过氧化氢酶在豌豆蚜抵御藤黄微球菌和大肠杆菌感染引起的氧化胁迫中的作用

【目的】研究细菌-过氧化氢酶-豌豆蚜Acyrthosiphon pisum三者之间的关系,探索过氧化氢酶在豌豆蚜免疫防御反应中的作用。【方法】用体外培养结合菌落计数的方法检测藤黄微球菌Micrococcus luteus和大肠杆菌Escherichia coli感染豌豆蚜后在蚜虫体内的增殖;分别用微孔板荧光检测和实时定量PCR的方法检测藤黄微球菌和大肠杆菌感染豌豆蚜之后,蚜虫体内H_2O_2水平和过氧化氢酶基因的转录水平;通过RNA干扰技术对豌豆蚜过氧化氢酶基因(Cat)进行沉默,并检测沉默后感染藤黄微球菌和大肠杆菌的豌豆蚜体内H_2O_2浓度和细菌数目以及豌豆蚜存活率。【结果】藤黄微球菌感染12 h后,豌豆蚜体内H_2O_2水平以及过氧化氢酶基因表达水平显著升高;大肠杆菌感染12 h后,豌豆蚜过氧化氢酶基因表达水平上升,但H_2O_2水平无明显变化。沉默过氧化氢酶基因后,感染藤黄微球菌导致豌豆蚜体内H_2O_2含量在12 h显著上升,细菌数目在24 h约为对照组的一半,但对豌豆蚜存活率无影响;而过氧化氢酶基因沉默并未引起感染大肠杆菌的豌豆蚜体内H_2O_2水平、细菌数目以及豌豆蚜存活率发生明显变化。【结论】过氧化氢酶参与豌豆蚜对藤黄微球菌的防御过程,但不是该防御反应过程中的关键酶;而针对大肠杆菌感染,豌豆蚜可能通过其他途径来应对。     

MicroRNA通路中的关键因子Dicer-1和Argonaute-1对豌豆蚜免疫防御的影响

【目的】研究microRNA(miRNA)通路中两个关键组分Dicer-1和Argonaute-1(Ago-1)在豌豆蚜Acyrthosiphon pisum抵御细菌和真菌侵染中的作用,加深对豌豆蚜免疫防御系统的了解。【方法】用qRT-PCR检测细菌金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus和大肠杆菌Escherichia coli以及真菌球孢白僵菌Beauveria bassiana分别侵染后豌豆蚜成蚜体内Dicer-1和Ago-1的表达量;通过注射法利用RNAi技术对豌豆蚜成蚜Dicer-1和Ago-1进行沉默后,感染金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和球孢白僵菌,检测豌豆蚜体内细菌和真菌的增殖和统计豌豆蚜成蚜存活率。【结果】与0.85% NaCl溶液处理的对照组相比,金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和球孢白僵菌侵染豌豆蚜成蚜后,其体内Dicer-1和Ago-1的表达量发生了一定程度的上调。RNAi干扰Dicer-1后,感染金黄色葡萄球菌36 h时豌豆蚜成蚜中细菌菌落数显著高于对照组(注射dsLTA)的,但感染后7 d时的存活率与对照组无显著差异;感染大肠杆菌12和24 h时豌豆蚜成蚜体内的细菌菌落数均显著高于对照组的,但感染后7 d时的存活率显著低于对照组的;感染球孢白僵菌后6 d,豌豆蚜成蚜体内真菌孢子数显著高于对照组的,但感染后7 d时的存活率显著低于对照组的。RNAi敲降Ago-1后感染金黄色葡萄球菌,豌豆蚜成蚜体内细菌菌落数在36 h时显著高于对照组的,但感染后7 d时的存活率显著低于对照组的;感染大肠杆菌后,在24 h时豌豆蚜成蚜体内细菌菌落数显著高于对照组的,感染后7 d时的存活率略低于对照组的,但无显著差异;感染球孢白僵菌后6 d,豌豆蚜成蚜体内真菌孢子数显著高于对照组的,但感染后7 d时的存活率显著低于对照组的。【结论】豌豆蚜miRNA通路中的两个关键组分Dicer-1和Ago-1参与了豌豆蚜抵御细菌和真菌侵染的免疫防御反应,尤其在抵御真菌的防御反应中有重要作用。     

