沙葱萤叶甲海藻糖磷酸酶基因GdTPP的克隆、原核表达及对温度胁迫的响应

【目的】海藻糖磷酸酶(Trealose-6-phosphate phosphatase,TPP)是参与昆虫海藻糖合成的关键酶之一。本研究旨在克隆和表达沙葱萤叶甲Galeruca daurica海藻糖磷酸酶基因,分析其对不同温度胁迫的响应,以期为进一步揭示其在沙葱萤叶甲生长发育及抗寒、耐热中的作用奠定基础。【方法】根据沙葱萤叶甲转录组数据,通过cDNA末端快速扩增(Rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆沙葱萤叶甲TPP的全长cDNA序列,并对该基因进行生物信息学分析;将该基因与pET28a载体链接构建表达载体,导入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)使其表达;利用实时荧光定量PCR(qPCR)检测TPP基因在沙葱萤叶甲2龄幼虫不同温度下的表达格局。【结果】克隆获得1条沙葱萤叶甲TPP基因cDNA全长序列(GdTPP,GenBank登录号:MG431210),该基因全长1 372 bp,开放阅读框(ORF)864 bp,编码287个氨基酸;蛋白预测分子量为32.32 ku,等电点(pI)为6.19;无信号肽和跨膜结构;包含2个N-糖基化位点;蛋白质亚细胞定位预测该蛋白位于细胞质中。同源性分析表明,GdTPP与马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata TPP亲缘关系最近。成功构建原核表达载体pET28a-GdTPP,经IPTG诱导,GdTPP在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中高效表达。qPCR结果表明,低于25℃对照时,GdTPP表达量随着温度下降而上升,﹣10℃时达到最高值,为对照的1.82倍;高于25℃对照时,GdTPP表达量随着温度上升而上升,40℃时达到最高值,为对照的1.68倍。【结论】沙葱萤叶甲幼虫通过上调GdTPP的表达来应对高温和低温胁迫,该结果为进一步揭示TPP在昆虫应对温度胁迫过程中的作用奠定了基础。     

沙葱萤叶甲丝氨酸蛋白酶基因GdSP的克隆及对温度胁迫的响应

【目的】丝氨酸蛋白酶(serine protease,SP)是一类以丝氨酸为活性中心的重要的蛋白水解酶。本研究旨在克隆获得沙葱萤叶甲Galeruca daurica丝氨酸蛋白酶基因,分析其对温度胁迫的响应,以期为进一步揭示沙葱萤叶甲耐温性的调控机制及其他生理功能奠定基础。【方法】根据沙葱萤叶甲2龄幼虫转录组数据,采用RACE技术克隆得到沙葱萤叶甲丝氨酸蛋白酶基因的cDNA全长序列,并进行生物信息学分析;应用qPCR技术检测其在不同温度(-10,-5,0,5,25和35℃)下处理1 h后及25℃下恢复30 min后在沙葱萤叶甲2龄幼虫中的表达量变化。【结果】自沙葱萤叶甲克隆获得一个丝氨酸蛋白酶基因,命名为GdSP(GenBank登录号:MG797556)。该基因全长1 110 bp,开放阅读框969 bp,编码322个氨基酸;蛋白预测分子量35.41 kD,等电点5.61;编码蛋白具有丝氨酸蛋白酶的典型特征,具有一个跨膜结构,无信号肽。同源序列比对和系统发育分析表明,GdSP与光肩星天牛Anoplophora glabripennis SP的同源性最高,氨基酸序列一致性为30.53%。qPCR测定结果表明,不同温度处理间2龄幼虫中GdSP表达量差异不显著,但对各高低温(-10℃除外)胁迫处理回温后GdSP表达量显著上升。【结论】快速冷驯化对沙葱萤叶甲丝氨酸蛋白酶基因表达无显著影响,而回温可诱导其上调表达。     

