利用RNA干扰抑制细丝蛋白A基因的表达

目的：构建细丝蛋白A（FLNa）基因的小干扰RNA（siRNA）表达载体,并观察其对FLNa基因表达的抑制作用。方法：利用RNA干扰（RNAi）技术设计并合成1条针对FLNa的siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSilencer4．1-CMV-hygro中;将重组质粒pSilencer-FLNa、pSilencer-negative（阴性对照）转染293T人胚肾细胞,通过Western印迹检测FLNa的表达;通过潮霉素筛选建立干扰FLNa表达的前列腺癌细胞。结果：PCR鉴定证明构建了FLNa基因RNAi载体;Western印迹表明构建的FLNa基因干扰载体能够有效地抑制FLNa基因的表达;建立了稳定干扰FLNa表达的前列腺癌C4-2细胞。结论：构建了FLNa基因RNAi载体,该载体能够有效地抑制FLNa基因的表达。     

基于载体的RNA干扰介导入核受体hLRH-1表达稳定抑制肝癌细胞BEL-7402的基因表达谱分析

为建立-hLRH-1表达稳定抑制的细胞系,我们构建了hLRH-1基因靶向的稳定RNA干涉载体（pSineohLRH-1）并导入肝细胞癌细胞BEL-7402。通过半定量RT-PCR分析发现,携有pSineohLRH-1的BEL-7402细胞其hLRH-1基因mRNA的表达抑制率达60％。此外,微阵列法基因表达谱分析结果表明,与未干涉的对照细胞相比,包括一些肿瘤相关的基因如Gadd45β和PTEN在内的405个基因在hLRH-1基因表达稳定下调的BEL-7402细胞中呈明显的表达差异,意示hLRH-1具比已知更为广泛的生物学功能。尽管hLRH-1与这些差异表达基因的确切关系尚有待进一步的实验探究,我们的发现仍为hLRH-1在肿瘤发生发展中可能的作用机制的揭示提供了新的线索。     

针对多效蛋白基因的小干扰RNA的设计及其稳定表达载体的构建

目的:设计多效蛋白基因特异性的小干扰RNA(siRNA),并构建一系列能在哺乳动物细胞内稳定表达这些siRNA的表达质粒,以便为在体外研究多效蛋白基因的功能打下基础。方法:设计并合成具有多效蛋白基因特异性的一组寡核苷酸片段,并克隆到pSilencer3.1-H1hygro载体;用脂质体LipofectAMINE2000转染和潮霉素筛选等方法建立能稳定表达相应siRNA的一组Pten-/-细胞克隆;利用Northern印迹检测这些细胞内多效蛋白基因的表达情况。结果:设计并构建了3个针对多效蛋白基因的siRNA表达质粒,并证明其中的1种质粒能在Pten-/-细胞内稳定表达相应的siRNA,并显著地抑制了该细胞多效蛋白基因的表达。结论:设计并构建出的针对多效蛋白基因的siRNA表达载体所表达的siRNA具有较强的RNA干涉功能,为多效蛋白基因的功能研究奠定了实验基础。     

RNA干扰抑制nm23-M1基因表达对骨髓瘤SP2/0细胞增殖的影响

建立RNA干扰 (RNA interference, RNAi)抑制nm23-M1基因表达的骨髓瘤SP2/0细胞株, 初步探讨nm23-M1基因对小鼠骨髓瘤细胞增殖的影响.针对 nm23-M1 mRNA序列设计3个小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)序列, 分别构建表达这3个序列及阴性对照序列的pGenesil-1重组质粒, 再转染小鼠骨髓瘤SP2/0细胞并经G418抗性筛选稳定表达细胞株.采用半定量RT-PCR及Western 印迹检测3个重组质粒对nm23-M1 mRNA及蛋白质表达的抑制效果, 然后用MTT法观察抑制nm23-M1表达对SP2/0细胞增殖的影响.结果显示, 设计的3条siRNA不同程度地特异抑制骨髓瘤SP2/0细胞nm23-M1 mRNA及蛋白质的表达, 其中siRNA-2抑制作用最强, 其对nm23-M1 mRNA和蛋白质的抑制率分别为74.4%和62.1%; 且siRNA-2抑制nm23-M1基因表达后SP2/0 细胞增殖受到明显抑制 (P < 0.05).本研究成功构建了pGenesil-1-nm23-M1 siRNA重组质粒, 筛选出稳定抑制nm23-M1基因表达的SP2/0细胞株, 提示抑制nm23-M1基因表达有抑制骨髓瘤细胞增殖的作用; 为进一步研究nm23基因的生物学功能及临床应用打下了基础.     