光滑鳖甲肽聚糖识别蛋白ApPGRP的表达与功能分析

【目的】旨在研究光滑鳖甲Anatolica polita肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition proteins, PGRPs)基因ApPGRP表达模式及其对下游免疫相关基因的表达调控,以及重组蛋白ApPGRP与细菌的结合能力。【方法】构建原核表达载体pET-28a-ApPGRP,转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3),诱导表达并纯化重组蛋白His-ApPGRP,分别测定其与金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus和肽聚糖(peptidoglycan, PGN)的结合能力。金黄色葡萄球菌S.aureus刺激后,利用qRT-PCR检测光滑鳖甲6龄幼虫体内ApPGRP、抗菌肽基因ApAttacin2和ApAttacin1、防御素基因ApDefensin、丝氨酸蛋白酶基因ApSP和丝氨酸蛋白酶抑制剂基因ApSerpin等免疫相关基因的表达水平;采用RNAi技术沉默光滑鳖甲6龄幼虫体内ApPGRP基因的表达,并利用qRT-PCR分别检测RNAi处理以及RNAi后再用S.aureus刺激时幼虫体内上述基因的表达水平变化。【结果】通过原核表达获得了重组蛋白His-ApPGRP,其具有结合金黄色葡萄球菌和肽聚糖的能力。注射金黄色葡萄球菌后,检测的光滑鳖甲6龄幼虫免疫相关基因(ApSP除外)的表达都显著上调;RNAi沉默光滑鳖甲6龄幼虫ApPGRP后,其他免疫相关基因表达量均显著降低,其响应金黄色葡萄球菌刺激后的表达量也显著低于对照组。【结论】这些结果表明,ApPGRP在光滑鳖甲免疫防御中起着识别外源微生物,激活信号通路并调控抗菌肽表达的作用。     

细菌感染对家蚕DNA甲基化与组蛋白乙酰化相关基因表达的影响

【目的】探讨DNA甲基化及组蛋白乙酰化是否参与家蚕 Bombyx mori 免疫反应的调控。【方法】对家蚕与其他生物的DNA甲基转移酶 (DNMT)、组蛋白去乙酰化酶（HDAC）与组蛋白乙酰转移酶（HAT）的蛋白序列进行系统进化分析;利用定量PCR检测家蚕5龄第3天幼虫感染病原菌绿脓杆菌 Pseudomonas aeruginosa 和金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus 后 BmDNMT 1, BmHDACI-1, BmHDACI-2和 BmHAT 1在家蚕脂肪体组织中的表达变化;给家蚕5龄第2天幼虫注射DNMT, HDAC和HAT抑制剂,观察它们对家蚕感染细菌后的存活率的影响。【结果】系统进化分析显示,BmDNMT1在进化上呈现特殊性,独立于其他昆虫DNMT1的进化,而BmHDACs和BmHAT在进化上相对保守。定量PCR检测表明,在两种细菌感染后,BmDNMT1, BmHDACs 和 BmHAT1 在家蚕幼虫脂肪体中的表达水平均有不同程度的上升。然而,DNMT, HDAC和HAT抑制剂对家蚕幼虫感染细菌后的存活率并无明显影响。【结论】本研究发现感染绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌后,家蚕幼虫脂肪体中 BmDNMT1, BmHDACs 和 BmHAT1 的表达水平有不同程度的上调,推测DNA甲基化和组蛋白乙酰化/去乙酰化可能参与家蚕免疫反应的调控。     

