方法选用戊巴比妥钠（40mg/kg）、水合氯醛（400mg/kg）、氨基甲酸乙酯（1g/kg）腹腔注射麻醉雌性SD大鼠,麻醉20min后眼眶静脉丛取血测定大鼠血液细胞学指标及血液生化指标。结果三种不同药物麻醉雌性SD大鼠20min后,某些血液细胞学指标及血液生化指标与生理盐水对照组相比均有不同程度的差异。结论麻醉药物可对雌性SD大鼠的血液学指标产生影响。     

病毒灭活和SD血浆的制备

建立制备病毒灭活SD血浆的方法。血浆内加入 1%TNBP/ 1%TritonX10 0 ,30℃保温 4h后用反相层析和超滤去除血浆中的TNBP和TritonX10 0。在 30℃保温 15min后血浆内脂包膜病毒全部被杀灭。超滤后的血浆内TNBP和TritonX10 0的含量都低于 5mg/L。SD血浆蛋白含量的改变都在准许的范围内。建立了一种病毒灭活血浆的制备方法。     

瘦素受体基因敲除SD大鼠的表型及病理观察

目的观察CRISPR/Cas9技术建立的肥胖、代谢综合征和糖尿病前期特征的瘦素受体基因敲除大鼠模型的多种参数,为代谢性疾病的分子机制研究和新药研发提供更为理想的动物模型。方法1)定期测定Lepr^-/-大鼠的体重、摄食量、随机血糖和空腹血糖;葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验;血清血脂参数;2)观察14周和18周Lepr^-/-大鼠主要脏器的病理学改变;3)观察脏器脂质沉积情况。结果Lepr^-/-大鼠表现明显肥胖、高摄食量、葡萄糖耐量受损、胰岛素抵抗和血脂异常;14周和18周出现胰岛增生和心脏肌细胞肥大、脂肪肝、肥胖相关性肾病;肝细胞、肾小管上皮细胞和骨骼肌纤维内脂质沉积。结论Lepr^-/-大鼠是代谢性疾病的病因研究和新药研发的理想动物模型。     

罗格列酮对果糖饲养SD大鼠肝肾功能、血脂、血常规的影响

目的:了解罗格列酮(Rosiglitazone)处理果糖饲养的SD大鼠后对肝、肾功能,血常规的影响。方法:将24只成年健康SD大鼠随机分为A、B两组。A组持续喂高果糖饲料1月后再随机分为:①高果糖饲养组;②果糖饲养同时用罗格列酮处理组。B组喂标准饲料1月后随机分为:①对照组;②罗格列酮处理组。采用氧化酶法、放免法等技术方法测定大鼠的空腹血糖、血脂、胰岛素水平,肝功能,肾功能,血常规等指标。结果:与对照组相比:果糖饲养组大鼠直接胆红素、总胆红素、间接胆红素、血糖、胰岛素、总胆固醇、甘油三酯等指标均升高;而总蛋白、钾、钠、氯、胰岛素敏感指数等指标均下降,差异均具有统计学意义(P＜0．05)。而罗格列酮处理组中总胆红素、间接胆红素、尿酸和尿素/肌酐等指标均升高;而总蛋白、球蛋白、钾、钠、氨水平、甘油三酯、血常规细胞数、血红蛋白均下降,差异具有统计学意义(P＜0．05)。与果糖饲养组相比,果糖饲养罗格列酮处理组的总胆红素、直接胆红素、谷草转氨酶、间接胆红素、谷丙转氨酶、总胆固醇均升高;而胰岛素、甘油三酯、钙离子水平均下降差异均具有统计学意义,且前面三个指标的差异更明显(P＜0．05)。结论:罗格列酮在治疗过程中虽改善了果糖饲养SD大鼠所引起的胰岛素抵抗,但会加重肝肾功能障碍;对机体有一定的毒副作用。     

SD大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及鉴定的实验研究

摘要 目的：探讨应用全骨髓贴壁法体外分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs)的可行性,研究其生物学特性,为骨组织工程提供种子细胞。方法：取SPF级5周龄健康SD大鼠2只,脱颈处死,分离双下肢股骨、胫骨,全骨髓贴壁法分离培养、纯化BMSCs;通过倒置显微镜观察原代、传代细胞生长情况、绘制生长、贴壁率曲线,研究其生物学特性;流式细胞仪检测表面标志物、诱导成成骨等方法进行鉴定。结果：应用全骨髓贴壁法可在体外分离出活性好、纯度高的BMSCs。倒置显微镜下可见原代细胞呈梭形、多角形,传代细胞形态均一呈纤维样;P3代BMSCs经流式细胞鉴定：CD44、CD90高表达,CD31、CD45低表达;定向诱导向成骨细胞分化,可见明显矿化结节。结论：证实应用全骨髓贴壁培养法体外可成功分离BMSCs,所分离培养、纯化的细胞生物学稳定,纯度高、活性好,具有多向分化潜能,能为骨组织工程、骨质疏松症和骨折不愈合疾病的研究提供种子细胞。     

