人溶菌酶基因的克隆和生物信息学分析

目的:克隆人溶菌酶基因并进行生物信息学分析及构建其原核表达载体方法:采用RT-PCR法扩增人溶菌酶基因,运用相关生物信息学软件对其理化性质、疏/亲水性、功能结构域及蛋白质二级结构等进行分析.将该基因克隆入载体pET32a,PCR、双酶切鉴定和核苷酸序列测定.结果:获得约400bp的人溶菌酶基因,其序列与GenBank中公布序列完全一致.生物信息学分析显示人溶菌酶基因编码130个氨基酸,分子量为14.7kDa,理论等电点为9.28,含有一个功能结构域,二级结构主要由α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-转角组成.经PCR、双酶切鉴定和核苷酸序列测定,表明重级表达质粒构建成功.结论:该基因的克隆、生物信息学分析及原核表达质粒的构建为进一步研究其功能奠定了基础.     

太平洋牡蛎i型溶菌酶基因的克隆与重组高效表达

在双壳类软体动物牡蛎体内,溶菌酶(Lysozyme)在实现宿主免疫防御,破坏和消除侵入体内的病原中发挥着重要的作用.根据GenBank已有的太平洋牡蛎溶菌酶的全长cDNA序列(GenBank:AB179775),通过RT-PCR技术,从太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)中克隆得到溶菌酶(简称为CgLys)基因的开放阅读框(open reading frame,ORF)序列.生物信息软件分析表明,其ORF为414 bp,编码137个氨基酸(aa),前20个aa为信号肽,成熟肽由117个aa组成,其分子量为13.2 kD.通过构建分子系统发育树对其同源性进行分析比较,初步推断该CgLys属于i型溶菌酶.将该CgLys基因的成熟肽亚克隆进原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组质粒pET32a(+)-CgLys,再转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS.该基因工程菌经IPTG诱导发酵后,成功高效地表达了重组CgLys蛋白,其分子质量约为18 kD.该重组CgLya蛋白主要存在于细菌裂解液的上清液中,即以可溶性蛋白形式存在.上述结果将显著简化后续的蛋白纯化过程,为今后扩大规模生产牡蛎溶菌酶提供参考.     

家蝇抗真菌肽-溶菌酶基因的克隆、表达及序列分析

旨在对家蝇抗真菌肽MAF-1-溶菌酶(LZM)基因进行生物信息学分析,并进行融合基因MAF-1-LMZ的克隆和表达分析。从Gen Bank获得家蝇抗真菌肽MAF-1和溶菌酶LZM的编码序列,分析和预测这两种蛋白质的结构和功能。PCR扩增融合蛋白质抗真菌肽-溶菌酶的基因MAF-1-LMZ,将其克隆到原核表达载体p ET-28a中,重组质粒p ET-28a-MAF-1-LMZ在大肠杆菌Origmi B/DE3中经用IPTG诱导表达,表达产物MAF-1-LMZ通过SDS-PAGE电泳进行鉴定,采用小试管法倍比稀释法进行活性验证。结果显示,融合蛋白质MAF-1-LMZ序列的ORF为969 bp,编码322个氨基酸残基,理论分子量为35 468.6 Da,等电点为8.31,在大肠杆菌Origmi B/DE3中得到成功表达。其纯化后的目的蛋白具有抗真菌活性。     

家蝇溶菌酶MDLZM2基因的克隆、序列分析及原核表达

对家蝇溶菌酶(Musca domestica lysozyme,MDLZM2)基因进行克隆、序列分析,构建原核表达载体并在大肠杆菌中表达。从Gen Bank家蝇基因组中筛选获得MDLZM2基因。以该基因的序列设计引物,进行PCR扩增,测序分析获得该基因完整编码序列。运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、信号肽、二级结构、三级结构和保守结构域等方面进行预测和分析。构建p EASY-E1-MDLZM2重组质粒,转化到大肠杆菌BL21(DE3)p Lys S Chemically Competent Cell中进行诱导表达及纯化。结果表明MDLZM2基因ORF全长552 bp,编码183个氨基酸,理论分子量21.2 k Da;等电点为6.13,具有Lysozyme家族的蛋白保守结构域。成功构建重组原核表达p EASY-E1-MDLZM2并诱导表达、纯化重组蛋白,为进一步研究该蛋白的生物学及免疫学活性奠定了基础。     