家蝇Mdsirt1基因在细菌、高温和重金属胁迫下的表达分析

【目的】探究家蝇Musca domestica sirt1基因(Mdsirt1)在各种胁迫条件下的表达模式。【方法】以家蝇2龄幼虫cDNA为模板,PCR扩增Mdsirt1基因序列并进行生物信息学分析;实时定量PCR(qRT-PCR)检测Mdsirt1在家蝇不同发育阶段(卵、1龄幼虫、2龄幼虫、3龄幼虫、蛹和成虫)的表达变化,2龄幼虫不同组织(表皮、肠道、脂肪体和血细胞)中的表达分布,以及胁迫条件(细菌刺激、热激及CdCl_2刺激)下的转录水平变化;通过RNAi干扰Mdsirt1基因表达,观察敲低Mdsirt1表达后家蝇幼虫抗病能力变化,并检测机体氧化应激水平。【结果】家蝇Mdsirt1基因编码蛋白含有SIR2结构域,与厩螫蝇Stomoxys calcitrans SIR2氨基酸序列一致性为66%。qRT-PCR结果显示,Mdsirt1基因主要在家蝇蛹期表达,在家蝇2龄幼虫脂肪体中表达量较高。家蝇幼虫Mdsirt1分别在大肠杆菌Escherichia coli刺激3 h,金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus刺激6 h,42℃热激30min以及30 mmol/L CdCl_2刺激48 h时表达量达到最高峰。敲低Mdsirt1表达的家蝇幼虫受到细菌感染(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌1∶1混合感染)后存活率较对照组显著降低1.47倍,且敲低Mdsirt1后机体处于氧化应激状态,活性氧自由基水平和丙二醛含量较对照组分别升高1.58和1.59倍。【结论】Mdsirt1参与家蝇幼虫的抗菌免疫应答和抗逆反应。     

家蝇C-型凝集素的克隆与功能分析

【目的】从家蝇Musca domestica中克隆一种C-型凝集素(C-type lectin)基因,并分析其在家蝇免疫过程中的功能。【方法】根据家蝇转录组信息,克隆了一条C型凝集素基因,将其命名为Mdlectin-C1。构建Mdlectin-C1的原核表达载体,在大肠杆菌Escherichia coli中表达并纯化r Mdlectin-C1蛋白,制备多克隆抗体。利用实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)及Western blot技术对家蝇不同发育阶段和细菌感染前后Mdlectin-C1的表达水平进行检测。运用RNAi技术敲低家蝇1龄幼虫Mdlectin-C1基因表达,然后进行细菌刺激并观察幼虫存活率变化。【结果】Mdlectin-C1 c DNA包含一个546 bp完整开放阅读框,编码181个氨基酸残基,所推导多肽N端包含由21个氨基酸残基组成的信号肽,成熟肽中含有一个保守的碳水化合物识别结构域(carbohydrate-recognition domain,CRD)。qRT-PCR及Western blot结果显示,家蝇从1龄幼虫到蛹的发育过程中,Mdlectin-C1表达量逐步上升,蛹期达到最大值。在革兰氏阴性菌大肠杆菌E.coli和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus刺激后,家蝇2龄幼虫Mdlectin-C1均上调表达,并分别在36和3 h时达到最高值。利用RNAi技术成功敲低Mdlectin-C1表达。对Mdlectin-C1基因敲低的1龄幼虫进行细菌刺激,敲低实验组幼虫存活率显著低于正常对照组。【结论】Mdlectin-C1可能参与家蝇抗菌免疫应答,并在此过程中具有重要作用。     

稳定表达禽β防御素6的DF-1细胞系的建立及其抑菌活性

【背景】禽β防御素6是禽体内分泌的一类抗菌肽,在抵抗病原入侵和免疫调节中发挥着重要作用,但其常规表达方式效率较低,难以在产业化生产中加以应用。【目的】建立稳定表达AvBD6的细胞系,并检测其表达产物对耐药大肠杆菌的抗菌活性,为其他防御素表达提供参考。【方法】利用显微镜观察构建真核重组表达载体pLOV-eGFP-AvBD6转染至293T细胞后的转染效率;收集293T细胞上清液并感染DF-1细胞,通过嘌呤霉素加压筛选稳定表达株;利用RT-PCR和Western Blot分别检测目的基因在转录水平和蛋白水平的表达情况;利用扫描电镜观察细胞培养上清液对耐药大肠杆菌的抗菌效果及其对菌体的损伤。【结果】成功构建重组表达载体pLOV-eGFP-AvBD6,筛选出稳定表达AvBD6的DF-1细胞系,而且目的基因在转录水平和蛋白水平均有表达;细胞培养上清显著降低大肠杆菌和副伤寒沙门菌存活率,对金黄色葡萄球菌的抗菌活性较低。【结论】建立了稳定表达AvBD6的DF-1细胞系,其表达产物对耐药大肠杆菌具有良好的抗菌效果,对推动防御素的应用提供技术支持。     