腺病毒载体介导的GFP基因在鸭胚成纤维细胞中的表达及RNA干扰

目的：建立在鸭胚成纤维细胞（DEF）中进行RNA干扰（RNAi）的技术平台,为鸭基因组功能的研究提供新的技术手段。方法：以绿色荧光蛋白（GFP）基因为报告基因,脂质体转染化学合成的GFP特异小干扰RNA（GFP-siRNA）,用流式细胞仪测定GFP-siRNA对重组腺病毒（Adv-GFP）介导的GFP基因在DEF中表达的干扰效果。结果：200MOI（感染复数）Adv-GFP介导的GFP基因在DEF中表达效率最高,为31．20％±3．1l％,对DEF的活力无明显影响;GFP-siRNA能有效干扰GFP基因在DEF中的表达,相对抑制率为98．56％。结论：在DEF中进行RNAi是可行的,Adv-GFP是介导外源基因在DEF中表达较为理想的载体;首次建立了在DEF中进行RNAi的技术平台,为鸭基因组的功能等研究提供了新的技术手段。     

肿瘤睾丸抗原CT45-5基因小干扰RNA表达载体的构建及干扰效果鉴定

目的:构建肿瘤睾丸抗原CT45家族中5号成员基因(CT45-5)的小干扰RNA(siRNA),并检测其对HeLa及HeLa/Fhit细胞内源性CT45-5基因及外源脆性组氨酸三联体(Fhit)基因表达的干扰效果。方法:根据CT45-5基因序列,通过生物信息学方法对靶向CT45-5基因的siRNA进行预测,从中筛选出2对合理的CT45-5-siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSilencer 2.1-U6 Hygro中,转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性克隆进行测序鉴定;将构建的CT45-5-siRNA重组载体转染人宫颈癌细胞HeLa及HeLa/Fhit细胞,Western印迹检测siRNA对HeLa及HeLa/Fhit细胞内源性CT45-5及外源Fhit基因表达的干扰效果。结果:构建了2个CT45-5-siRNA重组质粒,其中一条对CT45-5基因具有明显的干扰作用,并且Fhit基因表达也被抑制。结论:构建的CT45-5-siRNA为与CT45-5功能相关的基因研究奠定了基础。     

玉米淀粉分支酶SBEⅡb基因RNA干涉表达载体的构建和转化

应用聚合酶链式方应技术扩增玉米淀粉分支酶第20外显子155 bp的基因片段,并将其正向和反向克隆到pUCCRNA i载体上。利用pHMW.GUS与pCAMB IA1300作为桥梁载体,构建了含胚乳特异启动子和潮霉素筛选基因的RNA干涉表达载体pCAMB IA1300 HMW 2F。通过三亲杂交将pCAMB IA1300 HMW 2F表达载体转化到根癌农杆菌LBA4404,对玉米自交系178进行遗传转化,通过抗性筛选和PCR检测,获得了4株PCR阳性苗。     

大鼠β乳酪蛋白基因调控区的克隆和序列分析及乳腺定位表达载体的构建

将大鼠β乳酪蛋白的调控序列克隆于ｐＧＥＭ－４Ｚ,用ＳＰ６、Ｔ７正反向引物进行序列分析,证实其正确之后将该调控序列克隆于真核表达载体ｐＳＶＬ中,构建成功了乳腺定位表达载体。同时在其下游插入了荧光素酶报道基因,用于在乳腺细胞表达调控的研究。     

GnRH及其转运肽基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建GnRH/TRS与绿色荧光蛋白(GFP)的融合基因并表达.方法 利用DNA重组技术,将GnRH/TRS片段克隆至真核表达载体pEGFP-C1转化DH5 α,重组体质粒pEGFP-C1-GnRH/TRS用LipoGen脂质体进行转染至Hela细胞,核酸序列测定和Western印迹分析基因表达,激光共聚焦荧光显微镜观察活细胞内荧光布局.结果 重组子pEGFP-C1-GnRH/TR成功构建.激光共聚焦荧光显微镜观察结果表明,GnRH/TKS-GFP融合基因的瞬间和稳定表达均获得了相同结果.结论 GnRH/TRS-GFP融合蛋白具有GFP的自发荧光特性,且不影响GnRH/TRS分子在细胞内的正确表达.     

