基于线粒体16S rDNA和COⅡ基因的三种高等白蚁分子鉴定与系统发育研究

【目的】本文从分子水平对双工土白蚁Odontotermes dimorphus Li et Xiao、中华钩扭白蚁Pseudocapritermes sinensis Ping et Xu、商城奇象白蚁Mironasutitermes shangchengensis Wang et Li 3种白蚁科高等白蚁进行鉴定和系统发育分析。【方法】利用PCR方法对上述3种高等白蚁线粒体16S r DNA和Cytochrome oxidaseⅡ(COⅡ)基因进行扩增、测序,经比对和碱基分析后上传至Gene Bank,并在数据库中选取白蚁相应基因进行遗传距离和差异碱基数目计算及系统发育研究。【结果】16S r DNA和COⅡ基因片段长度分别约385 bp和720 bp,两个基因的AT碱基含量均远远大于GC,16S r DNA基因与3种高等白蚁遗传距离和差异碱基数目最少的是0.102和35,COⅡ基因为0.024和16,由16S r DNA和COⅡ两个基因构建的的系统发育树不一致,COⅡ基因构建的系统发育树比16S r DNA基因更符合科、属的关系。【结论】通过16S r DNA和COⅡ基因序列均可将上述3种高等白蚁与其它白蚁区别开,COⅡ基因比16S r DNA基因更适合研究白蚁的系统发育研究,与3种白蚁亲缘关系最近的分别是黑翅土白蚁Odontotermes formosanus、台湾华扭白蚁Sinocapritermes mushae和高山象白蚁Nasutitermes takasagoensis。     

黑胸散白蚁（Reticulitermes chinensis Snyder）肠道共生古菌的系统发育分析

摘要：【目的】利用非培养法对黑胸散白蚁（Reticulitermes chinensis Snyder）肠道共生古菌进行系统发育分析。【方法】采用古菌16S rDNA通用引物以黑胸散白蚁全肠DNA为模板扩增共生菌的16S rDNA并建立基因文库,对得到的基因序列进行系统发育分析。【结果】从黑胸散白蚁肠道得到5个不同的16S rDNA序列,它们之间的相似性为93.2%～99.2%,系统发育分析表明这5个16S rDNA序列代表的克隆分别与来源于黑胸散白蚁近缘种,栖北散白蚁和北美散白蚁肠道中的甲烷短杆菌克隆或     

四川散白蚁属六种白蚁新纪录

2008～2011年间,对四川省宜宾市白蚁种类进行调查,发现了6种散白蚁四川新纪录——圆唇散白蚁Reticulitermes labralis Hsia et Fan、细颚散白蚁Reticulitermes leptomandibularis Hsia et Fan、细颏散白蚁Reticulitermes leptogulus Ping et Xu、黄胸散白蚁Reticulitermes flaviceps(Oshima)、舌唇散白蚁Reticulitermes lingulatus Ping和卵唇散白蚁Reticulitermes ovatilabrum Xia et Fan,将四川省散白蚁属白蚁记录种类由6种增加至12种,将四川省白蚁记录种类由62种增加至68种。     

三种白蚁的头胸部及消化道结构特征比较

【目的】白蚁具有降解木质纤维素的能力,主要场所在消化道内,因此消化道形态结构的研究具有重要意义。【方法】本文对采自河南省的3种白蚁(平额散白蚁Reticulitermes planifrons Li et Ping、湖南散白蚁Reticulitermes hunanensis Tsai et Peng和双工土白蚁Odontotermes dimorphus Li et Xiao的兵蚁和工蚁头胸部特征及其消化道结构进行了比较。【结果】两种散白蚁兵蚁的头壳、后颏和上颚没有明显差异,但与双工土白蚁差异显著。3种白蚁工蚁的前肠、后肠及消化道平均长度均大于兵蚁,且差异显著(P<0.05),而中肠的差异不显著;双工土白蚁的肠道总长度工蚁/兵蚁比值(1.4倍)大于两种散白蚁(1.1倍);除了嗉囊和囊形胃外,两种散白蚁工蚁的其余消化道各段差异显著(P<0.05),与双工土白蚁相比差异也显著。【结论】工蚁的消化道比兵蚁发达,散白蚁的消化道结构与土白蚁有较大不同,这些结果与工蚁和兵蚁的社会分工有关,同时也表明高等白蚁与低等白蚁相比不仅是采食习惯的差别,自身消化系统结构与分区也有较大不同,并为白蚁的生物防治和生物质资源利用提供了资料。     

