分子置换法在去B链羧端五肽胰岛素晶体结构测定中的应用

收集了一套去B链羧端五肽胰岛素(DPI)单斜晶体的X射线衍射数据。利用已知的胰岛素结构和DPI强度数据,应用分子置换法对测定DPI的晶体结构作了尝试。为了测定分子在晶胞中的取向和位置,在TQ-16和013计算机上编制了一套ALGOL程序。在算得的旋转函数图上没有找到突出的峰,用去掉B链前三个氨基酸残基和大部分表面侧链的胰岛素分子的原子坐标数据作试验,得到了改进的10～4图。在此基础上,采用不同的方法探索分子在单斜晶胞里的位置,最后得到了一个可能的分子在晶胞里的堆积模型。结果表明,胰岛素和DPI分子结构之间的差异可能较大,DPI晶体中晶体学二重轴联系的两个分子不能形成一个象三方二锌猪胰岛素晶体那样的二聚体。     

B链N端去二肽(B1～2)C端去五肽(B26～30)胰岛素晶体结构的分子置换法研究

以B链羧端去五肽胰岛素(DPI)结构为模型,应用分子置换法对B链N端去二肽(B1～2)C端去五肽(B26～30)胰岛素(DesB1～2DPI)晶体结构进行了研究.DesB1～2DPI晶体单位晶胞中每个结晶学不对称单位包含1个DesB1～2DPI分子.交叉旋转函数和平移函数搜索均找到了明显突出的峰,确定了DesB1～2DPI分子在晶胞中的取向和位置.进一步的三维模型重建和结构精化结果巩固了DesB1～2DPI的分子置换法研究的正确性.     

去五肽胰岛素晶体生长的进一步探索及某些晶体学观察

用重结晶法得到了去B链羧端五肽胰岛素(DPI)单斜晶系C2空间群的大单晶。该晶体有两个优点:(1)生成的大晶体是单晶而不是双晶,所以不需要在使用前切割双晶,从而避免了晶体的损伤。(2)衍射能力强,可以得到重原子衍生物的好的反常散射数据。对DPI的原料进行了一系列的生化分析,发现DPI原料中有一定量的去六肽胰岛素,这可能是影响晶体生长的原因。经纯化后的DPI制剂可用重结晶法获得适合于X射线衍射用的单晶。     

去五肽胰岛素晶体生长的进一步探索及某些晶体学观察

用重结晶法得到了去B链羧端五肽胰岛素(DPI)单斜晶系C2空间群的大单晶。该晶体有两个优点:(1)生成的大晶体是单晶而不是双晶,所以不需要在使用前切割双晶,从而避免了晶体的损伤。(2)衍射能力强,可以得到重原子衍生物的好的反常散射数据。对DPI 的原料进行了一系列的生化分析,发现DPI 原料中有一定量的去六肽胰岛素,这可能是影响晶体生长的原因。经纯化后的DPI 制剂可用重结晶法获得适合于X 射线衍射用的单晶。     

胰岛素晶体中水的一般结构及作用

在1.8A分辨率胰岛素同晶置换结构的基础上,运用差值付里叶技术研究了胰岛素晶体中水的结构和作用。晶胞中大约三分之一的水呈结合状态,它们与胰岛素分子彼此以氢键结合。在差值图上,这部分水分子表现清晰而肯定,显示出有序状态。胰岛素分子A、B链各氨基酸残基的极性和荷电基团,除已经彼此以氢键或盐键形成给体-受体“配偶”者和处于分子内部者外,其余几乎都与水分子相结合。蛋白质分子表现出最大限度结合水的倾向。一些水桥和水网络作用于胰岛素分子的A、B链之间和二聚体之间,对胰岛素分子A、B链的正确相关以及二聚化和六聚化都有重要意义。显然通过水分子的作用,使极性和荷电基团形成最大限度的给体-受体“配偶”,是稳定蛋白质三维结构的一个重要因素。大约三分之二的水分子,围绕胰岛素分子形成近似“水合层”的结构。它们在差值电子密度图上,表现弱而弥散,显示出是一些有序性较差的分子。通过结合水在蛋白质分子表面形成一些“抛锚点”,可能是这类水与蛋白质分子相作用的一条途径。它们较大的游动性,对蛋白质分子的动力学性质可能有重要意义。     