噬菌体T7溶菌酶基因的克隆

以Pbr322及含有噬菌体T7 RNA聚合酶强启动子φ10的Pbr322衍生物作为克隆载体,经限制内切酶AvaⅡ+HaeⅢ切割的一段噬菌体T7 DNA片段分别克隆到Pbr322及其衍生质粒的BamHⅠ位点上。插入的DNA片段为632碱基对。该片段包括噬菌体T7基因3．5和T7 RNA聚合酶弱启动子φ3．8的全部编码序列。已知噬菌体T7基因3．5的功能为产生噬菌体T7溶菌酶,利用氯仿处理检测带有重组质粒的转化子胞内溶菌酶活力。证明两种克隆株整体细胞中,均有溶菌酶存在。用10一20％SDS-聚丙烯酰胺凝肢电泳检查噬菌体T7基因3．5蛋白带,结果表明T7基因3．5在Pbr322衍生质粒中的表达优于Pbr322。     

人溶菌酶基因的合成和克隆

用固相亚磷酰胺法合成了人溶菌酶的全基因,全长为409bp,它包括了编码人溶菌酶的结梅基因,起始密码于ATG,终止密码子TAA、TGA,以及两端的BamHI和SphI的识别顺序。整个基因分成24个寡聚核苷酸片段进行合成,每个片段长度分别为26至38个核苷酸．然后用两种方法酶促连接成完整的人溶菌酶基因。基因克隆到M13载体上。用点杂交和限制酶酶切分析确定阳性克隆株。用双脱氧链终止法进行序列分析,证实所合成的人溶菌酶基因序列与设计的完全一致。     

菜心BrcuFCA基因的克隆与表达分析

本文以菜心(Brassica campestris L.ssp.chinensis(L.)Makino var.utilis)为实验材料,比较了Trizol法、改进Trizol法及改良SDS法提取菜心总RNA的效果。结果表明改进Trizol法集中了操作简单、耗时短、所需试剂种类少,且完整性好,产量和纯度均高等多重优点,成为提取菜心总RNA首选方案。同时文章以甘蓝型油菜及其它物种的FCA保守区设计引物,将质量高的菜心总RNA反转录合成cDNA,通过RT-PCR从菜心的早、晚熟品种中均克隆得到与开花有关的基因片段,将之命名为BrcuFCA,片段长1001bp,GenBank登录号为EU700363,与甘蓝型油菜及拟南芥FCA氨基酸同源性分别达到了98%和82%。另一方面,本研究还利用半定量RT-PCR研究了BrcuFCA不同时空表达特性,并结合已发表的开花调控遗传途径中两个关键基因BrcuFLC和BrcuFRI时空表达特性研究结果,推测菜心主要的抽薹开花途径不是春化和FRI-依赖途径,而很可能是自主开花途径。本研究为菜心抽薹开花分子机理的研究提供理论依据。     

蕙兰CyfaSTK基因的克隆与表达分析

采用同源克隆的方法,从蕙兰(Cymbidium faberi Rolfe)花芽中克隆获得CyfaSTK基因的cDNA序列,并对其进行生物信息学分析及基因表达分析。结果显示,该基因全长843 bp,其中开放阅读框(ORF)长705 bp,共编码234个氨基酸和1个终止密码子。同源蛋白序列比对及分子系统发育分析结果表明,CyfaSTK蛋白属于D类MADS-box转录因子STK-like进化系,含有MADS、I、K和C等4个结构域,其C末端转录激活区含有2个保守的基元:AG motifⅠ和AG motifⅡ,此外,还具有一个在天门冬目植物中相对保守的基元MD motif。基因表达的组织特异性分析结果显示:蕙兰CyfaSTK基因在花萼、花瓣、唇瓣、药帽、子房中均有表达,但在叶片中不表达,其中在子房中的表达量与其他组织相比,差异达到极显著水平; CyfaSTK在花芽经过休眠后的萌动期表达量最高,且在开花当天该基因表达量有上升趋势。研究结果表明CyfaSTK基因不仅参与调控蕙兰花器官的发育过程,且对子房及合蕊柱的正常发育具有重要作用。     