RS基因的植物表达载体和酵母表达载体构建

白藜芦醇合酶(RS)是Res生物合成的关键酶之一,它催化1分子4-香豆酰辅酶A和3分子丙二酰辅酶A反应合成Res.以花生中克隆的RS基因为基础,成功构建了RS基因的以Ubi为启动子的单子叶植物表达栽体pBIL-RS,为以后的基因工程遗传转化果蔗和其他单子叶植物改良其品质提供条件.同时构建了酵母表达载体pVT102U-RS,为下一步研究真核表达蛋白的生物活性提供条件,并为利用酵母生产Res提供了可能.     

玉米淀粉分支酶基因的克隆与RNAi表达载体的构建

利用网络数据库http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/,确定玉米淀粉分支酶SBEⅡb的部分基因序列作为RNAi的目标序列,通过RT-PCR方法从玉米自交系‘综31’中分别成功克隆出了玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因的部分序列及其启动子序列,从大肠杆菌中成功克隆了木糖异构酶基因xylA作为筛选标记,构建了含有35S驱动的木糖异构酶基因和sbeⅡb启动子驱动的含有sbeⅡb目标序列的反向重复序列的表达载体pBAC413,并对玉米自交系实施转化。经PCR检测转基因玉米再生植株,初步判定目的序列已经成功整合到玉米再生植株的基因组中。     

鼠源原蛋白转化酶2基因的构建及其表达

目的:蛋白转化酶PC2在神经内分泌肽的成熟过程中起到了非常重要的作用,为了研究鼠肿瘤膜型中pc2基因对乳腺癌生长转移的影响,重组并构建了鼠源pc2基因.方法:提取大鼠脑垂体总RNA,通过RT-PCR方法克隆并扩增了鼠源pc2的cDNA.将pc2基因的cDNA插入pCDNA3.1/Zeo载体构建成pCDNA3.1-pc2重组载体.通过pCDNA3.1-pc2或和它的分子伴侣基因7b2的共表达,pc2基因成功地在乳腺癌4T1细胞株中表达和活化.结论:通过测序、转染、Western blot分析和活性测定等证实pc2被插入载体并在哺乳动物细胞中成功表达.     

利用RNAi技术抑制拟南芥NHX1基因家族的表达

采用RNAi抑制NHX1基因家族的表达,并观察其对拟南芥耐盐性和耐旱性的影响.根据从拟南芥(Ara-bidopsis thaliana)cDNA中扩增出编码Na /H 反向转运蛋白基因AtNHX1长度为210 bp高度保守序列作为RNAi的靶标区,并正反2个方向插入载体pHANNIBAL中,2个片段用intron连接;将RNAi表达框连入具有NPTⅡ筛选标记基因的表达载体pART27中,构建以拟南芥NHX1基因家族为靶标的RNAi载体.采用农杆菌介导的真空渗透法转化拟南芥,得到T0代转基因拟南芥种子.对转基因阳性植株进行RT-PCR检测以及耐盐性和耐旱性分析.结果表明,利用本实验构建的NHX1基因家族RNAi载体,拟南芥NHX1基因家族表达被成功地抑制;耐盐和耐旱分析表明RNAi技术对基因表达沉默是有效的.     

农杆菌介导淀粉分支酶基因RNAi片段转化玉米的研究

以玉米自交系“178”和“R18红”的胚性愈伤组织为材料,通过愈伤组织对潮霉素的敏感性实验,确定了潮霉素15 mg/L~25 mg/L为愈伤组织适宜的选择压。利用农杆菌(Agrobacterium tum efaciens)介导将淀粉分支酶基因RNA干涉表达载体转入玉米自交系中,并对农杆菌转化系统的条件进行研究。结果表明:在感染液和共培培养基中分别都加入100μm ol/L乙酰丁香酮和50 mg/L抗坏血酸,农杆菌LBA4404的菌液OD600为0.6、侵染时间20 m in为农杆菌转化的最适条件。对转化的愈伤组织分化诱导出苗后进行PCR检测,证明外源目的基因已整合到玉米基因组中,转化率最高达到2.4%。     

RNA干扰研究进展

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指由双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)启动的序列特异的转录后基因沉默现象,广泛存在于真菌、植物和动物中。它是细胞内由双链RNA诱导降解与其配对的特定mRNA的过程。细胞内双链RNA在酶的作用下,形成20-25碱基大小的小干扰RNA(siRNAs),由siRNAs进一步掺入多组分核酸酶并使其激活,从而精确降解与siRNAs序列相同的mRNA,抑制该基因在细胞内的翻译表达。RNAi技术是近年来迅速发展起来的高效、特异、易操作的基因沉默技术。与反义寡核苷酸等传统方法相比,RNAi技术有着无可比拟的优势。本文就其近年的研究进展作一综述。     