胰岛素晶体中水的一般结构及作用

在1.8分辨率胰岛素同晶置换结构的基础上,运用差值付里叶技术研究了胰岛素晶体中水的结构和作用。晶胞中大约三分之一的水呈结合状态,它们与胰岛素分子彼此以氢键结合。在差值图上,这部分水分子表现清晰而肯定,显示出有序状态。胰岛素分子A、B链各氨基酸残基的极性和荷电基团,除已经彼此以氢键或盐键形成给体-受体“配偶”者和处于分子内部者外,其余几乎都与水分子相结合。蛋白质分子表现出最大限度结合水的倾向。一些水桥和水网络作用于胰岛素分子的A、B链之间和二聚体之间,对胰岛素分子A、B链的正确相关以及二聚化和六聚化都有重要意义。显然通过水分子的作用,使极性和荷电基团形成最大限度的给体-受体“配偶”,是稳定蛋白质三维结构的一个重要因素。大约三分之二的水分子,围绕胰岛素分子形成近似“水合层”的结构。它们在差值电子密度图上,表现弱而弥散,显示出是一些有序性较差的分子。通过结合水在蛋白质分子表面形成一些“抛锚点”,可能是这类水与蛋白质分子相作用的一条途径。它们较大的游动性,对蛋白质分子的动力学性质可能有重要意义。     

去B链羧端五肽胰岛素的结构研究——Ⅳ.溶液中的缔合性质、酪氨酸微区及主链构象

研究去B链羧端五肽胰岛素(DPI)的空间结构对了解胰岛素分子的结合部位是重要的,本文研究了它的部分空间结构性质。1.用凝胶过滤法研究了DPI的性质,说明接近生理环境的条件下(pH7.0,离子强度0.3),DPI没有自缔合性质,而是以单体存在。因此推论胰岛素的作用单位是单体,它以单体与受体结合并传递信息。2.用紫外差吸收法测定了DPI的pH差光谱,变性差光谱与热变性曲线。这些结果说明DPI的三个酪氨酸侧链暴露在分子表面。3.测定了DPI的圆二色性(CD)曲线。pH7.0时,远紫外CD曲线与胰岛素相似,但[θ]220毫微米负值变小。这可能说明DPI的主链与胰岛素基本相同而略有松散。近紫外CD曲线与胰岛素很不相同,谷顶在266毫微米,[θ]负值变小。讨论了Phe与-S-S-提供贡献的可能。结合本系列工作的Ⅲ、Ⅳ两文,可以认为,DPI的空间结构研究的结果支持胰岛素分子二体内单体间的疏水面是结合部位的一部分这一假设。     

去B链羧端五肽胰岛素的结构研究 Ⅴ.用萤光探针1,8-TNS对疏水区的初步研究

1,8-TNS与溶剂极性和粘度关系的研究,证明正如它们的位置异构物2,6-TNS一样具有萤光疏水探针的性能。我们用此探针比较研究了胰岛素、去B链羧端五肽胰岛素(DPI)、牛血浆白蛋白、溶菌酶、卵白蛋白的疏水表面性质。结果表明DPI和胰岛素相似,存在一个小而确定的疏水区。提示B链羧端五肽的去除并未严重改变其与受体结合有关的疏水面结构。在生理pH值其疏水面暴露较胰岛素略大。但其疏水面构象稳定性较胰岛素弱,随pH升高,分子局部构象可能发生扭动,疏水面构象遭到一定程度的破坏。总的来讲,DPI结构较胰岛素松散,稳定性亦下降。     

胰岛素B链N端和C端缩短对其与胰岛素抗体结合力的影响

本文研究了B链N端和C端缩短的若干胰岛素类似物与胰岛素抗体的结合能力。结果表明:去B链C端五肽胰岛素(DPI)分子中B_1-Phe去除后其与胰岛素抗体结合力明显下降,这与去B_1-Phe胰岛素与胰岛素抗体结合力下降的趋势相似;去B链C端六肽胰岛素(DHI)与胰岛素抗体结合力与DPI非常接近,都为胰岛素的70%左右。而去B链C端七肽胰岛素(DHPI)与胰岛素抗体结合力与去B链C端六肽胰岛素(DHI)相比,其结合力下降了一个数量级。说明胰岛素B_1-和B_(24)-Phe残基对组成和维持胰岛素分子的抗原决定簇起着重要作用。去B链九肽胰岛素(DNI)与胰岛素抗体的结合力与去B链C端八肽胰岛索(DOI)及DHPI相似。本文对上述结果进行了讨论。     