疲劳大鼠机体铜、锌变化与其自由基代谢相关性分析

目的:探讨疲劳状态下SD大鼠肝、肾、骨骼肌、血清中铜、锌这两种微量元素的分布变化,并分析其变化与大鼠机体抗氧化能力的相关性变化规律.方法:健康雄性SD大鼠14只,随机分为运动组和对照组,每组7只,运动组采用10d递增负荷的游泳运动方式建立SD大鼠运动疲劳模型,对照组不给予运动,取实验大鼠肝、肾、骨骼肌和血清,经常规消化后,用原子吸收分光光度计测定其铜、锌含量,同时检测相应组织中总超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量,最后进行比较和统计分析.结果:与正常组大鼠比较,疲劳大鼠肝组织和血清铜含量增加(P<0.05),肝组织锌含量增加(P<0.05),血清锌含量以及骨骼肌铜、锌含量减少(P<0.05).肾脏组织铜、锌变化不明显(P>0.05);疲劳组大鼠肝、肾、骨骼肌、血清中超氧化物歧化酶活性下降(P<0.05),丙二醛含量除骨骼肌中变化不明显外,肝、肾、血清中增加(P<0.05);相关性研究发现大鼠肝、血清、骨骼肌的抗氧化能力与其相应组织的铜、锌含量具有相关性(P<0.05).结论:疲劳状态下,大鼠肝、血清、骨骼肌中微量元素铜、锌代谢发生紊乱,影响相应组织抗氧化能力,可能参与了疲劳的形成.     

Primary Structure, sequence analysis, and expression of the thermostable d - hydantoinase from Bacillus stearothermophilus SD1

The gene coding for the thermostable d-hydantoinase from the thermophilic bacterium Bacillus stearothermophilus SD1 was cloned and its nucleotide sequence was completely determined. The d-hydantoinase protein showed considerable amino acid sequence homology (20–28%) with other hydantoinases and functionally related allantoinases and dihydroorotases. Strikingly the sequence of the enzyme from B. stearothermophilus SD1 exhibited greater than 89% identity with hydantoinases from thermophilic bacteria. Despite the extremely high amino acid homology among the hydantoinases from thermophiles, the C-terminal regions of the enzymes were completely different in both sequence and predicted secondary structure, implying that the C-terminal region plays an important role in determining the biochemical properties of the enzymes. Alignment of the sequence of the d-hydantoinase from B. stearothermophilus SD1 with those of other functionally related enzymes revealed four conserved regions, and five histidines and an acidic residue were found to be conserved, suggesting a close evolutionary relationship between all these enzymes.     

赤红球菌二鸟苷酸环化酶基因的克隆、信息学分析和转录变化研究

本研究通过克隆赤红球菌SD3的二鸟苷酸环化酶(DGC)基因,并对该酶进行生物信息学分析,研究其在甲苯和苯酚胁迫下的转录水平变化,为进一步研究该酶和赤红球菌SD3有机溶剂耐受性之间的关系奠定基础。综合使用煮沸法和冻融法提取赤红球菌SD3的总DNA,利用PCR扩增和T载体克隆获得DGC基因序列;利用生物信息学手段对DGC的理化性质和结构特征进行分析;利用邻位相连法构建进化树;采用Discovery studio 3.5将DGC与底物GTP进行分子对接;采用qPCR方法分析DGC基因在甲苯和苯酚胁迫下的转录变化情况。克隆获得了赤红球菌SD3的DGC基因序列,在GenBank中的序列登录号为MH482549。该基因的开放阅读框长为1 332 bp,编码443个氨基酸,预测蛋白分子量为46.95 kD,是疏水性蛋白。无信号肽和二硫键,含有6段跨膜区,第181~316位氨基酸之间存在一个GGDEF保守结构域和c-di-GMP结合抑制位点(Ⅰ位点)。亚细胞定位分析表明,DGC属于质膜蛋白。DGC中超过50%的氨基酸参与形成α螺旋结构。进化树分析表明Rhodococcus ruber SD3和Rhodococcus aetherivorans的DGC聚为一簇,推测赤红球菌SD3的DGC也属于ClassⅢnucleotidyl cyclases家族,具有类似的分子功能。分子对接表明DGC和GTP分子通过疏水作用和氢键产生相互作用。qPCR结果表明在甲苯和苯酚胁迫下,赤红球菌SD3中DGC基因的转录分别上调了1.57倍和8.71倍。研究表明,赤红球菌SD3中的DGC催化GTP产生c-di-GMP,并且DGC基因的转录在有机溶剂胁迫下发生显著上调,这暗示c-di-GMP与赤红球菌SD3的有机溶剂耐受性可能相关。     