沙葱萤叶甲海藻糖酶基因GdTre1的克隆、分子特性和表达分析

【目的】海藻糖酶(trehalase,Tre)作为昆虫体内海藻糖代谢的关键性酶,在昆虫能量调节和生长发育中具有重要作用。本研究旨在克隆获得沙葱萤叶甲Galeruca daurica海藻糖酶基因,并对其表达模式进行定量分析,以期探究海藻糖酶在沙葱萤叶甲生长发育和成虫夏滞育中的作用。【方法】根据沙葱萤叶甲转录组数据,采用RACE技术,克隆得到Tre基因的c DNA全长,并进行生物信息学分析;应用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)技术检测其在沙葱萤叶甲不同发育阶段[卵、1-3龄幼虫、预蛹、蛹、成虫(羽化后3,7,10,15,25,40,60,80和100 d)]、成虫不同组织(头、胸和腹)以及3日龄成虫在不同温度(15,20,25,30,35和40℃)胁迫下的表达水平;采用3,5-二硝基水杨酸法测定不同日龄成虫体内海藻糖酶活性。【结果】克隆获得了沙葱萤叶甲可溶性海藻糖酶基因,并命名为Gd Tre1(Gen Bank登录号:KY697913),该基因全长1 933 bp,开放阅读框1 704bp,编码567个氨基酸;蛋白预测分子量为66.56 k D,等电点为6.62;编码蛋白具有海藻糖酶超基因家族典型的功能结构域,包含1条信号肽,不具有跨膜结构。同源序列比对和系统发育分析表明,Gd Tre1与马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata Tre1b的同源性最高,氨基酸序列一致性达70.25%。RT-q PCR检测结果表明,Gd Tre1在沙葱萤叶甲各发育阶段均有表达,其中在卵期和成虫滞育期间高表达,而在幼虫、预蛹、蛹及成虫滞育前低表达;在成虫不同组织中,通常在腹部中表达量最高,其次为胸部,最低为头部;Gd Tre1表达量随着温度升高而上升,30℃达最高值,而后随温度升高略有下降。沙葱萤叶甲不同日龄成虫体内Gd Tre1表达量及Tre活性存在显著差异,且Gd Tre1表达量与Tre活性变化趋势一致。【结论】海藻糖酶与沙葱萤叶甲生长发育和成虫夏滞育有密切的关系。该结果为进一步揭示该虫的夏滞育分子机理提供了必要的基础。     

沙葱萤叶甲保幼激素结合蛋白基因GdJHBP的克隆及表达分析

【目的】克隆沙葱萤叶甲Galerucadaurica保幼激素结合蛋白基因(Juvenilehormonebinding protein,JHBP)cDNA全长序列,分析其分子特征和表达特性,为进一步明确其在沙葱萤叶甲生长发育及滞育中的作用奠定基础。【方法】基于本实验室组装的沙葱萤叶甲转录组数据库,采用RACE技术,克隆沙葱萤叶甲GdJHBP基因cDNA全长序列;运用ORF Finder、SignaIP、DNAMAN和TMHMM等软件分析其分子特征;利用MEGA6.0软件中的邻接法(Neighbor-joining,NJ)构建系统发育树;应用荧光实时定量PCR(RT-qPCR)技术分析GdJHBP在沙葱萤叶甲不同发育时期、成虫不同组织及高温胁迫下的表达模式。【结果】克隆获得了沙葱萤叶甲保幼激素结合蛋白基因GdJHBP cDNA全长序列(GenBank登录号:MG460309),cDNA全长为826 bp,开放阅读框(ORF)为714 bp,编码237个氨基酸;蛋白质预测分子量为26.58ku,等电点为4.37;包含1条信号肽,无跨膜区,且在第27-189位氨基酸之间存在一个保幼激素结合蛋白家族JHBP保守结构域。序列比对分析表明,不同昆虫JHBP间氨基酸序列一致性较低,沙葱萤叶甲GdJHBP与棕榈象RhynchophorusferrugineusRfJHBP和马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata JHBP 3p2的氨基酸序列一致性最高也仅为30%。系统发育分析表明,GdJHBP与棕榈象血淋巴JHBP亲缘关系最近。RT-qPCR结果显示,GdJHBP在沙葱萤叶甲不同发育阶段均有表达,在幼虫期表达量最高,在卵和蛹期微量表达;在成虫滞育期间低表达,在滞育前与滞育结束后则有较高表达;在成虫发育过程中,头部的表达量显著低于腹部和胸部;高温(30-40℃)可诱导GdJHBP上调表达,在35℃时表达量达到最高值。【结论】沙葱萤叶甲GdJHBP属于血淋巴JHBP,在沙葱萤叶甲生长发育和成虫夏滞育中可能发挥着重要作用。     

沙葱萤叶甲热激蛋白基因GdHsp70的克隆与表达模式分析

【目的】本研究旨在克隆沙葱萤叶甲Galeruca daurica热激蛋白Hsp70基因,并对其进行序列和表达模式分析,探讨该基因在沙葱萤叶甲生长发育及响应温度胁迫方面的作用。【方法】采用RT-PCR和RACE技术从沙葱萤叶甲2龄幼虫中克隆Hsp70基因,并进行生物信息学分析;用Wo LF PSORT在线软件进行亚细胞定位预测;采用实时荧光定量PCR检测该基因在沙葱萤叶甲成虫不同组织(头、胸和腹)中、不同发育阶段(卵、1-3龄幼虫、蛹、雌雄成虫)、不同温度(-14,-10,-5,0,5,10,15,20,25和30℃)处理1 h的2龄幼虫及0℃下分别处理0 min,15 min,30min,1 h,1.5 h,2 h和3 h时卵中的相对表达量。【结果】克隆获得一个沙葱萤叶甲Hsp70基因并命名为GdHsp70(GenBank登录号:KY460462),该基因全长2 340 bp,开放阅读框(ORF)1 899 bp,编码632个氨基酸,预测蛋白质分子量为70.12 k D,等电点(p I)为4.79,无跨膜区,无信号肽。蛋白质亚细胞定位预测该蛋白主要位于细胞质内。蛋白质结构域分析表明,GdHsp70有3个功能保守区。同源比对与系统进化分析表明,GdHsp70与分类学关系上较为接近的昆虫的同源蛋白间有较高的相似度。组织特异性和不同发育阶段表达分析表明,GdHsp70在沙葱萤叶甲成虫胸部和卵期表达量最高;高温和低温胁迫均能诱导沙葱萤叶甲2龄幼虫体内GdHsp70的表达,其中-10℃处理1 h表达量最高;0℃低温处理卵15 min至3 h后均能诱导GdHsp70不同程度的表达上调,其中处理1 h上调幅度最大。【结论】沙葱萤叶甲GdHsp70与该虫的生长发育相关,并对高低温胁迫的响应有重要作用。     