[L-蛋氨酸]~(B_0)牛胰岛素晶体结构的研究——单晶培养及X射线晶体学的分析

用微量静置法在柠檬酸缓冲液中培养出可供X射线结构分析用的B链NH_2端L-蛋氨酸牛胰岛素单晶。晶体衍射分辨率达到2.0,所培养的晶体属立方晶系,a=73.503A,其空间群为P2_13,每个结晶学不对称单位含两个蛋氨酸牛胰岛素分子。对单位晶胞内六聚体之间的可能排列进行了讨论。     

B链C端去七肽(B24～B30)胰岛素的分子置换法

一个几近失活的胰岛素类似物———B链C端去七肽 (B2 4～B30 )胰岛素(DHPI)已被结晶 .该晶体属于空间群P2 ₁2 ₁2 ₁,晶胞的 1个独立区内包含有 2个DHPI分子 .应用分子置换法确定了DHPI分子在晶胞中的取向和位置 ,并在 0 .3nm分辨率水平上构建了结构模型 .研究结果表明 ,一个独立区内的 2个DHPI单体分子由一个非晶体学 2次轴联系着 ,该局部 2次轴近似平行于晶体学c轴 .这一特性直接影响了自身旋转函数对该局部对称轴取向的确定     

[L-蛋氨酸]~(B_0)牛胰岛素晶体结构的研究——单晶培养及X射线晶体学的分析

用微量静置法在柠檬酸缓冲液中培养出可供X射线结构分析用的B链NH_2端L-蛋氨酸牛胰岛素单晶。晶体衍射分辨率达到2.0(?),所培养的晶体属立方晶系,α-73.503A,其空间群为P2_13,每个结晶学不对称单位合两个蛋氮酸牛胰岛索分子。对单位晶胞内六聚体之间的可能排列进行了讨论。     

[Trp]~(B_1)胰岛素结构研究——Ⅱ.差值傅立叶法结构分析

在四圆衍射仪上收集了猪和牛[Trp]~(B_1)胰岛素单晶体3.1埃分辨率的衍射数据,并计算获得了这两个胰岛素类似物对猪胰岛素的差值电子密度图。这两套图的特点基本上相似,B_1-Trp残基附近密度变化较大,从密度的形状与连续性看来,在不对称单位的两个分子中,分子Ⅰ的色氨酸侧链似乎指向分子内部。在本文的最后部分对所得到的结果作了讨论。     

[Trp]~(B_1)胰岛素结构研究——Ⅱ.差值傅立叶法结构分析

在四圆衍射仪上收集了猪和牛[Trp]~(B_1)胰岛素单晶体3.1埃分辨率的衍射数据,并计算获得了这两个胰岛素类似物对猪胰岛素的差值电子密度图。这两套图的特点基本上相似,B_1-Trp残基附近密度变化较大,从密度的形状与连续性看来,在不对称单位的两个分子中,分子I 的色氨酸侧链似乎指向分子内部。在本文的最后部分对所得到的结果作了讨论。     

去B链羧端五肽胰岛素的结构研究——Ⅲ.高分辨核磁共振研究

研究了胰岛素(Ins)和去B链羧端五肽胰岛素(DPI)的250兆周核磁共振,发现DPI、Ins核磁共振谱之间存在着差异。这说明胰岛素分子羧端五肽的切除引起在溶液中局部构象变化。这种构象变化似乎不影响Ins分子的生物活性。许多研究表明Ins分子在溶液中存在着解离聚合平衡,聚合状态与溶液浓度、pH有密切关系。如果改变DPI和Ins溶液的浓度及pH,前者波谱变化不明显,后者随溶液浓度、pH增加而增加。Ins波谱中的缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸CH_3部分与芳香环质子部分共振峰均加宽。这些说明DPI在无Zn~( )溶液中不存在解离聚合平衡,而可能以单体形式存在。     