胞质型肽聚糖识别蛋白RfPGRP-L2在维持红棕象甲肠道菌群稳态中的作用

【目的】明确入侵害虫红棕象甲Rhynchophorus ferrugineus胞质型肽聚糖识别蛋白RfPGRP-L2在肠道菌群稳态的维持和调控过程中的作用,将为靶向破坏肠道菌群稳态的害虫控制新策略研发提供新的科学依据和作用靶标。【方法】利用生物信息学方法分析RfPGRP-L2的序列特征。利用RT-qPCR分析RfPGRP-L2在健康红棕象甲4龄幼虫不同组织(头、脂肪体、表皮、前肠、中-/后肠、血淋巴)以及大肠杆菌Escherichia coli DH5α和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus经注射（注射1 μL OD₆₀₀=1.6的菌液）和喂食（取食涂抹1 mL OD₆₀₀=1.6的菌液的甘蔗薄片）两种不同方式分别感染后红棕象甲4龄幼虫肠道和脂肪体中的表达量;进行RfPGRP-L2原核表达,利用体外孵育方法检测重组蛋白RfPGRP-L2对大肠杆菌DH5α和金黄色葡萄球菌的凝集和抑菌活性;RNAi干扰RfPGRP-L2后,检测红棕象甲4龄幼虫血淋巴和肠道中大肠杆菌菌落数的变化;利用RT-qPCR分析RNAi干扰RfPGRP-L2后红棕象甲4龄幼虫脂肪体和肠道中抗菌肽基因表达量的变化;利用基于细菌16S rRNA的高通量测序分析RNAi干扰RfPGRP-L2对健康红棕象甲4龄幼虫肠道菌群结构组成的影响。【结果】SMART预测发现红棕象甲RfPGRP-L2基因编码的蛋白中无跨膜结构域也无信号肽,这表明RfPGRP-L2是一种胞质型肽聚糖识别蛋白。RT-qPCR检测发现,RfPGRP-L2主要在健康红棕象甲4龄幼虫血淋巴、肠道和脂肪体等免疫组织中表达;被注射感染大肠杆菌和金黄色葡萄球菌6 h和12 h后,红棕象甲4龄幼虫脂肪体中RfPGRP-L2的表达量分别显著上调;被喂食感染大肠杆菌6 h后,红棕象甲4龄幼虫肠道中RfPGRP-L2的表达量显著增加。重组表达蛋白RfPGRP-L2能引起大肠杆菌和金黄色葡萄球菌发生凝集反应,这说明RfPGRP-L2能够识别这两种细菌。当RfPGRP-L2被干扰后,红棕象甲4龄幼虫对肠道和血淋巴中感染EGFP标记的大肠杆菌的清除能力显著弱于对照组;肠道中抗菌肽基因RfCecropin的表达量显著降低;健康红棕象甲4龄幼虫肠道中细菌的菌落数量显著高于对照组,而且肠道菌群结构组成也发生了明显的变化。【结论】红棕象甲体内胞质型肽聚糖识别蛋白RfPGRP-L2能够通过识别细菌并激活肠上皮细胞中相应的免疫信号通路促进抗菌肽基因的表达,从而介导对肠道菌群稳态的调控。     

麦长管蚜唾液蛋白C002的基因克隆与RNA干扰研究

【目的】蚜虫唾液相关蛋白C002是一种水溶性唾液蛋白,在蚜虫取食过程中发挥着重要作用。本研究探讨了蚜虫唾液相关蛋白基因C002在麦长管蚜Sitobion avenae(F.)取食过程中的作用和功能。【方法】根据豌豆蚜基因C002序列,同源克隆了麦长管蚜C002基因,并应用荧光定量PCR和RNA干扰(RNAi)技术分别对该基因的表达规律和功能进行了研究。【结果】结果表明:麦长管蚜C002基因c DNA开放阅读框长663 bp,编码220个氨基酸,命名为Sv C002。转录水平的表达时序分析发现,Sv C002在蚜虫各个时期都有表达,在2龄若蚜时期表达量最高。ds RNA饲喂结果显示,麦长管蚜取食ds C002 4 d和6 d后,C002基因的表达量分别下降54%和69%,差异极显著(P<0.01),麦长管蚜存活率较对照组下降了32.2%和53.3%。将饲喂ds C002的麦长管蚜接种到感蚜小麦(北京837),蚜虫在短时期内出现大量死亡现象,第6天和第8天存活率分别为44.4%和35.6%,低于对照组并达到极显著水平。【结论】C002基因在麦长管蚜的取食行为中发挥着重要作用,可以作为麦长管蚜防治的潜在RNAi靶标基因。     