栖北散白蚁致病菌的分离鉴定与特性研究

[目的]了解散白蚁头部发红且死亡的原因,探究致病菌特性.[方法]从头部发红的散白蚁中分离菌株、培养并纯化,通过显微形态、革兰氏染色及16S rRNA基因序列分析鉴定菌株种类.进一步探究菌株产生红色素的条件并通过液相色谱和质谱联用等方法鉴定发酵产物.[结果]散白蚁鉴定为栖北散白蚁Reticulitermes speratus.从该白蚁头部分离得到一株产红色素的革兰氏阴性细菌RS.16S rDNA序列分析表明RS菌株为黏质沙雷氏菌Serratiamarcescens.RS菌株不同于其它大多黏质沙雷氏菌,在37℃仍然产生红色素.HPLC检测分析红色素为灵菌红素.[结论]本文首次报道从栖北散白蚁分离纯化一株产生灵菌红素的黏质沙雷氏RS菌,研究结果为灵菌红素的生产及散白蚁生物防治技术的研发提供了新的思路.     

黄肢散白蚁β-糖苷酶基因的克隆及特性分析（英文）

【目的】黄肢散白蚁Reticulitermes flaviceps是我国代表性的食木白蚁之一,具有高效的纤维素酶系统。本研究旨在克隆黄肢散白蚁中纤维素酶基因并进行其特性分析,为白蚁纤维素酶资源的开发提供理论基础。【方法】采用反转录PCR(RT-PCR)、简并PCR以及c DNA末端快速扩增实验(RACE)法克隆黄肢散白蚁β-糖苷酶基因序列并进行生物信息学分析;利用大肠杆菌Escherichia coli原核表达该基因,表达出的蛋白质经纯化后进行纤维素酶活力测定。【结果】从黄肢散白蚁中克隆到一个β-糖苷酶基因GZRfbg1(Gen Bank登录号:KU886065)的全长c DNA序列,全长1 691bp,开放阅读框1 488 bp,编码448个氨基酸残基,预测分子量为56.45 k D,具有典型的糖基水解酶家族1(GHF1)的蛋白功能结构域。氨基酸序列多重比对显示,GZRfB G1与北美散白蚁Reticulitermes flavipes的唾液腺β-glucosidase氨基酸序列一致性为95%。GZRfB G1在大肠杆菌Rosetta 2(DE3)中进行体外表达,经纯化的GZRfB G1纤维素酶活力测定结果显示,其对水杨苷、羧甲基纤维素钠(CMC)以及纤维二糖的水解活性依次上升,能够在CMC-琼脂平板中产生清晰的水解圈。【结论】结果表明,来自黄肢散白蚁与北美散白蚁两个近缘白蚁的唾液腺β-糖苷酶在氨基酸序列及其水解特征方面亦具有高度保守性。该β-糖苷酶基因的研究丰富了白蚁纤维素酶开发及系统发生研究的理论基础。     