沙葱萤叶甲钙结合蛋白基因的鉴定及表达谱分析

【目的】沙葱萤叶甲Galeruca daurica是一种近年来在内蒙古草原上猖獗成灾的新害虫。本研究旨在克隆沙葱萤叶甲钙结合蛋白(calcium-binding protein,CaBP)基因,分析其在沙葱萤叶甲成虫不同发育阶段及不同温度下的表达谱,为进一步探究其在沙葱萤叶甲生长发育及滞育过程中的作用奠定基础。【方法】根据沙葱萤叶甲转录组和蛋白质组数据,筛选CaBP基因序列信息,应用RT-PCR技术克隆获得CaBP基因的开放阅读框(ORF)全长序列,并对其进行生物信息学分析;通过qPCR检测其在沙葱萤叶甲成虫不同日龄(羽化后3,7,10,15,20,30,40,60,90和110 d)及3日龄成虫在不同温度(0,5,10,15,20,25,30和35℃)下处理1 h后的表达水平。【结果】克隆得到4条具有完整ORF的沙葱萤叶甲CaBP基因cDNA序列,分别命名为GdCaM,GdCAPSL,GdTnCl和GdCRT(GenBank登录号:MN695412-695415),ORF全长分别为480,648,516和1 209bp,分别编码149,215,171和402个氨基酸;只有GdCRT拥...     

德国小蠊两个海藻糖合成酶基因的克隆、组织分布及温度诱导表达分析

【目的】海藻糖合成酶（trehalose-6-phosphate synthase, TPS）是参与昆虫血糖-海藻糖合成的关键酶。本研究旨在克隆德国小蠊 Blattella germanica TPS基因,研究TPS基因在德国小蠊不同组织中的表达模式及在不同温度处理下的表达情况。【方法】通过RACE技术克隆德国小蠊TPS基因全长序列,利用荧光定量PCR的方法检测TPS基因在德国小蠊5龄幼虫不同组织中的表达模式及在高温(40℃和46℃处理30 min)及低温(0℃和10℃处理1 h)逆境下的表达量变化。【结果】从德国小蠊中克隆获得2个TPS基因,分别命名为 BgTPS1 (GenBank登录号：KR050213) 和 BgTPS2 (GenBank登录号：KR050214)。其中,BgTPS1基因cDNA序列全长2 987 bp,开放阅读框 (ORF) 2 502 bp,编码833个氨基酸;BgTPS2基因cDNA序列全长3 212 bp,开放阅读框2 469 bp,编码822个氨基酸。BgTPS1和BgTPS2基因都主要在5龄幼虫脂肪体中表达,且BgTPS2基因的表达量为BgTPS1基因表达量的3.9倍。在两种不同极端温度诱导下,BgTPS1和BgTPS2基因mRNA均上调表达。其中,BgTPS2 的表达量始终显著高于 BgTPS1。在0℃时,BgTPS1和BgTPS2的表达量最高。【结论】德国小蠊5龄幼虫中存在2个TPS基因。两个TPS基因均在脂肪体中高表达,且BgTPS2基因的表达量显著高于BgTPS1基因;低温和高温诱导下均能促进两个基因的表达量上升。该结果为进一步明确昆虫海藻糖的合成途径及其在昆虫对温度逆境的反应中的作用研究奠定了基础。     

沙葱萤叶甲表皮蛋白基因的鉴定及表达谱分析

【目的】表皮蛋白是昆虫体壁的主要组成部分,在昆虫生长发育中起着重要的作用。本研究旨在鉴定沙葱萤叶甲Galeruca daurica表皮蛋白基因,分析其表达模式,以期为进一步研究其在沙葱萤叶甲生长发育中的作用提供必要的基础。【方法】根据本实验室组装的沙葱萤叶甲转录组测序数据,应用生物信息学方法鉴定表皮蛋白基因全长开放阅读框(ORF);采用RT-qPCR技术测定鉴定的8个表皮蛋白基因在沙葱萤叶甲不同发育阶段和3龄幼虫不同组织(头部、体壁、消化道和脂肪体)中的表达谱。【结果】基于转录组数据鉴定到8条沙葱萤叶甲表皮蛋白基因的开放阅读框(ORF)全长序列,命名为GdauCP1-8(GenBank登录号:MN629000-MN629007),ORF长417～810 bp,编码138～269个氨基酸,预测分子量为15～28 kD,等电点pI为4.45～8.62;具有16～20个氨基酸的信号肽;GdauCP1具有典型的跨膜结构,其余7个GdauCP蛋白无跨膜结构。同源序列比对和系统发育分析表明,GdauCP3与马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata CP的氨基酸序列一致性最高,为...     

