鸭肠炎病毒gB基因的分子特征

鸭肠炎病毒是鸭病毒性肠炎的病原,被划分为疱疹病毒科成员.gB是疱疹病毒感染和复制所必需的糖蛋白,能刺激机体产生中和抗体和细胞免疫应答,在疱疹病毒家族中高度保守.通过PCR技术获得了DEV C-KCE株gB基因的核苷酸序列,首次对DEV gB基因及编码氨基酸进行了较为详尽的生物信息学分析.结果表明,DEV gB基因与α-疱疹病毒的马立克氏病毒属亲缘关系最近;DEV gB蛋白具有与其他疱疹病毒gB相同或相似的结构、N糖基化位点、半胱氨酸残基、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPGs)结合位点、弗林蛋白酶水解位点和胞浆区PACS-1识别位点.     

猪伪狂犬病毒gB基因在大肠杆菌中的分段表达

目的分段表达伪狂犬病毒（pseudorabies virus,PRV）gB基因,用于PRV疫苗免疫抗体评估试剂盒研究。方法分析gB抗原表位,设计4对特异性引物,从PRV新疆分离株中扩增gB基因的4个片段,分别命名为gB-1、gB-3、gB-4和gB-5基因,克隆到pGEM-T-easy载体并测序。再将4个gB基因片段融合到pGEX-6P-1原核表达载体中,表达并纯化。Western Blotting进行重组蛋白的抗原性检测。以纯化的重组蛋白为抗原建立间接ELISA方法,检测猪血清临床样品。结果构建的4种表达质粒均可在大肠杆菌中表达,经SDS-PAGE分析,表达分子量分别为75.05、53.86、49.96和49.72×10^3Da,其中gB-3、gB-4和gB-5表达量较高,表达产物主要存在于包涵体中。Western Bloting鉴定显示,4种融合蛋白均可被猪伪狂犬阳性血清特异识别。以gB-3、gB-4和gB-5建立的ELISA方法与IDEXX公司的gB-ELISA试剂盒符合率分别为40.9%、81.8%和81.8%。结论本研究成功表达了PRV的gB-1、gB-3、gB-4和gB-5重组蛋白,gB-3、gB-4和gB-5表达量较高;其中以gB-4和gB-5建立的间接ELISA方法与IDEXX公司的符合率较高。     

巨细胞病毒肝炎患儿gB基因型分析及细胞因子水平测定

探讨新生儿肝炎患儿CMVgB基因型分布,研究不同gB基因型致病性的差异。采用巢式聚合酶链反应(nested PCR),限制性片段长度多态性(RFLP)分析技术等测定45例新生儿肝炎患儿尿中巨细胞病毒gB基因型,并分析gB基因型与其临床症状的关系。并用ELISA方法测定患儿血清TNF-α和IFN-γ水平。结果显示,新生儿肝炎在gB1~4型中均可发生,以gB1型为主。病理性黄疸为惟一症状的患儿只在gB1型和gB3型中出现,且预后较好。新生儿肝炎患儿血清TNF-α和IFN-γ皆高于对照组,可能与CMV肝炎的病理变化和病损程度有密切的关系。     

马立克氏病病毒gB部分基因的原核表达

利用PCR技术扩增获得马立克氏病病毒(MDV)囊膜糖蛋白B(gB)基因部分片段,将其克隆入pET-28a载体中,获得表达载体pET-gB,将该载体转化宿主菌BL21,经1.0mmol/LIPTG诱导,外源基因以包涵体的形式获得高效表达。将包涵体溶解于8mol/L的尿素中,利用His·Bind试剂盒获得纯化的蛋白,将纯化的蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,间接ELISA法测得抗体的效价为1×10-5。此外,通过Western blot实验表明,该抗体具有较高的特异性,为进一步探讨MDVgB所引起的特异的免疫反应奠定基础。     

不同异源启动子与MDV gB启动子及其复合启动子的活性比较

为了选择适宜的启动子调控外源基因的表达,以改善马立克氏病病毒为载体的重组病毒的免疫保护力。将hCMV立即早期启动子及增强子、SV40早晚期启动子及增强子或hCMV立即早期增强子的部分序列分别与马立克氏病病毒（MDV）自身的囊膜糖蛋白B基因（gB）启动子核心部分在体外杂合,分别构建复合启动子PhCMVgB、P SVgB或PengB;将这些启动子与虫荧光素酶报告基因相连,构建表达载体。利用脂质体将以上质粒与内标质粒（pSVβLacZ）共转染鸡胚成纤维次代细胞,于转染后48h,将细胞刮下来,利用荧光素酶测定试剂盒和β半乳糖苷酶测定试剂盒分别测定转染细胞的荧光素酶和β半乳糖苷酶的活性,通过荧光素酶和β半乳糖苷酶活性的比值获得虫荧光素酶的相对活性,利用虫荧光素酶的相对活性进行启动子的活性比较。结果表明,复合启动子相对马立克氏病病毒自身的gB启动子,活性有不同程度的提高,其中复合启动子PhCMVgB的活性最高,而复合启动子PSVgB和PengB的活性相当;但与商业强启动子相比,复合启动子活性要弱一些或相当。因此,从某种意义上讲,这些复合启动子既具有gB启动子的一些特性,又有商业强启动子的一些特性,为以马立克氏病毒为载体的新兴疫苗的开发奠定了基础。     