黑胸散白蚁肠道共生锐滴虫目鞭毛虫的多样性分析与原位杂交鉴定

低等木食性白蚁肠道内的鞭毛虫在纤维素降解过程中扮演着重要的角色。黑胸散白蚁Reticulitermes chinensis Snyder是一种广泛分布于我国的低等木食性白蚁,然而目前对于其肠道内的共生鞭毛虫却鲜见报道。采用锐滴虫目18S rDNA特异引物扩增鞭毛虫18S rRNA 基因并构建文库,对得到的基因进行系统发育多样性分析。针对得到的序列设计特异性的荧光探针,用荧光原位杂交技术对锐滴虫目鞭毛虫进行了鉴定。从黑胸散白蚁肠道得到11个锐滴虫目鞭毛虫18S rDNA序列,它们之间的相似性为86.9%-99.3%。系统发育分析表明,锐滴虫目鞭毛虫主要属于Dinenympha和Pyrsonympha两个属。应用荧光原位杂交技术鉴定出了Dinenympha parva、Dinenympha exilis和Pyrsonympha sp.三种锐滴虫。研究表明,在黑胸散白蚁肠道共生的锐滴虫为Dinenympha和Pyrsonympha属的鞭毛虫。     

从白蚁中分离到具有纤维素酶活的贪噬菌

以黄胸散白蚁Reticulitermes flaviceps后肠为材料,分离培养具有降解纤维素能力的微生物,以进一步了解白蚁后肠微生物的种类。通过以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为唯一碳源的富集及选择培养基培养、筛选,获得一株具有纤维素酶活的菌株R3063。形态学鉴定、革兰氏染色观察及16S rDNA基因序列分析表明该菌株属于贪噬菌(Variovorax sp.)。目前尚未见贪噬菌具有纤维素酶活的报道。     

川中丘陵地区大豆根瘤菌遗传多样性与系统发育关系

【目的】研究分离自川中丘陵地区大豆根瘤菌的遗传多样性和系统发育。【方法】采用16S rDNA PCR-RFLP和16S rRNA基因、glnII、共生基因(nodC)系统发育分析的方法进行研究。【结果】供试未知菌的16S rDNA用4种限制性内切酶(HaeⅢ、HinfⅠ、MspⅠ及TaqⅠ)酶切后获得5种16S遗传图谱类型。16S rDNA PCR-RFLP结果表明,所有供试菌株在83%水平分为慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)和中华根瘤菌属(Sinonrhizobium)两大类群,而75%的菌株为中华根瘤菌。6个代表菌株的16S rDNA、glnII和nodC三个位点基因的系统发育结果基本一致,4株与S.fredii USDA205T相似度最高;有2株分别与B.yuanmingense CCBAU10071T、B.diazoefficiens USDA110T相似度最高。4个Sinonrhizobium代表菌株16S rDNA、glnII序列相似度分别为98.3%-99.9%、98.2%-100%,但它们的nodC基因序列完全相同。【结论】川中丘陵地区大豆根瘤菌具有较丰富的遗传多样性,S.fredii为优势种。     

16S rRNA和recA、groEL基因分类鉴定乳酸乳球菌乳酸亚种和乳脂亚种的比较

【目的】比较16S rRNA和recA、groEL基因部分序列用于乳酸乳球菌乳酸亚种和乳脂亚种分类鉴定的效果。【方法】对已鉴定的8株分离自传统发酵乳的乳酸乳球菌, 选取recA和groEL基因片段, 通过PCR扩增、测序, 将测序得到的序列比对后构建系统发育树, 并与16S rRNA基因序列分析技术进行比较。【结果】比较分析不同菌株16S rRNA和recA、groEL基因的亲缘关系, recA、groEL基因可以准确地完成乳酸乳球菌乳酸亚种和乳脂亚种的区分和鉴定。【结论】recA和groEL基因序列分析可以实现乳酸乳球菌乳酸亚种和乳脂亚种的区分, 因其具有快速、准确、稳定的特点, 可适合于乳酸乳球菌乳酸亚种和乳脂亚种间的快速分类鉴定。     