Strict Regulation of Gene Expression Utilizing a Dual-control Gene Expression Vector System

可严格调控性是体现原核表达载体优越性的重要指标。构建了一种双控双调节原核表达载体系统,用双载体控制调节目的基因的表达,即SP6启动子（promoter）＋乳糖（lac）调节基因表达系统和araB启动子（promoter）＋ara C调节基因表达系统,分别由乳糖类似物IPTG和阿拉伯糖（L-arabinose）诱导目的基因的表达。该系统由2个表达载体共同完成目的基因的表达。pE SP-1为主表达载体,即目的基因克隆到此表达载体上,由SP6启动子（promoter）＋乳糖（lac）调节基因调控;pA RA-SP6为辅助表达载体,该载体通过SP6 RNA聚合酶的表达来控制调节主表达载体的启动子（SP6）,由araB启动子（promoter）＋ara C调节基因调控。实验结果显示该双控双调节表达载体系统控制严格,并且表达蛋白的量具有可调控性。     

小鼠RNA干扰基因RelA慢病毒载体的构建与鉴定

目的：构建小鼠RelA 基因的RNA 干扰慢病毒载体,转染小鼠成骨样细胞并鉴定。方法：针对小鼠RelA 基因序列,设计特异 性的shRNA 序列,应用基因重组技术插入慢病毒载体GV-248。得到的重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5-alpha,筛选得到阳性克隆 并扩大培养。所得质粒进行测序分析确定载体构建成功。重组质粒载体及包装辅助质粒转染293T 细胞,得到目的病毒并测定相 应病毒滴度。慢病毒转染MC3T3-E1 细胞后,Real-time PCR 及Western blot 检测MC3T3-E1 细胞RelA 基因及成骨相关基因 ALP、OCN、RANKL的表达。结果：成功构建小鼠RelA 基因的RNA干扰慢病毒载体,感染MC3T3-E1 细胞后,RelA 基因的表达 明显受到抑制,同时RANKL基因表达水平明显下降,ALP、OCN基因表达水平明显上升。结论：成功构建了小鼠RelA 基因的 RNA 干扰慢病毒载体。当小鼠成骨细胞RelA基因表达被干扰,NF-资B 通路被抑制后,小鼠成骨细胞成骨相关基因ALP、OCN的 表达明显上升,成骨功能增强;同时RANKL 的表达明显下降,其介导的破骨细胞骨吸收功能减弱。     

仅基于RNA元件构建可诱导哺乳动物细胞基因表达的调控系统

大量的临床前和临床研究结果已表明基因治疗是理想的疾病治疗手段,然而如何实现治疗基因表达的精确调控仍然是研究人员面临的主要挑战。目前临床前研究常用的基因调控系统多基于控制转录,对反式转录激活因子和专门启动子元件的依赖限制了该系统的临床应用。最近,仅采用RNA元件构建的几种基因表达调控系统得到开发,其作用机制为核酶介导的RNA自我切割、RNA干扰、mRNA翻译启动或终止控制等。该类系统的调控活性由小分子配体反式控制,诱导基因表达的变化幅度可观,反应快速,在哺乳动物体内外均可实现。该系统结构模块化,调控活性可调节,可以克服现有转录调节系统的一些应用局限,对将来基因治疗的临床应用具有重要意义。     

RNA干扰对乙肝病毒基因的抑制作用

双链介导的遗传干涉的机制是1998年发现的。它通过双链RNA的介导特异性地降解相应序列从而导致转录后水平的基因沉默。RNA干扰作为后基因组时代的一种下调基因表达的工具已被广泛用于基因功能的研究以及疾病的治疗。利用小干扰RNA与乙肝病毒DNA通过共传染于HepG2肝癌细胞中使乙肝病毒基因沉默以达到抑制乙肝病毒复制作用。     

利用RNA干扰抑制具有多种剪接形式的RNA结合蛋白基因的表达

目的:构建具有多种剪接形式的RNA结合蛋白(RBPMS)基因siRNA的真核表达载体,观察其对RBPMS表达的影响。方法:利用RNA干扰(RNAi)技术,设计并合成了2条针对RBPMS基因的siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSliencer2.1-U6neo上。将重组质粒和带FLAG标签的RBPMS共转染293T人胚肾细胞,通过Western印迹检验RNAi效应。结果:测序证明成功构建了RBPMSsiRNA真核表达载体;Western印迹表明构建的siRNA能有效地抑制RBPMS基因的表达。结论:构建了RBPMSsiRNA的真核表达载体,该siRNA能有效地抑制RBPMS基因的表达。