鸡马立克氏病病毒糖蛋白gB基因的表达及基因免疫

将马立克氏病病毒(Marek's disease virus,MDV)gB基因插入真核表达载体pcDNA3中,经酶切和PCR鉴定为正向插入了gB基因的重组质粒,命名为pcDNA3-gB.体外转染COS-7细胞,经间接免疫荧光染色证实转染pcDNA3-gB后的COS-7细胞内有糖蛋白B的表达.用pcDNA3-gB对AA肉用雏鸡腿部肌肉注射,进行一免.间隔2周后,用pcDNA3-gB再加强免疫一次.之后2周攻毒,观察免疫保护效果.结果表明,MDV gB基因DNA免疫可以诱导鸡体产生免疫保护,免疫保护指数为72.2%.     

人类疱疹病毒7型糖蛋白gB、gH、gL、gO介导细胞融合

人类疱疹病毒 7 型(HHV-7)的感染依赖于包膜糖蛋白在病毒生命周期的多个阶段发挥功能. 这些蛋白质可以介导病毒吸附,病毒包膜和宿主细胞膜融合以及病毒在细胞间的接触传播. 将表达 HHV-7 糖蛋白的 293T 细胞与 HHV-7 易感的SupT1 细胞共培养,检测虫荧光素酶报告基因的表达,以鉴定介导膜融合的 HHV-7 糖蛋白. 研究发现,HHV-7 糖蛋白 gB、gH、gL、gO 能介导 293T 细胞与 SupT1 细胞的融合,且融合可被抗 CD4 单抗所抑制. 结果表明,糖蛋白 gB、gH、gL、gO对于 HHV-7 引发的膜融合是必需的,其中某个蛋白质或所形成的蛋白质复合物可能是 CD4 的配体.     

鸡马立克氏病病毒糖蛋白gB基因的表达及基因免疫

将马立克氏病病毒(Marek's disease virus,MDV)gB基因插入真核表达载体pcDNA3中,经酶切和PCR鉴定为正向插入了gB基因的重组质粒,命名为pcDNA3-gB。体外转染COS-7细胞,经间接免疫荧光染色证实转染pcDNA3-gB后的COS-7细胞内有糖蛋白B的表达。用pcDNA3-gB对从肉用雏鸡腿部肌肉注射,进行一免。间隔2周后,用pcDNA3-gB再加强免疫一次。之后2周攻毒,观察免疫保护效果。结果表明,MDV gB基因DNA免疫可以诱导鸡体产生免疫保护,免疫保护指数为72．2％。     

人巨细胞病毒gB/AD1基因在CHO细胞中的表达和纯化

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)在自然界中普遍存在,g B是该病毒表面的一种重要糖蛋白,其AD1序列是主要的中和抗体表位之一。首先以HCMV基因组为模板,通过PCR技术扩增出g B基因的一个片段,该片段删除了跨膜区和胞内区,仅保留AD1中和抗体表位,然后被连接到哺乳动物细胞表达质粒p SGHV0上,与dhfr基因通过电击转染至CHO/dhfr-细胞,继而用60 nmol/L MTX筛选稳定表达细胞株,用ELISA和Western blot检测AD1重组蛋白的表达,最后用Ni2+-NTA亲和层析进行纯化。获得了真核细胞表达的重组融合蛋白,表达量约为10 mg/L,蛋白纯度可达到80%以上,为HCMV表面糖蛋白g B功能的进一步研究以及基因工程疫苗的开发奠定了基础。     

鸡传染性喉气管炎病毒gB基因重组DNA疫苗的构建与免疫试验

本研究构建了编码ILTV主要抗原gB基因的重组DNA疫苗pcDNA-gB,质粒转染293-T细胞的间接免疫表明其表达的蛋白具有免疫反应性.为测定该DNA疫苗的免疫效果,将其与本室保存的重组鸡痘病毒rFPV-gB-gD-IgY分别以单独和混合的方式给4周龄非免疫鸡进行免疫,然后测定ILTV特异性抗体和T淋巴细胞增殖反应.结果表明这2种基因工程疫苗均能诱导鸡产生特异性的体液免疫及细胞免疫应答.其中以pcDNA-gB/rFPV-gB-gD-IgY联合免疫组的效果最好,其诱导的抗体水平已接近于常规弱毒疫苗,而细胞免疫水平则比后者高得多.上述研究结果为ILTV 新型疫苗的研究奠定了基础.     