台湾乳白蚁与赭黄乳白蚁的异名关系---基于形态与分子特征的分析(等翅目：鼻白蚁科）

乳白蚁属Coptotermes是鼻白蚁科Rhinotermitidae最具经济意义的属之一,其中的台湾乳白蚁Coptotermes formosanus Shriaki分布广、适应性强,个体在不同种群以及不同巢龄间外部形态存在明显变异,已报道多个同物异名。本研究发现在模式产地重新采集到经形态学鉴定为赭黄乳白蚁Coptotermes ochraceus Ping et Xu的标本,其形态特征与台湾乳白蚁相似度较高,又以线粒体16S rRNA和CO II基因作为分子标记,将两者进行了序列比对,并与美国国立生物技术信息中心(NCBI)中台湾乳白蚁以及其他一些乳白蚁种类的相应序列一起进行了遗传差异比较和同源性分析。结果表明,台湾乳白蚁与赭黄乳白蚁16S rRNA和CO II序列的遗传差异均明显小于台湾乳白蚁与属内其它种之间的差异;在基于两种分子标记构建的支序图中,台湾乳白蚁和赭黄乳白蚁均聚为一支,并得到了很高的自展支持率。综合分子和形态两方面的证据,本研究建议赭黄乳白蚁为台湾乳白蚁的次异名。     

中国蔡白蚁新属和三新种记述(等翅目:鼻白蚁科:异白蚁亚科)

蔡白蚁Tsaitermes Li et ping,新属模式种:英德蔡白蚁Tsaitermes yingdeensis(Tsai et Li) (=英德散白蚁Reticulitertmes(Planifrontotermes)yingdeensis Tsai et Li) <散白蚁属平额白蚁亚属Reticulitermes(Planifrontotermes)Tsai et Hwang 1977兵蚁(图1、3、4):     

曲额乳白蚁mtDNA-PCR鉴定

基于白蚁16S rRNA基因序列差异设计一对引物进行曲颚乳白蚁PCR鉴定,该引物可以与曲颚乳白蚁线粒体DNA进行PCR反应,特异性扩增约200bp目的DNA片断,成功构建以曲颚乳白蚁16S rRNA基因序列为基础的mtDNA-PCR鉴定体系。     

基于核糖体DNA联合序列的天牛总科高阶元分子系统学研究

【目的】利用核糖体DNA联合序列探讨天牛总科高阶元分子系统发育。【方法】本研究采用分子标记技术,分析测定了63种天牛核糖体28S rDNA D2和D3区以及18S rDNA V4和V7区的DNA序列,并采用邻接法、最大似然法和贝叶斯推论法分别构建了天牛总科2科6亚科63种的分子进化系统。【结果】序列联合比对分析,最终得到1 404 bp的联合数据组,其中可变位点446个（32.0%）,保守位点958（68.0%）,转换/颠换的平均值（R值）为1.73。28S rDNA和18S rDNA以及联合序列的饱和度分析显示碱基突变未达到饱和,说明这些序列适合于分子进化树的构建。利用不同系统发育重建方法得到进化树具有相似拓扑结构,结果支持沟胫天牛亚科、花天牛亚科和天牛亚科为单系群,这与形态学分类结果相似;狭胸天牛独立成为亚科得到了支持。【结论】利用28S rDNA D2和D3区以及18S rDNA V4和V7区联合序列成功构建出了天牛总科高阶元的系统发育树。研究表明联合序列分析是探讨天牛高阶元分类的有效的方法。     

一株引起马来甜龙竹组培污染内生菌的分离与鉴定

【目的】对一株引起马来甜龙竹组培污染内生菌的分离与鉴定。【方法】采用改良的NA培养基分离纯化菌株,并通过菌体的形态结构观察、生理生化试验及其16SrDNA序列同源性分析对其进行鉴定。【结果】菌株SWFU01的形态特征及生理生化试验结果与解淀粉芽孢杆菌[Bacillus amyloliquefaciens(Fukumoto)Priest et al.]的描述基本相同;16S rDNA序列分析表明,该菌株与解淀粉芽孢杆菌JS在同一系统发育分支,其同源性为99.28%。【结论】综合形态学特征、生理生化特征以及16S rDNA序列分析的研究结果,菌株SWFU01被鉴定为解淀粉芽孢杆菌。     