云杉NBS-LRR基因的克隆与表达分析

为深入研究NBS-LRR基因在川西云杉(Picea balfouriana)抗落针病过程中的分子作用机制,该研究根据GenBank数据库中其他植物NBS-LRR基因保守序列设计引物,利用RT-PCR技术,克隆云杉NBS-LRR基因全长cDNA序列(PbNBS-LRR),分析该基因及其编码蛋白的相关信息并进行基因表达研究。结果表明:(1)成功获得PbNBS-LRR基因的全长2 616 bp(基因登录号:MK044348),且包含一个2 508 bp的完整阅读框(ORF),共编码836个氨基酸,其氨基酸序列具有NBS-LRR类抗病基因典型的NB-ARC结构域和LRR结构域。(2)云杉PbNBS-LRR与北美云杉(Picea sitchensis)NBS-LRR类抗病蛋白相似性最高,达到98%;分子进化分析进一步表明,PbNBS-LRR与北美云杉NBS-LRR亲缘关系最近,其次为糖松(Pinus lambertiana)和火炬松(Pinus taeda)。(3)qRT-PCR分析表明,NBS-LRR基因在川西云杉、粗枝云杉(Picea asperata)和丽江云杉(Picea likiangensis)的根、树干韧皮部、嫩枝及针叶中均有表达,在川西云杉和粗枝云杉的根部以及丽江云杉的树干韧皮部中表达量最高;在落针病病原菌侵染川西云杉和粗枝云杉的初期(5月)以及丽江云杉的后期(9月),NBS-LRR基因的表达量最高,分别为对照的1.73倍、2.11倍和90.49倍,表明NBS-LRR基因参与了云杉落针病的防御反应。     

蕙兰CyfaSTK基因的克隆与表达分析

采用同源克隆的方法,从蕙兰（Cymbidium faberi Rolfe）花芽中克隆获得CyfaSTK基因的cDNA序列,并对其进行生物信息学分析及基因表达分析。结果显示,该基因全长843 bp,其中开放阅读框（ORF）长705 bp,共编码234个氨基酸和1个终止密码子。同源蛋白序列比对及分子系统发育分析结果表明,CyfaSTK蛋白属于D类MADS-box转录因子STK-like进化系,含有MADS、I、K和C等4个结构域,其C末端转录激活区含有2个保守的基元：AG motifⅠ和AG motifⅡ,此外,还具有一个在天门冬目植物中相对保守的基元MD motif。基因表达的组织特异性分析结果显示：蕙兰CyfaSTK基因在花萼、花瓣、唇瓣、药帽、子房中均有表达,但在叶片中不表达,其中在子房中的表达量与其他组织相比,差异达到极显著水平;CyfaSTK在花芽经过休眠后的萌动期表达量最高,且在开花当天该基因表达量有上升趋势。研究结果表明CyfaSTK基因不仅参与调控蕙兰花器官的发育过程,且对子房及合蕊柱的正常发育具有重要作用。     