丙二醛对大鼠空间学习、记忆能力及海马CA1区超微结构的影响

研究了氧化应激毒性中间产物丙二醛(MDA)对SD大鼠空间学习、记忆的影响。用Morris水迷宫方法研究发现,经侧脑室注射丙二醛的大鼠在定位航行试验中寻找水下平台的逃避潜伏期极显著地延长,同时在空间探索试验中120s内穿台次数减少,说明较高浓度的丙二醛能导致大鼠的空间学习、记忆能力降低。电镜观察研究发现,处理组大鼠海马CA1区神经元细胞内线粒体变形、嵴消失,说明不同浓度的丙二醛在非氧自由基条件下也能直接对大鼠海马CA1区神经元造成一定程度的损伤。     

Energy of cooperative transitions in bacteriophage SD

Heat denaturation of native phages SD suspensions, phage "shadows", and isolated phage DNA solutions were studied by scanning microcalorimetry and viscosimetry. Energetic parameters of cooperative transitions of protein fraction and DNA were measured. DNA melting was shown to be preceded by the destruction of capsid and protein denaturation. The melting curve of isolated DNA and DNA in the presence of protein component is characterized by a fine structure which is completely restored at repeated denaturation only in the presence of the protein component. "Creeping" of DNA out of the capsid in heated suspensions at 50-52 degrees C was shown to proceed with "zero" enthalpy without significant endo- and exo-thermal effects. No change of specific heat capacity of the suspension was also observed. It is emphasized that the mechanism of DNA going out of the capsid can be understood by studying DNA hydration inside the phage and its change in the course of liberation of the phage genome from the protein capsid.     

SD大鼠骨髓间充质干细胞体外原代培养及鉴定

目的:探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外分离培养以及扩增的方法并鉴定。方法:取100g左右雄性SD大鼠后肢股骨、胫骨骨髓,原代全骨髓培养法,多次传代纯化,体外扩增后,观察细胞形态,并免疫组化及流式细胞仪检测cd34、cd90、cd105细胞因子,鉴定是否为BMSCs。结果:所获取的细胞呈长梭形,呈现特征性的漩涡状生长,CD34阴性,CD90、CD105阳性。结论:利用全骨髓培养法成功分离骨髓间充质干细胞,10代以内的细胞纯度高,活性好。全骨髓培养较为简便、易行。     

SD大鼠骨髓间充质干细胞体外原代培养及鉴定

目的：探讨骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外分离培养以及扩增的方法并鉴定。方法：取100g左右雄性SD大鼠后肢股骨、胫骨骨髓,原代全骨髓培养法,多次传代纯化,体外扩增后,观察细胞形态,并免疫组化及流式细胞仪检测cd34、cd90、cd105细胞因子,鉴定是否为BMSCs。结果：所获取的细胞呈长梭形,呈现特征性的漩涡状生长,CD34阴性,CD90、CD105阳性。结论：利用全骨髓培养法成功分离骨髓间充质干细胞,10代以内的细胞纯度高,活性好。全骨髓培养较为简便、易行。     

大鼠胰岛分离、培养条件的优化及miR-126表达的检测方法比较

目的:优化SD大鼠胰岛细胞的分离、纯化和培养方法与条件,为研究miR-126在Ⅱ型糖尿病中的作用机制提供活性与功能良好的胰岛细胞及miR-126表达的检测方法。方法:水合氯醛腹腔注射麻醉SD大鼠,采用8 mL胶原酶Ⅴ(含DNaseⅠ100 U)逆行注射、原位消化后Hitopaque-1077梯度离心分离纯化SD大鼠胰岛细胞,从培养后的胰岛细胞中提取总RNA,分别用加尾法和茎环法进行miR-126的反转录,实时定量PCR(qPCR)检测miR-126的表达量。结果:用该方法可从每只SD大鼠中分离、纯化得到胰岛细胞372±45个,胰岛细胞纯度90%,胰岛细胞存活率95%;用加尾法和茎环法qPCR检测miR-126的Cp值分别为34.56±2.56和32.47±2.01。结论:胶原酶Ⅴ(含DNaseⅠ100 U)逆行注射、原位消化可有效避免因消化时胶状物质的产生而导致的胰岛细胞分离失败,Hitopque-1077梯度离心分离方法具有操作简单、便捷、成功率高等特点,可得到活性与功能较好的胰岛细胞;与加尾法相比,茎环法能够更灵敏地检测胰岛细胞miR-126的表达量。