细菌感染后家蚕幼虫中肠差异表达基因的鉴定（英文）

作为遭遇各种微生物的前线, 昆虫的消化道在免疫反应中起到重要的作用。为了研究家蚕Bombyx mori肠道免疫反应, 我们利用基于ACP (annealing control primer)的反转录PCR技术, 从中肠组织中鉴定得到18个在经口器感染绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa 和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus后的差异表达基因,并利用荧光定量PCR分析了其中4个基因在感染后24 h内的动态变化。结果表明： 肽聚糖识别蛋白-L1（PGRP-L1)和一个丝氨酸蛋白酶前体基因特异性地受绿脓杆菌感染后上调; 30kP蛋白酶A基因受绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌2种细菌感染后上调。我们的研究鉴定了经口器感染后家蚕中肠中参与入侵细菌识别和免疫信号途径的基因, 可为对这些基因进一步的功能研究提供线索。     

烟草甲攻击素基因LsAttacin2的表达及其在抗细菌胁迫中的作用

【目的】本研究旨在阐明烟草甲Lasioderma serricorne幼虫体内攻击素(attacin)基因LsAttacin2在响应细菌侵染过程中的功能。【方法】利用RT-PCR扩增烟草甲LsAttacin2的cDNA全长序列；利用RT-qPCR检测LsAttacin2在烟草甲不同发育阶段(卵、低龄幼虫、高龄幼虫、蛹、低龄成虫和高龄成虫)、4龄幼虫不同组织(头、表皮、前肠、中肠、后肠、脂肪体和马氏管)、大肠杆菌Escherichia coli和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus侵染及其肽聚糖处理4龄幼虫后的相对表达量；通过注射法利用RNAi沉默烟草甲4龄幼虫LsAttacin2的表达后，检测大肠杆菌和金黄色葡萄球菌侵染烟草甲4龄幼虫后的死亡率。【结果】克隆获得烟草甲LsAttacin2(GenBank登录号：MT635176)的cDNA全长序列，其开放阅读框长504 bp,编码167个氨基酸残基，LsAttacin2 N端存在信号肽，C端具有Attacin＿C超家族的保守结构域。RT-qPCR结果表明，LsAttacin2在烟草甲测试的各发育阶段均有表达，且在高龄...     

家蚕半乳糖凝集素BmGalectin-4的表达、纯化及性质分析

【目的】鉴定一种新的家蚕Bombyx mori半乳糖凝集素(galectin)基因,分析其序列和结构特征,测定其在微生物感染后的表达变化,分析其重组表达蛋白与微生物及微生物表面多糖分子的结合特性。【方法】利用TBlastN从家蚕基因组数据库中搜索得到一种新的半乳糖凝集素基因,命名为BmGalectin-4。利用生物信息学分析其序列和结构特征,用半定量RT-PCR检测家蚕分别感染病原菌绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus和白色念珠菌Candidiasis albicans后BmGalectin-4在不同组织中的表达变化,采用原核表达技术对该基因进行重组表达,并利用亲和层析得到纯化的蛋白。通过ELISA检测BmGalectin-4与细菌和真菌的结合;通过Western blot检测它与多糖的结合。【结果】序列分析显示,BmGalectin-4是一种串联重复型半乳糖凝集素,含有2个糖识别结构域,其结构非常保守。RT-PCR检测表明,BmGalectin-4在家蚕脂肪体、血细胞和中肠中都有表达,且感染细菌和真菌后其表达有显著变化。纯化的重组BmGalectin-4与革兰氏阳性菌、阴性菌和真菌有较强的结合,与微生物表面多糖的结合试验表明其识别有较高的特异性。【结论】BmGalectin-4 是一个典型的串联重复型半乳糖凝集素,可能参与家蚕对病原微生物的免疫防御反应。本研究为进一步研究昆虫中半乳糖凝集素的功能奠定了基础。     