基因的克隆及表达分析

DNA重组激活基因（Recombination activating genes RAG）是脊椎动物特异性免疫反应的关键基因,也是脊椎动物进化分析的标记基因之一。鲫鱼具有很强的适应性和抗病能力,是我国广泛养殖的重要经济淡水鱼;由于具有不同的倍性和丰富的遗传多样性,又是研究鱼类基因组进化的独特材料。本研究用PCR方法扩增、克隆了鲫鱼的Rag基因。鲫鱼Rag1基因从起始密码到终止密码总长4188bp,由三个外显子和两个内含子组成,其中开放阅读框长3192bp,编码1063个氨基酸。Rag2基因从起始密码到终止密码总长1593bp,没有内含子,只有单一的编码区,编码530个氨基酸。Rag1和Rag2基因的ORF和氨基酸序列在不同鱼类中的对比结果表明其在进化过程中非常保守。不同鱼类Rag1基因的第二内含子也是高度保守的,转录因子结合位点分析表明在第二内含子的保守区域中有许多转录因子的可能结合位点。其中有一段在所有已知鱼类中都存在的保守区域是与性腺发育相关的转录因子SRY和SOX5的可能结合位点,提示Rag1基因的表达可能与性腺发育具有相关性。用RT-PCR方法进行的组织特异性表达分析表明Rag1基因在鲫鱼成体的头肾和精巢都能检测到表达,提示Rag基因不仅主导了免疫组织中的DNA重组,也可能参与了生殖细胞的DNA重组。RT-PCR检测证明Rag1基因在鲫鱼胚胎发育至第5天开始表达,在第7天鲫鱼胚胎的胸腺原基中可检测到Rag1基因mRNA的杂交信号,在第9天鲫鱼胚胎的胸腺原基中可以检测到很强的Rag1 mRNA原位杂交信号,说明该时期可能是鲫鱼免疫基因重组的活跃时期。     

芒果SEPALAATA基因的克隆与表达分析

以芒果品种‘吕宋’(Mangifera indica L.Carabao)为试材,利用同源克隆和RACE技术从花序中获得了1个芒果SEPALAATA(SEP)基因cDNA全长,命名为MSEP1(GenBank中登录号为KP702299)。MSEP1基因的cDNA全长为921bp,包含一个长度为726bp开放阅读框,编码241个氨基酸,蛋白质相对分子质量为27.7kD,理论等电点为5.79。序列比对和系统进化树分析表明,MSEP1具有保守的MADS-box及半保守的K区,属于MADS-box家族的SEP亚家族。器官特异性表达分析表明,MSEP1基因在芒果根、茎中表达量较低,在叶片、花芽中表达量较高,而在花序中表达量最高。研究推测,MSEP1基因可能在芒果生殖生长中发挥重要作用。     

两种沼虾溶菌酶基因ORF的克隆和罗氏沼虾溶菌酶基因的组织表达(英文)

分别提取罗氏沼虾和日本沼虾血细胞总RNA,RT-PCR扩增获得特异性cDNA片段,纯化后克隆到T载体上。序列测定表明所克隆的两种沼虾溶菌酶基因的开放阅读框(ORF)为477bp,共编码158个氨基酸,包括溶菌酶成熟肽140个氨基酸残基和信号肽18个氨基酸残基。同源性分析表明,罗氏沼虾和日本沼虾溶菌酶基因的碱基序列及推测氨基酸序列高度同源,分别为99.4%和98.1%。两种沼虾溶菌酶基因的碱基序列和推测氨基酸序列与Gen-Bank上其他对虾溶菌酶的同源性达83.0%和80.0%以上。两种沼虾溶菌酶都具有c-型溶菌酶典型的两个酶活性位点(Glu51)和(Asp68),以及8个保守结构氨基酸残基Cys,且在101、106和107位上缺少Asp,因而推测本实验所克隆的两种沼虾溶菌酶基因属c-型溶菌酶基因的非钙结合亚型。以PCR法制备罗氏沼虾溶菌酶基因的生物素标记探针,斑点杂交检测感染弧菌后溶菌酶基因mRNA在各组织中的转录水平,结果表明受感染6h后在眼、肌肉、鳃、肝胰腺、肠管中的表达量均有升高,其中在肝胰腺中的表达量最高,约为对照组的560%。在不同感染时间里,肝胰腺中该基因表达量有较大的变化:感染后3h表达量最低,24h后表达量升至最高,大约为对照组的430%,48h时的表达量又有所下降,但仍明显高于对照组(约为330%)。受弧菌感染后罗氏沼虾溶菌酶基因转录的上调证明溶菌酶基因在非特异性免疫中的直接作用,同时表明肝胰腺可能在沼虾的免疫防御过程起重要作用。       