沙葱萤叶甲钙结合蛋白基因的鉴定及表达谱分析

【目的】沙葱萤叶甲Galeruca daurica是一种近年来在内蒙古草原上猖獗成灾的新害虫。本研究旨在克隆沙葱萤叶甲钙结合蛋白(calcium-binding protein, CaBP)基因,分析其在沙葱萤叶甲成虫不同发育阶段及不同温度下的表达谱,为进一步探究其在沙葱萤叶甲生长发育及滞育过程中的作用奠定基础。【方法】根据沙葱萤叶甲转录组和蛋白质组数据,筛选CaBP基因序列信息,应用RT-PCR技术克隆获得CaBP基因的开放阅读框(ORF)全长序列,并对其进行生物信息学分析;通过qPCR检测其在沙葱萤叶甲成虫不同日龄(羽化后3, 7, 10, 15, 20, 30, 40, 60, 90和110 d)及3日龄成虫在不同温度(0, 5, 10,15, 20, 25, 30和35℃)下处理1 h后的表达水平。【结果】克隆得到4条具有完整ORF的沙葱萤叶甲CaBP基因cDNA序列,分别命名为GdCaM, GdCAPSL, GdTnCl和GdCRT(GenBank登录号: MN695412-695415),ORF全长分别为480, 648, 516和1 209 bp,分别编码149, 215, 171和402个氨基酸;只有GdCRT拥有信号肽。同源序列比对和系统发育分析表明,GdCaM, GdCAPSL, GdTnCl和GdCRT分别与玉米根萤叶甲Diabroticavirgifera virgifera的CaM, CAPSL, TnCl及马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata CRT的氨基酸序列一致性最高,分别为100.0%, 74.0%, 88.2%和92.5%。qPCR结果表明,4个CaBP基因在沙葱萤叶甲不同日龄成虫中均差异表达,且表达模式不同。GdCaM在成虫滞育前(羽化后3 d)表达量较高,进入滞育后(羽化后7 d)表达量降低,在滞育期间(羽化后7-60 d)表达量变化较小,而解除滞育后(羽化后90 d)表达量进一步下调。GdCAPSL在滞育初期(羽化后10 d)维持在最低水平,进入滞育中后期(羽化后40和60 d)开始回升,滞育解除后又突然下调至最低水平,而羽化后110 d急剧上升至最高水平。GdTnCl在滞育初期(羽化后15-20 d)高表达,进入滞育中后期(羽化后30-60 d)急剧下降至最低水平,滞育解除后再次上调,但羽化后110 d突然下调至最低水平。GdCRT在进入滞育后表达量开始逐渐下调,在滞育维持期间(羽化后15-60 d)维持在低水平,滞育解除后又开始上升。温度对3日龄成虫中除GdCRT外的其他3个CaBP基因的表达有显著影响。温度低于20℃时,GdCaM的表达量随温度的降低而升高,但0℃时突然下降;温度高于20℃时,GdCaM的表达量随着温度的升高而上升。GdCAPSL的表达量随着温度的升高而呈现上升的趋势,25℃时达到最高,然后下降。GdTnCl随着温度的升高,表达量呈现下降的趋势。【结论】钙结合蛋白可能在沙葱萤叶甲成虫生长发育及夏滞育调控过程中发挥着重要作用。     