江苏镇江地区主要白蚁种类分布、危害状况及防治策略

【目的】本文旨在明确镇江市白蚁种类分布、危害状况和防治策略。【方法】本文按照镇江市人口密度和园林绿化分布特点,将全市划分为商住区、工业区、园林区三个主要不同的生态区域。通过2012—2013年两年时间的调查与数据收集,在各生态区域共采集185份白蚁标本。运用传统白蚁形态学分类和现代分子生物学技术相结合的方法,对镇江市白蚁主要危害种类进行了鉴别确认。根据白蚁危害严重程度的不同,将镇江市不同生态区域分为蚁害严重区、较重区、一般区,以此确定镇江市白蚁分布危害的特点。【结果】本研究鉴别确认了镇江市主要白蚁种类为2科4属共7种白蚁,分别为黑翅土白蚁Odontotermes formosanus Shiraki、黄翅大白蚁Macrotermes barneyi Light、台湾乳白蚁Coptotermes formosanus Shiraki、黑胸散白蚁Reticulitermes chinensis Snyder、尖唇散白蚁Reticulitermes aculabialis Tasi et Hwang、圆唇散白蚁Reticulitermes Labralis Hsia et Fan和黄胸散白蚁Reticulitermes flaviceps Oshima。根据镇江市主要白蚁种类危害发生空间生态分布情况,镇江市的白蚁危害面广,各区域都有不同程度发生,其中城中区域白蚁分布最为密集。黑胸散白蚁在各个生态区域均有危害分布,且分布范围最广。三个不同生态区域中,蚁害严重区都集中在商住区,且散白蚁危害较大。园林区多为蚁害较重区,且土白蚁危害比较突出。工业区多为白蚁危害一般区,其散白蚁和土白蚁危害程度基本相同。根据镇江市近5年主要白蚁种群及蚁害发生时间,镇江地区的白蚁危害在全年各个月份都有发生,其危害的高峰期主要集中在4—6月,在5月达到高峰值。【结论】通过系统研究与调查,我们掌握了镇江市的白蚁种类以及主要白蚁种群的生态分布区域,明确了镇江地区白蚁发生的时间规律、区域分布特征及其危害严重程度。以此为基础,本文提出了有针对性的镇江地区食木白蚁综合防治策略,为今后更有效地开展白蚁防治工作,保护珍贵园林树种及古典建筑,进一步提高我国白蚁防治和管理水平提供了有效的科学依据及其防治策略。     

米尔顿姬小蜂线粒体16S rRNA与COⅠ基因片段序列测定及分析

【背景】米尔顿姬小蜂是一种入侵我国台湾地区的植食性小蜂,能够严重影响水果的产量和食用价值。目前在我国大陆没有分布,由于其个体微小,与近似种区别较小,通过传统的形态学分类方法难以鉴定,因此有必要研究其基因片段序列,探讨分子鉴定方法。【方法】利用PCR方法扩增并测定了米尔顿姬小蜂线粒体16SrRNA和COⅠ基因的部分序列,并对各序列的碱基组成进行了分析。然后根据COⅠ基因部分序列,利用DNAMAN的Maximum Likelihood方法构建了米尔顿姬小蜂与膜翅目其他科的系统发育树。【结果】16SrRNA基因的PCR扩增产物为426bp,COⅠ基因的PCR扩增产物为488bp。通过测序获得米尔顿姬小蜂16SrRNA和COⅠ基因部分序列,序列分析表明,16SrRNA和COⅠ基因的A+T含量均较高,存在较强的A+T偏向性。系统发育树显示,米尔顿姬小蜂与蚜小蜂科的Encarsia berlesei亲缘关系最近,与姬小蜂科的Chrysocharis nautius、C.eurynota亲缘关系较远。【结论与意义】本研究为米尔顿姬小蜂的分子鉴定提供了依据。     

四川白蚁新纪录——狭胸散白蚁

2012年3月26日在对成都市青羊区青华路37号老成都公馆菜的白蚁危害调查过程中,发现该饭店白蚁危害严重,现场采集白蚁标本,经鉴定为狭胸散白蚁Reticulitermes angustatus He et Qiu.该种此前报道仅分布于贵州省,且只有形态描述.此次在成都地区首次发现狭胸散白蚁,为四川白蚁种类新纪录,还发现该种白蚁对房屋建筑危害严重,应引起白蚁防治工作者的高度重视.     