桔小实蝇肽聚糖识别蛋白基因BdPGRP-SB1的克隆及功能鉴定

【目的】为探究肽聚糖识别蛋白(PGRP)基因BdPGRP-SB1在桔小实蝇Bactrocera dorsalis免疫中的作用。【方法】本研究利用PCR克隆桔小实蝇BdPGRP-SB1全长cDNA序列;利用生物信息学软件对该基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列特征进行分析。采用RT-qPCR分析BdPGRP-SB1在桔小实蝇不同发育阶段(卵、幼虫、蛹、成虫)及5日龄成虫不同组织(中肠、马氏管、后肠、脂肪体、卵巢和精巢)中的表达模式;对桔小实蝇5日龄雌成虫分别注射大肠杆菌Escherichia coli 0111:B4肽聚糖(PGN-EB)和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus肽聚糖(PGN-SA)后检测BdPGRP-SB1表达水平变化。利用RNAi沉默BdPGRP-SB1的表达,测定大肠杆菌和金黄色葡萄球菌诱导后桔小实蝇雌成虫的死亡率及大肠杆菌诱导后抗菌肽(AMP)基因attacin-A, defensin和diptercin表达变化情况。【结果】克隆获得桔小实蝇BdPGRP-SB1的全长cDNA序列(GenBank登录号: MN892482),开放阅读框长558 bp,编码185个氨基酸,其编码蛋白预测分子量为21.45 kD,等电点为8.57。序列分析表明,BdPGRP-SB1无跨膜结构域,具有PGRP保守结构域,前端具有信号肽,为分泌型蛋白;具有Zn²⁺依赖性酰胺酶活性和DAP型肽聚糖识别位点。系统进化分析发现,BdPGRP-SB1与辣椒实蝇B. latifrons的PGRP-SB1亲缘关系最近,氨基酸序列一致性达96%。发育表达模式表明,BdPGRP-SB1在桔小实蝇3日龄幼虫和成虫期高表达;组织表达谱结果显示BdPGRP-SB1在5日龄成虫各组织中均有表达,在脂肪体内表达量最高。PGN-EB和PGN-SA均能诱导桔小实蝇雌成虫体内BdPGRP-SB1表达水平变化。通过RNAi抑制BdPGRP-SB1表达后,注射大肠杆菌导致桔小实蝇雌成虫死亡率显著升高,以及attacin-A, defensin和diptercin表达量显著上调。【结论】结果说明桔小实蝇BdPGRP-SB1参与识别革兰氏阴性细菌,并可能参与桔小实蝇Imd途径调控其免疫反应。     

美洲大蠊成虫肠道抗细菌共生放线菌的筛选及鉴定

【目的】鉴于野外美洲大蠊Periplaneta americana对恶劣环境适应性强,本研究旨在从云南省大理州的野外美洲大蠊成虫肠道中分离、筛选出抗细菌活性放线菌,为抗生素开发提供菌种资源。【方法】采用涂布平板法和平板划线法对美洲大蠊成虫肠道放线菌进行分离;以金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa、粪肠球菌Enterococcus faecalis、大肠杆菌Escherichia coli和鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium共6种人体病原细菌为指示菌株,采用牛津杯法对分离自这些放线菌的次生代谢产物进行抗菌活性测定;通过形态学特征和16S rRNA基因序列分析,对具有广谱和明显抗菌活性的放线菌进行鉴定,并经16SrRNA基因序列的BlAST同源性比对及系统发育分析确定它们的分类地位。【结果】从美洲大蠊成虫肠道共分离获得41株放线菌。抗菌活性测定结果表明,34株(82.9%)放线菌对至少1种指示病原细菌具有抑制作用,其中有7株对3种以上病原细菌具有抑制作用,9株表现...     