沙葱萤叶甲表皮蛋白基因的鉴定及表达谱分析

【目的】表皮蛋白是昆虫体壁的主要组成部分,在昆虫生长发育中起着重要的作用。本研究旨在鉴定沙葱萤叶甲Galeruca daurica表皮蛋白基因,分析其表达模式,以期为进一步研究其在沙葱萤叶甲生长发育中的作用提供必要的基础。【方法】根据本实验室组装的沙葱萤叶甲转录组测序数据,应用生物信息学方法鉴定表皮蛋白基因全长开放阅读框(ORF);采用RT-qPCR技术测定鉴定的8个表皮蛋白基因在沙葱萤叶甲不同发育阶段和3龄幼虫不同组织(头部、体壁、消化道和脂肪体)中的表达谱。【结果】基于转录组数据鉴定到8条沙葱萤叶甲表皮蛋白基因的开放阅读框(ORF)全长序列,命名为GdauCP1-8(GenBank登录号: MN629000-MN629007),ORF长417~810 bp,编码138~269个氨基酸,预测分子量为15~28 kD,等电点pI为4.45~8.62;具有16~20个氨基酸的信号肽;GdauCP1具有典型的跨膜结构,其余7个GdauCP蛋白无跨膜结构。同源序列比对和系统发育分析表明,GdauCP3与马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata CP的氨基酸序列一致性最高,为60.00%;其余的GdauCPs与玉米根萤叶甲Diabrotica virgifera virgifera CP的氨基酸序列一致性最高,为58.52%~80.00%。GdauCP1-4属于RR-2亚家族,GdauCP5-7属于RR-1亚家族,GdauCP8的亚家族归属未确定。RT-qPCR分析表明,8个GdauCP基因在沙葱萤叶甲不同发育阶段及3龄幼虫不同组织内均有表达,且表达量存在显著差异。GdauCP2, GdauCP4, GdauCP5和GdauCP6在1龄幼虫期高表达,GdauCP3, GdauCP7和GdauCP8在蛹期高表达,GdauCP1在3龄第3天幼虫期高表达;除GdauCP2在成虫中表达水平较高外,其他GdauCP基因在成虫中的表达水平均很低。GdauCP1在头部和体壁中高表达,GdauCP2和GdauCP8在脂肪体中高表达,GdauCP3, GdauCP4, GdauCP6和GdauCP7在消化道中高表达,而GdauCP5在体壁中高表达。【结论】8个GdauCP基因在沙葱萤叶甲不同发育阶段和组织间差异表达,且表达模式不同,意味着不同GdauCP可能具有不同的功能。     

RNAi介导的GdHsp60和GdHsp70基因沉默对沙葱萤叶甲幼虫抗寒性的影响

【目的】本研究旨在比较不同RNAi方法对沙葱萤叶甲Galeruca daurica幼虫热激蛋白基因(GdHsp60和GdHsp70)的沉默效率,以选择一种可高效降低靶基因表达水平的研究方法,明确这两个热激蛋白在沙葱萤叶甲幼虫抗寒性中的作用。【方法】分别通过饲喂法和显微注射法进行RNAi沉默沙葱萤叶甲1和2龄幼虫的GdHsp60和GdHsp70,采用qPCR检测GdHsp60和GdHsp70的沉默效率;通过显微注射法分别 对GdHsp60和GdHsp70进行RNAi后24 h,用热电偶法测定沙葱萤叶甲2龄幼虫过冷却点和结冰点,生物测定沙葱萤叶甲2龄幼虫暴露于不同低温条件下(-6~-14℃) 2 h的半致死温度(Ltemp₅₀)以及在-5℃低温条件下处理不同时间后的半致死时间(Ltime₅₀)。【结果】用饲喂法和显微注射法进行RNAi均可以降低GdHsp60和GdHsp70的表达水平,但显微注射法的沉默效率更高。与对照组(显微注射dsGFP)相比,沙葱萤叶甲2龄幼虫分别显微注射dsGdHsp60和dsGdHsp70 24 h后,GdHsp60和GdHsp70的表达水平均降至最低,分别降低了84.15%和92.38%。在沙葱萤叶甲2龄幼虫中,显微注射dsGdHsp60 24 h后其过冷却点、结冰点、Ltemp₅₀及Ltime₅₀值分别-10.56±0.42℃,-7.66±0.56℃,-8.33℃和49.25 h,显微注射dsGdHsp70 24 h后其过冷却点、结冰点、Ltemp₅₀及Ltime₅₀值分别为-9.08±0.23℃,-6.09±0.28℃, -8.20℃和52.21 h,而对照组的分别为-14.71±0.11℃,-13.94±0.09℃,-10.63℃和87.13 h。与对 照组(显微注射dsGFP)相比,在沙葱萤叶甲2龄幼虫分别显微注射dsGdHsp60和dsGdHsp70 24 h后过冷却点 、结冰点和Ltemp₅₀显著上升,而Ltime50值显著缩短。【结论】显微注射法可作为沙葱萤叶甲Hsp相关基 因RNAi的主要干扰方法;沉默GdHsp60和GdHsp70基因均会显著降低了沙葱萤叶甲幼虫的抗寒能力。     

沙葱萤叶甲成虫不同夏滞育阶段的转录组分析(英文)

【目的】本研究旨在揭示内蒙古草原新害虫沙葱萤叶甲Galeruca daurica专性夏滞育相关的重要基因以及代谢通路。【方法】应用RNA-Seq技术,对沙葱萤叶甲成虫不同夏滞育阶段［滞育前期(PD)、滞育期(D)及滞育后期(TD)］进行转录组测序、分析及基因功能预测,基于RNA-Seq数据筛选夏滞育不同阶段差异表达基因;利用qPCR对基于RNA-Seq数据筛选的10个差异表达基因的表达水平进行验证。【结果】从9个文库中获得202 770 198 clean reads,将12 078 060条转录本组装获得82 292 条unigene,平均长度为783.59 bp,N50为1 545 bp。沙葱萤叶甲D vs PD和TD vs D 比较组分别有2 395(2 119上调和277下调)和62(59上调和3下调)个差异基因。KEGG分析表明,D vs PD和TD vs D比较组差异表达基因分别显著富集于糖孝解/糖异生通路和脂肪酸生物合成通路;此外,许多与钙离子信号转导相关的基因在滞育期间差异表达。10个差异表达基因的qPCR分析表明,RNA-Seq与qPCR结果高度一致。【结论】糖孝解/糖异生、脂肪酸生物合成及钙离子信号通路可能在沙葱萤叶甲滞育调节中起着重要的作用。本研究为进一步研究沙葱萤叶甲成虫专性夏滞育的分子机理奠定了基础。     

