肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的顺式作用元件及转录因子的鉴定

研究发现,质膜-细胞骨架连接蛋白Ezrin在多种肿瘤细胞中异常表达,而且Ezrin的表达上调与肿瘤细胞的移动侵袭相关,但是调控ezrin基因转录的分子机制却不清楚.为了探明ezrin基因的转录调控机制,以肺癌细胞A549为材料,首先采用双荧光素酶报告基因分析系统检测ezrin基因5′侧翼嵌套缺失序列和位点突变序列的转录活性,鉴定肺癌细胞中ezrin基因的基本启动子区以及关键的顺式作用元件Sp1结合位点(-75/-69)和AP-1结合位点(-64/-58).其次,利用凝胶电泳迁移率变动分析证明,肺癌细胞核蛋白提取物能够与ezrin基因含有关键顺式作用元件的DNA序列结合,形成DNA-核蛋白复合物,而且Sp1结合位点和AP-1结合位点与重组蛋白rhSp1和rhAP-1的结合具有位点特异性.最后,利用瞬时转染实验证实,转录因子Sp1和AP-1(由c-Jun和c-Fos组成的异源二聚体)分别通过Sp1结合位点和AP-1结合位点,增强ezrin基因基本转录活性,而且,过表达转录因子Sp1、c-Jun或c-Fos上调了Ezrin蛋白表达.研究确定,肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的关键顺式作用元件是Sp1结合位点(-75/-69)和AP-1结合位点(-64/-58),与之作用的转录因子Sp1和AP-1对于ezrin基因的转录激活作用至关重要.     

肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的顺式作用元件及转录因子的鉴定

研究发现,质膜-细胞骨架连接蛋白Ezrin在多种肿瘤细胞中异常表达,而且Ezrin的表达上调与肿瘤细胞的移动侵袭相关,但是调控ezrin基因转录的分子机制却不清楚．为了探明ezrin基因的转录调控机制,以肺癌细胞A549为材料,首先采用双荧光素酶报告基因分析系统检测ezrin基因5′侧翼嵌套缺失序列和位点突变序列的转录活性,鉴定肺癌细胞中ezrin基因的基本启动子区以及关键的顺式作用元件Sp1结合位点 (-75/-69) 和AP-1结合位点 (-64/-58)．其次,利用凝胶电泳迁移率变动分析证明,肺癌细胞核蛋白提取物能够与ezrin基因含有关键顺式作用元件的DNA序列结合,形成DNA-核蛋白复合物,而且Sp1结合位点和AP-1结合位点与重组蛋白rhSp1和rhAP-1的结合具有位点特异性．最后,利用瞬时转染实验证实,转录因子Sp1和AP-1 (由c-Jun和c-Fos组成的异源二聚体) 分别通过Sp1结合位点和AP-1结合位点,增强ezrin基因基本转录活性,而且,过表达转录因子Sp1、c-Jun或c-Fos上调了Ezrin蛋白表达．研究确定,肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的关键顺式作用元件是Sp1结合位点 (-75/-69) 和AP-1结合位点 (-64/-58),与之作用的转录因子Sp1和AP-1对于ezrin基因的转录激活作用至关重要．     

人源LDHA基因启动子质粒的构建及在肺癌细胞中Nrf2对其转录表达调控和功能分析

为探索核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)调节肿瘤代谢进而影响肿瘤细胞迁移的分子机制,着重研究了Nrf2对乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A,LDHA)表达的调控。首先成功构建了人源LDHA基因启动子萤火虫荧光素酶报告基因质粒LDHA-luc。将质粒LDHA-luc与Nrf2表达载体共同转染A549细胞,转染后经双荧光素酶报告基因系统检测,显示共转Nrf2质粒时LDHA-luc活性明显要比对照组高;同时,转染Nrf2质粒时LDHA的蛋白质表达水平明显高于对照组,表明在A549细胞中Nrf2促进LDHA的转录和表达。而LDHA的上调会促进酸性肿瘤微环境的形成,促进细胞迁移。因此,成功构建的人源LDHA基因启动子萤火虫荧光素酶报告基因质粒LDHA-luc及探索出的Nrf2对LDHA基因表达的调控,为进一步研究Nrf2通过LDHA影响细胞代谢进而促进细胞迁移奠定了基础。     

PIAS3α过表达对前列腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 研究过表达PIAS3α蛋白对人前列腺癌细胞系DU145细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响.方法 构建pcDNA3.1(+)-HA-PIAS3α真核表达载体,转染前列腺癌细胞系DU145,以蛋白免疫印迹实验检测外源PIAS3α的表达,通过MTT法检测细胞增殖,以流式细胞术分析细胞周期和细胞凋亡.结果 成功构建PIAS3α真核表达质粒,蛋白免疫印迹实验证实外源性PIAS3蛋白质DU145细胞中获得表达.分析目的 蛋白质过表达后的细胞生物学效应,结果显示在DU145细胞中过表达PIAS3α后,细胞增殖受到抑制;同时,细胞周期G0/G1期细胞显著增加,而S期细胞减少,细胞凋亡比率增加.结论 过表达PIAS3α抑制前列腺癌细胞的增殖并诱导其凋亡.     

维甲酸促进小鼠F9细胞中STAT1的反式激活作用

维甲酸能促进肿瘤细胞的凋亡,诱导体外胚胎干细胞的分化,但作用机制的不明使其应用受到极大限制.因此,更多更全面地了解维甲酸的作用机制具有重要意义.本文构建了信号传导与转录激活因子（STAT1和STAT3）的真核表达载体 ,通过免疫荧光染色、电泳迁移率实验以及双荧光素酶报告基因检测系统证明, 维甲酸诱导可以激活转录因子STAT1促使其进入细胞核,并且增强STAT1蛋白与靶基因启动子的结合能力,从而发挥基因表达调控作用.本文结合后续的STAT1功能分析,试图建立起一种“维甲酸-转录因子-靶基因”的研究模式,有助于维甲酸作用机制的全面、系统的研究.这为临床上使用维甲酸作为抗肿瘤药提供理论基础,同时也为胚胎干细胞多能性调控机制研究提供新思路.     

Functional Relevance of Interleukin-1 Receptor Inter-domain Flexibility for Cytokine Binding and Signaling

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