近暗散白蚁β-葡糖苷酶基因RpBg7的克隆及其在毕赤酵母中的表达

【目的】白蚁是自然界中利用木质纤维素能力很强的生物,是纤维素酶的天然资源库。本研究旨在挖掘新来源的纤维素酶基因,为生物质能源的高效利用提供新的天然酶。【方法】根据前期蛋白质组测序的结果,利用PCR结合RACE克隆了近暗散白蚁Reticulitermes perilucifugus β-葡糖苷酶7(β-glucosidase 7)基因RpBg7 cDNA全长序列;通过生物信息学软件分析了RpBg7的序列;用表达载体pPICZαA在毕赤酵母Pichia pastoris X-33中表达RpBg7蛋白,并用4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl β-d-glucopyranoside, 4pNPG)为底物检测了表达的RpBg7蛋白的酶活性。【结果】获得了近暗散白蚁的一个内源性β-葡糖苷酶7基因RpBg7(GenBank登录号: MN944395),其开放阅读框长1 485 bp,编码495个氨基酸残基。RpBg7蛋白预测分子量为57 kD,属于糖苷水解酶1(glycosidehydrolase 1, GH1)家族,具有保守的碱性氨基酸残基Glu187和Glu394。通过毕赤酵母表达系统成功表达RpBg7蛋白。酶活性分析结果表明,毕赤酵母胞外分泌蛋白粗酶液和胞内蛋白粗酶液中RpBg7酶活性分别为4.43和7.47 U/mL。【结论】克隆并利用毕赤酵母表达了近暗散白蚁的GH1家族的一个β-葡糖苷酶7基因RpBg7,为后期纤维素酶的改造和应用提供了条件。     

云斑白条天牛雌雄成虫四个线粒体基因的序列比较

[目的]比较云斑白条天牛Batocera lineolata成虫雌雄个体的4个线粒体基因的序列差异,为研究种群个体分化和系统发育提供借鉴.[方法]以危害杨树云斑白条天牛种群为研究对象,分别提取并扩增云斑白条天牛雌雄成虫的线粒体DNA的COⅠ、COⅡ、Cytb、16S rRNA4个基因.通过序列比对,分析比较4个线粒体基因序列在雌雄成虫个体间的差异.[结果]危害杨树云斑白条天牛雌雄成虫的4个线粒体基因存在差异.在碱基序列相似度方面,COⅡ基因雌雄成虫间差异最大,相似度为98.3％,在比较的650个碱基位点中,2个缺失碱基,8个不一致碱基;其次为COⅠ,相似度为98.6％,比较的714个碱基位点中,5个缺失碱基,2个不一致碱基;再次为Cytb,相似度为98.9％,在比较的472个碱基位点中,4个不一致碱基;差异最小的为16S rRNA,相似度为99.2％,在比较的833个碱基位点中,2个缺失碱基,3个不一致碱基.在碱基含量方面,4个基因雌成虫A+T与C+G含量差值均高于雄成虫,Cyt b基因雌雄成虫A+T高出C+G含量的差值最高分别为40.84％和40.96％,16S rRNA差值其次分别为40.10％和40.70％,COⅡ差值再次分别为38.94％和38.22％,COⅠ差值最小分别为30.52％和30.16％.[结论]危害杨树云斑白条天牛雌雄成虫的mtDNA COⅠ、COⅡ、Cytb、16S rRNA在碱基序列相似度和碱基含量方面均存在差异,在分析种群个体分化和系统发育时,条件允许的情况下可以区分云斑白条天牛雌雄个体.