吡唑啉酮铜配合物P-FAH-Cu-phen对金黄色葡萄球菌的转录组影响分析

【背景】金黄色葡萄球菌是目前食品和临床引起感染的重要病原菌,迫切需要开发新型抗菌药物。【目的】分析吡唑啉酮铜配合物P-FAH-Cu-phen对金黄色葡萄球菌的转录组影响和主要代谢信号通路。【方法】采用液体稀释法测定P-FAH-Cu-phen作用金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)和最低杀菌浓度(minimum bactericidal concentration, MBC)。将终浓度2 μg/mL的配合物分别作用于对数生长期的金黄色葡萄球菌30 min和2 h,进行转录组测序及分析。【结果】 P-FAH-Cu-phen作用金黄色葡萄球菌的MIC和MBC分别为2 μg/mL和4 μg/mL。与空白对照相比,配合物处理细菌30 min后,其差异基因共有356个,其中上调表达180个、下调表达176个;配合物处理细菌2 h后,其差异基因共有23个,其中上调表达3个、下调表达20个。差异基因功能主要富集于膜的组成部分、细胞质、质膜、ATP结合、发病机制、金属离子结合、组氨酸生物合成过程、DNA结合、水解酶活性、跨膜转运蛋白活性、硝酸盐同化、硝酸盐代谢过程、硝酸还原酶复合物、硝酸还原酶活性等。差异基因涉及的信号通路主要有双组分系统、群体感应、氮代谢、三羧酸循环、氨基酸代谢等。【结论】影响细菌质膜组成、毒素生成、生物膜形成、细胞壁合成、能量代谢等可能是吡唑啉酮铜配合物P-FAH-Cu-phen对金黄色葡萄球菌的主要抑菌作用。研究为揭示吡唑啉酮铜配合物抑制金黄色葡萄球菌分子机制提供了理论依据。     

棉蚜溶菌酶基因AgLYS的克隆与表达分析

【目的】克隆棉蚜Aphis gossypii Glover溶菌酶基因并进行原核表达,分析其在不同日龄和不同寄主植物上棉蚜体内的表达特征,为进一步研究溶菌酶的功能及其与棉蚜共生菌间的关系奠定基础。【方法】以无翅棉蚜成虫总RNA为模板,采用RT-PCR与RACE方法获得棉蚜溶菌酶基因的cDNA全长序列;将信号肽序列剪切后的棉蚜溶菌酶基因片段连接到原核表达载体pET-30a,并转化到大肠杆菌Eschericha coli中进行诱导表达;采用定量PCR方法测定该基因在不同日龄(1-19日龄)以及西葫芦、黄瓜和豇豆等不同寄主植物上棉蚜体内的相对表达量。【结果】克隆获得棉蚜溶菌酶基因,命名为AgLYS(Gen Bank登录号:KY575341),cDNA全长为680 bp,开放阅读框为516bp,编码172个氨基酸残基。AgLYS的N-末端含有长度为36个氨基酸残基的信号肽序列。系统发育分析表明,棉蚜溶菌酶属于i型溶菌酶,并且与豌豆蚜Acyrthosiphon pisum i型溶菌酶基因的氨基酸序列一致性达90%。AgLYS可在大肠杆菌中诱导表达,表达蛋白分子量为20 k D左右。AgLYS在1-19日龄的棉蚜体内均有表达,但在1-9日龄棉蚜体内表达量较低,11日龄后的棉蚜体内表达量极显著升高(P0.01)。同时,在西葫芦上饲养的棉蚜体内AgLYS的表达量极显著高于在黄瓜和豇豆上饲养的棉蚜体内的表达量(P0.01)。【结论】从棉蚜中克隆获得了i型溶菌酶基因AgLYS,并在大肠杆菌中诱导表达。棉蚜AgLYS基因的表达量受蚜虫日龄及所取食寄主种类的影响,推测棉蚜i型溶菌酶AgLYS可能与棉蚜体内共生菌种群密度的调控相关。     

豌豆蚜触角转录组化学感受蛋白的鉴定、表达和结合特性分析

[目的]本研究旨在鉴定豌豆蚜Acyrthosiphon pisum触角转录组中化学感受蛋白(chemosensory protein,CSP)基因,明确触角中高表达的豌豆蚜CSP蛋白与蚜虫报警信息素、性信息素以及植物挥发物的分子结合特性.[方法]通过对豌豆蚜成蚜触角进行转录组测序,鉴定触角中候选CSP基因;采用RPKM...     