猴B病毒囊膜蛋白gB特异性抗原表位的筛选与表达鉴定

目的筛选和鉴定猴B病毒囊膜蛋白gB的特异性抗原表位,将其应用于B病毒的检测。方法利用蛋白序列比较和表位预测技术筛选猴B病毒囊膜蛋白gB的特异性抗原表位,经PCR扩增后原核表达,纯化,Western-blot鉴定融合蛋白,建立特异性表位的ELISA检测方法 ,并对其效果进行评估。结果琼脂糖凝胶电泳和测序结果显示出目的表位基因完全正确,并且重组蛋白经过SDS-PAGE、Western-blot鉴定,其相对分子质量约为27×10^3,与预期值相符。筛选出的gB-26肽表位检测结果与文献相符,特异性较好,敏感性稍低。结论建立了猴B病毒囊膜蛋白gB特异性抗原表位筛选和鉴定的实验方法 ,为进一步研制猴B病毒快速诊断试剂盒和猴B病毒亚单位疫苗奠定了基础。     

利用自裂解肽T2A共表达猴B病毒糖蛋白gB和gD

目的:探讨自裂解肽T2A对猴B病毒g D和g B蛋白共表达的可行性。方法:利用一点褐翅蛾病毒(Ta V)的2A元件(T2A)连接猴B病毒膜蛋白g D和g B基因,构建多顺反子表达质粒,制备CHO-S工程细胞,采用Western印迹和ELISA检测蛋白表达及重组蛋白的免疫学特性。结果:g D和g B蛋白实现了共表达且保持了独立和完整的分子结构,但g B的表达水平明显低于g D;ELISA结果显示,单独表达的g D和g B以及共表达产物都能与B病毒阳性血清反应,但共表达产物的反应强度高于单独表达的g D和g B;重组蛋白经变性处理后,g B蛋白的吸光度值降幅最大。结论:自裂解肽T2A能够实现不同分子共表达且保持独立和完整的分子结构;共表达猴B病毒g D和g B分子有利于提高抗体检测的敏感性。     

鸡传染性喉气管炎病毒gB基因重组DNA疫苗的构建与免疫试验

本研究构建了编码ILTV主要抗原gB基因的重组DNA疫苗pcDNA-gB,质粒转染293-T细胞的间接免疫表明其表达的蛋白具有免疫反应性。为测定该DNA疫苗的免疫效果,将其与本室保存的重组鸡痘病毒rFPV-gB-gD-IgY分别以单独和混合的方式给4周龄非免疫鸡进行免疫,然后测定ILTV特异性抗体和T淋巴细胞增殖反应。结果表明这2种基因工程疫苗均能诱导鸡产生特异性的体液免疫及细胞免疫应答。其中以pcDNA-gB/rFPV-gB-gD-IgY联合免疫组的效果最好,其诱导的抗体水平已接近于常规弱毒疫苗,而细胞免疫水平则比后者高得多。上述研究结果为ILTV新型疫苗的研究奠定了基础。     

鸭瘟病毒gB蛋白N端主要抗原域的表达及间接ELISA检测

在分析鸭瘟病毒gB蛋白抗原性的基础上,设计一对引物克隆gB蛋白N端抗原性较好的抗原域编码基因.将克隆的基因定向插入pET-32a的EcoR Ⅰ和HindⅢ之间,构建了gB蛋白主要抗原域原核表达载体pET-gB1.将pET-gB1质粒转化BL(21)宿主菌后,对培养和表达条件进行了优化,实现了DPV gB蛋白主要抗原域的高效表达.免疫印迹试验表明获得的表达产物具有良好的反应原性.应用His·Bind亲和层析柱纯化重组DPV gB蛋白,以纯化的重组gB1蛋白作为检测抗原,初步建立了检测鸭瘟病毒抗体的igB1-ELISA.结果表明,抗原的最佳包被浓度为6.5μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶80,阳性标准初步定为:待检血清OD490＞0.4,且待检血清OD490/阴性血清OD490＞2.应用igB1-ELISA对鸭血清样品进行检测,结果表明igB1-ELISA与全病毒包被的iDPV-ELISA符合率达到95.6%.     