[B10,22-Asp,B25-Tyr-NH2]-去β链C端五肽胰岛素的合成和性质

本文报道了[B10,22-Asp,B25-Tyr-NH2]-去B链羧端五肽胰岛素的制备及其生物活性。结果表明,这一类似物的生物活力比去五肽胰岛素(DPI)的活力高一倍,但却比Gerald所报道的[B10-Asp,B25-Tyr-NH_2]-DPI的活力低很多,说明后者的高活性可能依赖于分子中B22-Arg的存在。     

胰岛素单斜晶体(B型)结构的分子置换法研究

在含有ZnCl₂的柠檬酸缓冲体系中,保持苯酚浓度在0.76％～1.25％之间,获得了胰岛素单斜晶体(B型),空间群为P2₁,晶胞参数为:a=4.924 nm,b=6.094nm,c=4.818nm,β=95.8°,每个独立区包含有由6个胰岛素分子构成的1个六聚体。以四锌牛胰岛素六聚体作模型,用X-PLOR软件中的旋转函数程序和本实验室的分子密堆积程序,获得了胰岛素单斜晶体(B型)结构的初始相位。借助生物大分子刚体精化技术对模型进行了初步精化,用能量极小化的立体化学制约的最小二乘精化技术并辅以差值Fourier图人工分析对模型进行了调整和精化。最终R因子为22.4％,键长和键角与标准键长和键角的偏差分别为0.0022nm和4.7°。     

胰岛素分子中的非螺旋氢键

以差值傅里叶技术对同晶置换途径测定的胰岛素结构进行精化后,用蛋白质分子内环境分析程序考查了胰岛素分子的非螺旋氢键。结果表明,几乎所有非螺旋氢键都集中分布在B链N端(B4～B6)和C端(B20—B26)伸展肽段,A链两段螺旋间的4肽(A9—A12)和C端5肽(A17—A21),及其之间。它们包括,A链和B链自身形成的氢键3对,A链与B链之间的氢键5对,侧链与主链间的氢键5对,以及分子间的氢键4对。它们对于胰岛素分子精细构象的形成和稳定,特别对于B链C端(B20—B26)肽段的特征折迭和A—B链的正确三维相关,具有重要作用。运用非螺旋氢键分析的结果,讨论了它们在蛋白质结构中可能的一般性作用,以及胰岛素C端和N端一系列修饰物结构-功能研究的结果,提出了胰岛素分子的二聚化及胰岛素原的C肽可能对分子的特征三维折迭具有保护性作用的看法。     

胰岛素分子中的非螺旋氢键

以差值傅里叶技术对同晶置换途径测定的胰岛素结构进行精化后,用蛋白质分子内环境分析程序考查了胰岛素分子的非螺旋氢键。结果表明,几乎所有非螺旋氢键都集中分布在B链N端(B4—B6)和C端(B20—B26)伸展肽段,A链两段螺旋间的4肽(A9—A12)和C端5肽(A17—A21),及其之间。它们包括,A链和B链自身形成的氢键3对,A链与B链之间的氢键5对,侧链与主链间的氢键5对,以及分子间的氢键4对。它们对于胰岛素分子精细构象的形成和稳定,特别对于B链C端(B20—B26)肽段的特征折迭和A—B链的正确三维相关,具有重要作用。运用非螺旋氢键分析的结果,讨论了它们在蛋白质结构中可能的一般性作用,以及胰岛素C端和N端一系列修饰物结构-功能研究的结果,提出了胰岛素分子的二聚化及胰岛素原的C肽可能对分子的特征三维折迭具有保护性作用的看法。     

去七肽胰岛素的分子动力学研究

本文用分子动力学的方法对去七肽胰岛素(DHPI)分子的构象进行了研究,首先用分子动力学方法对晶体胰岛素分子的构象能进行了优化,然后除去B链C端的最后七个残基(B24—B30),做分子动力学模拟,得到了DHPI的平衡构象和均方差波动。胰岛素分子的X射线晶体衍射结构和能量优化构象之间的均方根偏差为0.1;所得DHPI构象和胰岛素能量优化构象间C原子间的均方根偏差为1.8。变化最大的区域是A8—A10,A18—A21,B1—B41和B18—B23。