沙葱萤叶甲化学感受蛋白基因的鉴定及表达谱分析（英文）

【目的】沙葱萤叶甲Galeruca daurica是一种在内蒙古草原上爆发成灾的新害虫。昆虫的化学感受蛋白(CSPs)是一类水溶性小分子蛋白,其主要功能是识别和传导环境中的化学刺激至受体,参与众多昆虫行为。本研究旨在鉴定沙葱萤叶甲化学感受蛋白基因,并对其表达谱进行分析。【方法】通过筛选本实验室组装的沙葱萤叶甲转录组鉴定沙葱萤叶甲化学感受蛋白基因;采用实时荧光定量PCR方法分析其在沙葱萤叶甲不同发育阶段(卵、1-3龄幼虫、蛹和成虫)和成虫组织[触角、头(去触角)、胸、腹、足和翅]中的表达水平。【结果】鉴定出10个化学感受蛋白基因,将其命名为Gdau CSP1-10(Gen Bank登录号:KY885471-KY885480)。10条编码蛋白的氨基酸序列一致性范围为17.27%~62.79%,彼此间分化程度较高。通过NCBI的Blast比对结果显示,Gdau CSPs与榆黄毛萤叶甲Pyrrhalta maculicollis的Pmac CSP氨基酸序列一致性最高,为90%。系统发育分析表明,4种Gdau CSPs首先与榆黄毛萤叶甲的Pmac CSPs聚为一支。实时荧光定量PCR结果显示,Gd CSPs在不同发育阶段中的表达量有显著差异,Gdau CSP4-5,Gdau CSP7-8和Gdau CSP10 5个Gd CSPs在成虫中的表达量显著高于其他发育阶段,而Gd CSP2在卵中的表达量显著高于其他发育阶段;Gd CSPs不仅表达于成虫触角中,在头(去触角)、胸、腹、足、翅等其他部位也有表达,且10个Gd CSPs在沙葱萤叶甲成虫各组织中有着不同的表达谱,其中Gdau CSP2,Gdau CSP4,Gdau CSP5,Gdau CSP8和Gdau CSP9 5个Gd CSPs在雌成虫触角中的表达量显著高于其他组织。【结论】结果提示化学感受蛋白在沙葱萤叶甲的生长发育和化学感受过程中可能起着不同的作用。本研究为进一步研究沙葱萤叶甲化学感受蛋白的生理功能及化学通讯的分子机理奠定了必要的基础。     

沙葱萤叶甲的过冷却能力与抗寒性

【目的】沙葱萤叶甲Galeruca daurica Joannis于2009年开始在内蒙古草原暴发成灾, 发生地区不断扩大, 危害日趋严重, 严重影响内蒙古草原畜牧业的可持续发展和生态安全。低温是影响昆虫生长发育和存活的关键因子, 而昆虫对低温的耐受性决定了其越冬存活率。了解沙葱萤叶甲的过冷却点及抗寒能力有助于预测其分布范围及种群数量动态。【方法】采用热电偶法, 在室内测定了沙葱萤叶甲各发育阶段的过冷却点; 比较了幼虫在不同低温条件下（-6~-14℃）暴露2 h及在-5℃低温条件下暴露不同时间（0.5~8 d）的存活率。【结果】沙葱萤叶甲不同发育阶段的过冷却点存在显著差异, 从低到高依次为卵（-29.8℃）、 1龄幼虫（-14.6℃）、 2龄幼虫（-13.3℃）、 蛹（-12.1℃）、 3龄幼虫（-10.2℃）和成虫（-9.0℃）; 越冬卵12月和1月的过冷却点最低, 2月的过冷却点最高。随着处理温度的降低和处理时间的延长, 幼虫的存活率降低。1, 2和3龄幼虫在-5℃下的半致死时间（Ltime₅₀）分别为3.84, 3.80和2.28 d, 低温处理2 h后半致死温度（Ltemp₅₀）分别为-10.1, -9.1和-8.5℃, 高于其过冷却点。【结论】说明沙葱萤叶甲幼虫为不耐寒冷型(chill-intolerant)。     