鸭瘟病毒gB蛋白N端主要抗原域的表达及间接ELISA检测

在分析鸭瘟病毒gB蛋白抗原性的基础上,设计一对引物克隆gB蛋白N端抗原性较好的抗原域编码基因.将克隆的基因定向插入pET-32a的EcoR Ⅰ和HindⅢ之间,构建了gB蛋白主要抗原域原核表达载体pET-gB1.将pET-gB1质粒转化BL(21)宿主菌后,对培养和表达条件进行了优化,实现了DPV gB蛋白主要抗原域的高效表达.免疫印迹试验表明获得的表达产物具有良好的反应原性.应用His·Bind亲和层析柱纯化重组DPV gB蛋白,以纯化的重组gB1蛋白作为检测抗原,初步建立了检测鸭瘟病毒抗体的igB1-ELISA.结果表明,抗原的最佳包被浓度为6.5μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶80,阳性标准初步定为:待检血清OD490＞0.4,且待检血清OD490/阴性血清OD490＞2.应用igB1-ELISA对鸭血清样品进行检测,结果表明igB1-ELISA与全病毒包被的iDPV-ELISA符合率达到95.6%.     

鸡传染性喉气管炎病毒gB基因的克隆及其在耻垢分枝杆菌中的表达

以ILTV基因组为模板 ,利用PCR特异扩增出gB基因 ,定向克隆到中间质粒载体pY_α ,构建了中间质粒pY_α_gB。然后以中间质粒pY_α_gB为模板 ,扩增出含有人结核分枝杆菌启动子hsp70基因和堪萨斯分枝杆菌α信号肽基因的hsp_α_gB片段 ,回收补平后与穿梭表达载体pRR3平端连接 ,从而构建大肠杆菌_分枝杆菌穿梭表达质粒pR_α_gB。再将其电转化至耻垢分枝杆菌M .smegmatismc2 15 5 ,ELISA检测表明重组菌株M .smegmatismc2 15 5 (pR_α_gB)的表达产物具有很好的反应原性。Westernblot检测说明gB基因在分枝杆菌中获得了表达并具有良好的免疫原性。鸡胚中和试验结果表明该重组菌株可以中和 1个剂量EID50 的ILTV强毒 ,能够保护SPF鸡胚抵抗强毒攻击     

传染性喉气管炎病毒gB基因和新城疫病毒F基因在重组禽痘病毒中共表达

在重组禽痘病毒中表达多个禽类病原的主要免疫原基因是构建多价基因工程疫苗的前提,但相关研究很少。在表达传染性喉气管炎病毒(ILTV)gB基因重组禽痘病毒的转移载体的基础上,构建了含有ILTV gB基因和新城疫病毒(NDV)F基因的重组禽痘病毒转移载体pSY-gB-F,采用脂质体转染禽痘病毒感染的鸡胚成纤维(CEF)细胞后,通过蓝斑试验筛选出重组禽痘病毒(rFPv-gB-F),并进行了6轮蚀斑纯化。Western-blot试验和间接免疫荧光试验证明ILTV gB基因和NBVF基因在rFPV-gB-F感染的CEF细胞中获得表达。为传染性喉气管炎、新城疫与鸡痘活载体多价疫苗的研制奠定基础。     

含HVT部分gB基因马立克氏病病毒的转移载体的构建及表达

根据己发表马立克氏病病毒(MDV)血清Ⅰ型短独特区(US)基因序列,设计一对引物用PCR方法扩增出CVI988/Rispens株的包括部分sorf2和sorf3基因及全部us1和us10基因,并克隆入SK( )载体中,筛选出阳性载体pBUS10。用PCR的方法在火鸡疱疹病毒(HVT)gB基因主要抗原决定簇的前端及后端分别加上血凝素基因(HA)及终止子TAA,并克隆到pcDNA3载体中,构建出在CMV启动于和增强于控制下含HA及gB基因主要决定簇的表达盒;将此表达盒克隆入pBUS10载体的us10基因中,构建出一种含HA及gB基因主要决定簇的转移载体pBUS10gB3。转染CHO细胞后,用兔抗鸡IgY进行间接免疫荧光试验,证实该转移质粒载体可有效地表达HVT gB基因。     

含HVT部分gB基因马立克氏病病毒的转移载体的构建及表达

根据已发表马立克氏病病毒(MDV)血清Ⅰ型短独特区(US)基因序列,设计一对引物用PCR方法扩增出CVI988/Rispens株的包括部分sorf2和sorf3基因及全部us1和us10基因,并克隆入SK(+)载体中,筛选出阳性载体pBUS10.用PCR的方法在火鸡疱疹病毒(HVT)gB基因主要抗原决定簇的前端及后端分别加上血凝素基因(HA)及终止子TAA,并克隆到pcDNA3 载体中,构建出在CMV启动子和增强子控制下含HA及gB基因主要决定簇的表达盒;将此表达盒克隆入pBUS10载体的us10基因中,构建出一种含HA及gB基因主要决定簇的转移载体pBUS10gB3.转染CHO细胞后,用兔抗鸡IgY进行间接免疫荧光试验,证实该转移质粒载体可有效地表达HVT gB基因.