家蝇溶菌酶2基因的克隆及其性质研究

溶菌酶(lysozyme)作为抗菌肽重要一员,在昆虫先天免疫系统中起着重要作用.本文通过家蝇EST序列筛选并结合RACE技术克隆了家蝇Musca domestica的lysozyme 2基因(Md-lysozyme 2,MdL2)全长516 bp的cDNA序列.MdL2包含429 bp的开放阅读框,编码142个氨基酸残基,推导的氨基酸序列N端包括加个氨基酸残基的信号肽,成熟肽由122个氨基酸残基组成,理论分子量为13.89 kD,理论等电点为6.45,有8个半胱氨酸组成4对分子内二硫键.实时荧光定量PCR结果显示大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别刺激后,家蝇幼虫体内MdL2基因的表达模式发生了非常相似的变化.在刺激3～12 h表达下调,12～24 h出现一个短暂的恢复,在刺激24 h后表达又开始下调.不同组织定量PCR结果表明MdL2表达量在肠和血细胞中较高,而在表皮和脂肪体中较低.MdL2成熟肽编码序列被克隆人pET-DsbA表达载体,并转化大肠杆菌后得到高效表达.     

地黄RgMYB10基因的克隆与表达分析

MYB转录因子是植物最大的转录因子家族之一,广泛参与植物的生长发育、逆境胁迫和次生代谢产物积累。该研究通过同源比对和功能注释,在地黄(Rehmannia glutinosa)转录组中筛选出MYB的转录本,设计特异性引物对MYB基因的cDNA序列进行PCR扩增,用水杨酸(SA)、Ag⁺、茉莉酸甲酯(MeJA)和腐胺(Put)这4种诱导子处理地黄毛状根,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测候选MYB基因的表达。结果显示:(1)成功克隆到1个地黄MYB基因,命名为RgMYB10;该基因编码247个氨基酸残基,蛋白质相对分子质量28.48 kD,等电点为5.14,属于R2R3-MYB转录因子。(2)qRT-PCR结果显示,RgMYB10在须根中表达量最高,其次为茎,块根中的表达量最低。(3)RgMYB10在MeJA处理后的毛状根中显著上调表达,为特异响应MeJA诱导的基因,推测RgMYB10基因可能是响应MeJA参与地黄毛蕊花糖苷生物合成的关键转录因子。研究表明,地黄MYB10基因可能参与地黄毛蕊花糖苷的生物合成,为进一步研究MYB10基因在地黄毛蕊花糖苷合成中...     

野生种马铃薯SpPHYB基因的克隆与表达分析

采用RT-PCR技术从野生种马铃薯中克隆到一个光敏色素基因PHYB,其cDNA全长为3470bp。含有一个3393 bp的完整开放阅读框,编码一条长1130个氨基酸的蛋白,分子量为125kDa,等电点为5.6。该基因编码的蛋白序列与栽培种马铃薯、番茄和烟草同源基因编码的氨基酸序列一致性分别为98%、95%、92%,命名为SpPHYB.半定量PCR分析表明,根、茎、叶和芽中SpPHYB表达水平较高且相似,但在花和块茎成熟器官中表达量稍低.     

小麦γ-TMT基因的克隆与表达分析

γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)是维生素E合成途径的关键酶之一。该研究采用RT-PCR方法,从小麦品种‘中国春’中克隆得到小麦γ-TMT基因的3个同源拷贝,其CDs(codingsequence)序列相似性为99.12%;其中Ta-γ-TMT-6A和Ta-γ-TMT-6B编码区长度为1101bp,编码366个氨基酸,而Ta-γ-TMT-6D因发生无义突变,编码365个氨基酸。生物信息学分析表明,3个蛋白分子量分别为39.58、39.53和39.50kDa,理论等电点分别为6.67、6.41和7.08,都属于亲水性不稳定非分泌型蛋白。系统进化分析表明,小麦Ta-γ-TMT蛋白与糜子Pm-γ-TMT的亲缘关系相对较近。实时定量PCR分析表明,小麦Ta-γ-TMT基因在根、茎、叶、颖壳、种子中均有表达,在叶片中表达量最高;ABA、NaCl、PEG均能诱导Ta-γ-TMT基因的上调表达。该研究结果为进一步探讨小麦γ-TMT基因的功能奠定了基础。     