葱蝇海藻糖-6-磷酸合成酶基因的克隆、序列分析及滞育相关表达

海藻糖-6-磷酸合成酶（trehalose-6-phosphate synthase, TPS）是昆虫海藻糖合成途径中的关键酶之一。本研究通过对葱蝇Delia antiqua海藻糖-6-磷酸合成酶基因的克隆、 序列分析及滞育相关表达的分析, 旨在证明该基因在能源合成以及抵御高温和低温环境方面发挥重要作用, 为进一步弄清葱蝇滞育分子机制提供理论依据。根据葱蝇抑制消减杂交文库中的EST序列信息, 设计特异性引物, 并通过RACE技术克隆了葱蝇海藻糖-6-磷酸合成酶基因全长cDNA, 命名为DaTPS1 （GenBank登录号： JX681124）, 其全长为2 904 bp, 开放阅读框2 448 bp, 编码815个氨基酸, 推测其相对分子质量为91.2 kD, 等电点为5.96。生物信息学分析表明, 该基因编码的氨基酸序列具有两个保守结构域, 与其他物种TPS具有较高的同源性, 其中和黑腹果蝇Drosophila melanogaster亲缘关系最近, 氨基酸序列一致性为92.1%; 其蛋白质三维结构有15条大的α螺旋和11股反向平行的β链折叠。RT-PCR分析表明, DaTPS1在葱蝇非滞育、 夏滞育和冬滞育期蛹中都有表达, 但是非滞育期各时期表达量基本没有变化, 而在夏滞育和冬滞育蛹的滞育前期表达量较高, 滞育保持期表达量较低, 滞育期后期表达量又有所升高。推断在葱蝇蛹夏滞育和冬滞育期前期, TPS1开始催化合成较多的海藻糖以提高滞育期抵御不良环境的能力, 滞育保持期蛹的新陈代谢降低, 所需能量较少, 所以TPS1处于低水平表达状态, 而滞育期结束后, 蛹生长发育逐渐恢复, 所需能量有所增加, TPS1的表达量再次升高。本研究对揭示昆虫TPS在能量代谢通路中的作用及昆虫滞育的分子机理具有一定的科学意义。     

沙葱萤叶甲成虫触角感器超微结构及对沙葱挥发物的触角电位反应

【目的】明确沙葱萤叶甲Galeruca daurica成虫触角感器类型及对寄主植物挥发物的电生理反应,为进一步研究沙葱萤叶甲的化学感受机理奠定基础。【方法】使用扫描电子显微镜观察沙葱萤叶甲成虫触角上的感器类型;采用顶空动态吸附收集法采集寄主植物沙葱Allium mongolium的挥发物,利用气质联用仪测定沙葱主要挥发物组分,并利用触角电位技术(electroantennogram, EAG)测定沙葱萤叶甲成虫对这一寄主植物主要挥发物成分的电生理反应。【结果】沙葱萤叶甲成虫触角上分布的感器主要有5种类型,分别是毛形感器(sensilla trichodea, ST)、刺形感器(sensilla chaetica, SC)、锥形感器(sensilla basiconica, SB)、钟形感器(sensilla campaniformia, SCa)和B9hm氏鬃毛(B9hm bristles, BB)。沙葱挥发物主要由32种化合物组成,其中,含硫化合物占总量的49.3%。雌成虫对二烯丙基硫醚、二烯丙基二硫、顺-2-己烯-1-醇、2-己烯醛、苯甲酸甲酯和己醛6种化合物表现出较强的触角电位反...     

低温胁迫对沙葱萤叶甲幼虫过冷却能力及生长发育的影响

【目的】低温是影响昆虫生长发育和存活的关键因子之一。通过研究低温胁迫对沙葱萤叶甲Galeruca daurica Joannis幼虫过冷却能力及生长发育的影响,为进一步预测其种群动态及分布范围奠定必要的基础。【方法】在室内,沙葱萤叶甲1龄幼虫经不同的低温处理后,测定其过冷却点及后期幼虫和蛹的发育历期及存活率。【结果】快速冷驯化对1龄幼虫的过冷却点存在极显著的影响,其中在﹣10℃下处理2 h后的过冷却点显著低于对照,而在﹣6℃下处理2 h后与对照无显著性差异。经低温处理存活的1龄幼虫在25℃下继续饲养至蜕皮为2龄幼虫,测得的过冷却点与对照均无显著差异。1龄幼虫经历不同低温处理后,1龄和2龄幼虫发育历期和幼虫总发育历期与对照相比均显著延长;蛹期与对照相比差异不显著;短时低温处理(2 h)对3龄幼虫发育历期无显著影响,而较低温度(﹣5℃)的长时间(2~6 d)处理却显著缩短了3龄幼虫发育历期,但0℃处理对3龄幼虫发育历期影响不显著。低温处理对后期1龄和2龄幼虫死亡率存在显著的影响,但对3龄幼虫和蛹的死亡率影响不显著。通常在低温处理时间相同的情况下,胁迫温度越低,对后期幼虫发育历期和死亡率影响越大;在处理温度相同的情况下,胁迫时间越长,对后期幼虫发育历期和死亡率影响越大。【结论】低温胁迫可以显著地提高沙葱萤叶甲幼虫的过冷却能力,但却延长了后期幼虫的发育历期及降低了其存活率,胁迫温度越低、时间越长,影响程度越大。     