家蚕幼虫BmToll9基因对肽聚糖和金黄色葡萄球菌的响应表达

【目的】Toll信号通路是昆虫中重要的免疫信号通路,其中Toll受体在保持Toll通路的正常免疫应答、抵抗外源病原体中起到关键的作用。本研究旨在探究肽聚糖和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus对家蚕Bombyx mori Toll受体基因BmToll9-1和BmToll9-2表达的影响。【方法】将革兰氏阳性菌细胞壁主要成分肽聚糖和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌分别注射感染家蚕5龄第1天幼虫,诱导其发生免疫反应;采用实时荧光定量PCR分析注射后不同感染时间点BmToll9-2和BmToll9-1基因在家蚕幼虫中肠、表皮、脂肪体和丝腺中的相对表达水平。【结果】往家蚕5龄幼虫中注射肽聚糖或金黄色葡萄球菌后,BmToll9-2基因出现了时间和组织的差异性表达。注射肽聚糖和金黄色葡萄球菌均能诱导5龄幼虫中肠BmToll9-2基因的表达上调,注射肽聚糖和金黄色葡萄球菌分别在3和6 h时对基因表达的诱导效果最好,且注射金黄色葡萄球菌比注射肽聚糖对基因表达的诱导效果更好。注射金黄色葡萄球菌能引起5龄幼虫表皮、脂肪体和丝腺中BmToll9-2基因的表达上调,分别于注射后24, 6和24 h时诱导效果最好。注射金黄色葡萄球菌亦能诱导同源的BmToll9-1基因的上调表达。【结论】家蚕幼虫BmToll9基因在肽聚糖或金黄色葡萄球菌注射处理后均能在不同组织中发生上调表达,推测BmToll9基因参与了家蚕对肽聚糖和金黄色葡萄球菌的免疫反应。     

药用昆虫喙尾琵琶甲肠道抗菌活性放线菌的筛选及鉴定

【目的】探究药用昆虫喙尾琵琶甲Blaps rynchopetera肠道具有抗菌活性的放线菌,为抗菌药物开发提供新的放线菌资源。【方法】结合稀释涂布法和选择培养法从喙尾琵琶甲成虫肠道分离放线菌。以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methieillin-resistant Staphylococus aureus)、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌Escherichia coli、粪肠球菌Enterococcus faecalis、鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium 和铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa 6株致病细菌以及黑曲霉Aspergillus niger、青霉菌Penicillium expansum和白色念珠菌Canidia albicans 3株致病真菌为指示菌,通过牛津杯琼脂扩散法测试放线菌次生代谢产物的抗菌活性。随后,采用分子生物学方法进行16S rRNA序列分析鉴定活性显著的18株放线菌并构建系统发育树。【结果】从喙尾琵琶甲成虫肠道中分离到176株共生放线菌,初步活性筛选结果显示其中46株放线菌表现出不同程度的抗菌活性。多株放线菌对致病菌具有广谱的抑菌作用且抑菌圈直径超过阳性对照药。选择抑菌圈直径大于15 mm的18株放线菌进行分子鉴定,结果显示均为链霉属Streptomyces。【结论】喙尾琵琶甲肠道含有丰富的抗菌活性放线菌资源。     

萝卜蚜反-β-法尼烯结合蛋白基因的时空表达模式分析（英文）

【目的】气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)有助于提高昆虫嗅觉系统的敏感性,并且在蚜虫报警信息素反-β-法尼烯[(E)-β-farnesene EBF]的通信过程中起重要作用。萝卜蚜Lipaphis erysimi是十字花科作物的主要害虫,为了减少蔬菜田间的农药使用,EBF对蚜虫防治具有很大的潜力。然而,目前萝卜蚜对EBF反应的研究甚少。【方法】本研究利用PCR和RACE技术克隆并鉴定了2种公认的在萝卜蚜中对EBF具有高度亲和力的气味结合蛋白的基因LeryOBP3和LeryOBP7;利用RT-qPCR检测了它们在萝卜蚜不同发育阶段和无翅成蚜不同组织中的表达谱。【结果】克隆获得的萝卜蚜2个基因序列LeryOBP3(Gen Bank登录号:KJ703012)和LeryOBP7(Gen Bank登录号:KJ703013)分别与豌豆蚜Acyrthosiphum pisum ApisO BP3和ApisO BP7序列对比有较高的氨基酸序列一致性(分别为94%和88%),基因序列符合气味结合蛋白基因的典型特征。LeryOBP3和LeryOBP7开放阅读框全长分别为357和468 bp,分别编码118和155个氨基酸。发育表达谱表明,LeryOBP3和LeryOBP7的表达量高峰出现于成虫期;组织表达谱表明,LeryOBP3在成蚜足中表达量较高,而LeryOBP7主要表达于成蚜触角组织中。【结论】在萝卜蚜成虫触角中的LeryOBP7结合蛋白可能与其对EBF的响应有关。