棉花GhWRKY44基因的克隆与表达分析

该研究以枯萎病菌诱导棉花根部基因表达谱中筛选得到的WRKY基因片段为探针,通过电子克隆结合RT-PCR技术,从高抗枯萎病品种‘中棉所12’中克隆到1个与抗枯萎病相关的WRKY转录因子基因GhWRKY44(GenBank登录号KJ801807)。序列分析表明,GhWRKY44基因开放阅读框1 197bp,编码398个氨基酸,含有2个WRKY结构域及C2H2型锌指结构,属于棉花WRKY转录因子家族第Ⅰ类;系统进化分析显示,GhWRKY44基因与拟南芥AtWRKY44亲缘关系最近。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测该基因表达特性,结果发现枯萎病菌诱导后,GhWRKY44基因在抗病品种中优势表达,随处理后时间的推移,其表达量呈先增加后降低再增加的变化趋势,处理后3h时GhWRKY44基因表达量达到最大;而在感病品种中,GhWRKY44基因表达水平明显低于抗病品种,对病原菌响应时间也晚于抗病品种,处理后6h时GhWRKY44基因表达量才达到最大。水杨酸和茉莉酸均能诱导GhWRKY44基因的表达,水杨酸诱导后,GhWRKY44基因表达量迅速增加,且其表达量一直维持在一个较高水平;而茉莉酸诱导后,GhWRKY44基因表达量呈先增加后降低的变化趋势,且其表达水平明显低于水杨酸诱导。研究表明,GhWRKY44基因可能参与了棉花对病原菌和激素胁迫的应答反应。     

紫花苜蓿MsCIPK8基因的克隆与表达分析

CIPK是植物中一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在植物响应逆境胁迫中发挥着重要的作用。本研究根据盐碱胁迫下紫花苜蓿(Medicago sativa L.)转录组数据设计引物,通过RT-PCR克隆获得紫花苜蓿MsCIPK8基因,该基因CDS全长1341bp,编码446个氨基酸,编码蛋白相对分子质量50.73 kD,等电点6.72,具有CIPKS家族蛋白所特有的N端激酶域和C端NAF/FISL结构域。生物信息学分析结果显示,MsCIPK8为可溶性蛋白,二级结构多为无规矩卷曲;系统进化分析表明,紫花苜蓿MsCIPK8与蒺藜苜蓿(Medicago truncatula Gaertn.)MtCIPK8亲缘关系最近。两个蛋白序列比对发现存在4个差异位点,其中3个在保守结构域内。MsCIPK8在低温、干旱、盐和盐碱胁迫下表达量均受到诱导上调表达。低温胁迫下,MsCIPK8在根和叶中的表达量分别在12 h和3 h达到峰值;盐胁迫下,MsCIPK8在根中的表达量12 h达到峰值;盐碱胁迫下,根和叶中MsCIPK8的表达量在12 h后持续高表达;干旱胁迫下,MsCIPK8在根和叶中的表达量在12 h均达到峰值。上述结果表明MsCIPK8参与紫花苜蓿对干旱、低温、盐和盐碱等非生物胁迫的应答。     

意大利蜜蜂amPFK基因的克隆与表达分析

[目的]本研究旨在明确意大利蜜蜂磷酸果糖激酶(amPFK)基因的序列特征及表达模式,为进一步研究amPFK在生殖和发育中的功能奠定理论基础.[方法]采用RT-PCR技术克隆了amPFK基因,并对其氨基酸序列和蛋白结构进行了分析;通过RT-qPCR检测了amPFK基因在意大利蜜蜂不同品级不同发育时期的表达模式.[结果]克...