柞蚕蛹解除滞育过程中海藻糖合成酶基因的表达变化

【目的】克隆柞蚕Antheraea pernyi海藻糖合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,TPS)基因,并对其进行组织表达分析,探讨该基因在柞蚕滞育蛹解除滞育过程中的表达规律,为阐明柞蚕滞育期间碳水化合物代谢规律与蛹滞育解除的关系提供数据支持。【方法】利用PCR及3'RACE技术从柞蚕幼虫脂肪体组织中克隆得到TPS基因,并进行生物信息学分析;RT-PCR检测该基因在柞蚕幼虫各组织中的表达分布,进一步采用Real-time PCR分析柞蚕滞育蛹解除滞育过程中该基因在脂肪体组织和血淋巴中的表达量变化。【结果】克隆获得柞蚕海藻糖合成酶基因并命名为ApTPS。其开放阅读框长2 487 bp,编码828个氨基酸,蛋白预测分子量为93.19 k D,等电点(p I)4.61;无信号肽,无跨膜区。蛋白质亚细胞定位预测该蛋白定位于细胞质中;蛋白质结构域分析表明,ApTPS有两个保守功能区:TPS(第22-497位氨基酸)和TPP(第532-772位氨基酸)。组织特异性分析表明,ApTPS基因在柞蚕幼虫脂肪体中表达量最高;柞蚕解除滞育过程中,ApTPS在脂肪体和血淋巴中的表达量均有所升高,且显著高于对照组(P0.05),但血淋巴中表达量的升高滞后于脂肪体。【结论】结果提示ApTPS参与了柞蚕蛹滞育中碳水化合物代谢调控并在其中发挥重要作用,与柞蚕蛹滞育解除关系密切。     

草地贪夜蛾海藻糖合成酶基因的克隆、时空表达谱及对温度胁迫的响应

[目的]本研究旨在通过克隆草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的海藻糖合成酶(trehalose-6-phosphate synthase)基因SfTPS,分析其在草地贪夜蛾不同发育阶段、不同组织中的表达水平及不同温度胁迫时5龄幼虫中的相对表达量,为进一步探究TPS在草地贪夜蛾生长发育及抗逆应激反应中的...     

不同温度驯化策略诱导优雅蝈螽海藻糖合成酶基因表达及血淋巴糖类含量变化

[目的]研究模拟野外温度骤变和缓慢升降温驯化对优雅蝈螽Gampsocleis gratiosa海藻糖合成酶(Trehalose-6-phosphate synthase,TPS)基因表达量、血淋巴海藻糖及总糖含量的影响以及三者间的相关性。[方法]通过高通量转录组数据筛选,从优雅蝈螽中克隆TPS基因cDNA全长。采取模拟野外温度骤变和缓慢升降温两种温度驯化策略,以热电偶温度计测得优雅蝈螽体温与环境温度最为接近的温度值作为最适温度,实时荧光定量PCR测定优雅蝈螽TPS表达,硫酸蒽酮法测定血淋巴海藻糖和总糖含量(以25℃最适温度作为对照)。[结果]克隆得到的TPS基因命名为GgTPS(GenBank登录号:KU578006),全长3 225bp,包含2 430bp的开放阅读框,5'-非编码区(5'-untranslated region,5'-UTR)153 bp和3'-非编码区(3'-untranslated region,3'-UTR)642 bp。共编码809个氨基酸,预测的蛋白分子量(Mw)91.35 ku,理论等电点(pI)6.28。骤然降温阶段TPS相对表达量呈先升高后降低的变化趋势,在15℃最高,与最适温度25℃差异显著。海藻糖相对含量在0℃显著高于25℃。总糖相对含量在0℃和10℃显著高于25℃。骤然升温阶段,TPS相对表达量呈先降低后升高,再降低的变化趋势,40℃达到最高且与25℃差异显著。缓慢降温阶段TPS相对表达量呈先升高后降低的变化趋势,在15℃和20℃显著高于25℃;海藻糖含量表现出先降低后升高的变化趋势,0℃显著高于25℃,总糖含量在0℃、10℃和20℃与25℃差异显著。缓慢升温阶段TPS相对表达量先降低后升高,30℃和45℃显著低于25℃。海藻糖相对含量在40℃显著低于25℃。总糖相对含量呈先升高后降低的变化趋势,40℃和45℃显著高于25℃。不同温度驯化策略比较TPS相对表达量在15℃、40℃差异显著;海藻糖相对含量在40℃和45℃差异显著;总糖相对含量在10℃和20℃差异显著;体温在30℃差异显著。[结论]温度驯化能够提高昆虫的抗逆能力,昆虫体内TPS表达量和海藻糖合成量与其所处环境温度及作用时间密切相关。低、高温条件下TPS的表达和海藻糖的积累模式不同。