pten敲除小鼠中转录上调基因pdd87编码蛋白定位于高尔基体

为了明确pten敲除小鼠中转录上调基因pdd87编码蛋白在细胞中的定位,构建PDD87与绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白表达载体pEGFP-C1-padS7,利用Lipofectamine2000转染该载体于体外培养的NIH3T3细胞中,采用高尔基体特异探针BODIPY TR C5-Ceramide染色显示高尔基体,激光共聚焦显微镜下观察到PDD87-GFP融合蛋白定位于高尔基体,提示pdd87基因编码的蛋白定位于高尔基体。     

AtRGS1-GFP融合蛋白对AtRGS1细胞定位的研究

应用Gateway克隆技术构建了以CaMV35S为启动子,含AtRGS1-GFP融合基因的植物表达载体,并分别用根癌农杆菌介导法和PEG介导法转化拟南芥野生型（C01）悬浮细胞系和幼苗叶片原生质体,利用荧光显微镜观察AtRGS1-GFP融合基因在转化受体系统中的表达与定位。结果显示,在含AtRGS1-GFP融合基因的转化细胞系中,GFP绿色荧光在细胞膜（壁）上特异表达;原生质体瞬时表达系统中,GFP绿色荧光在细胞膜上强烈表达,表明AtRGS1蛋白定位于细胞质膜上。     

两种瞬时表达体系研究拟南芥Profilin-1的亚细胞定位

使用两种瞬时表达方法研究Profilin-1(PRF1)的亚细胞定位,并比较了2种瞬时表达体系在亚细胞定位研究中的优缺点。利用拟南芥幼叶作为材料,提取叶片的RNA,采用特异性引物RT-PCR的方法克隆PRF1基因,连接到p CAMBIA1300-GFP的改造载体上,成功的构建p CAMBIA1300-GFP-PRF1的表达载体。然后分别利用PEG转化拟南芥原生质体、农杆菌浸染烟草叶片两种技术进行了瞬时表达,并在激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白的表达。研究结果表明,将PRF1基因导入拟南芥的原生质体和烟草表皮细胞后,融合蛋白绿色荧光均能被观察到,PRF1基因与GFP融合蛋白的产物在烟草表皮细胞中主要定位在细胞质和外周细胞器中,在拟南芥的原生质体中的细胞核和细胞质中都有定位。两种不同的瞬时表达体系中PRF1蛋白的定位出现了不同,这可能与同源或异源表达的植物的特性相关。     

荧光蛋白标签对gD囊膜蛋白在BHK-21细胞亚细胞定位的影响

【目的】探究荧光蛋白标签对马疱疹病毒I型(Equine herpes virus type 1,EHV-1)gD囊膜蛋白亚细胞定位的影响。【方法】以EHV-1基因组为模板利用PCR扩增gD全基因,分别克隆至pAcGFP1-C1和p Ds Red2-N1质粒,构建p Ac-GFP-gD(GFP-gD)和p Ds-gD-Red(gD-Red)重组质粒;将GFP基因插入gD基因信号肽序列之后并克隆至PVAX-1质粒,构建PVAX-S-GFP-gD’(S-GFP-gD’)重组质粒;将Flag标签序列与gD囊膜蛋白N端序列融合后并克隆至p VAX-1表达载体,构建p VAX-Flag-gD(Flag-gD)重组质粒。将4种不同重组真核表达质粒分别转染BHK-21细胞,通过激光共聚焦显微镜对不同融合蛋白gD进行亚细胞定位。【结果】成功构建4种不同的融合蛋白gD真核表达载体;在BHK-21细胞单独表达时,不同融合蛋白gD绝大部分都定位于高尔基体,极少量定位于细胞核内。【结论】不同插入位点的荧光蛋白标签对gD囊膜蛋白亚细胞定位无明显影响,这对今后研究其它蛋白亚细胞定位提供参考。     

酿酒酵母荧光定位报告菌株的开发

【目的】为了给外源蛋白在酿酒酵母细胞中的定位提供参考,构建酿酒酵母荧光定位报告菌株。【方法】运用染色体同源重组的方法,将突变的、已进行酵母表达优化的红色荧光蛋白RedStar分别整合到12个酵母细胞器标记蛋白的C端,与之进行融合表达,用特异性引物对每一个酵母荧光定位报告菌株进行PCR扩增和测序验证,用激光共聚焦显微镜进行荧光检测,对线粒体和细胞核进行特异性染料染色,用EGFP标记沙门氏菌已知定位蛋白SipA,与构建的相应荧光定位报告菌株进行共定位。【结果】构建的酿酒酵母荧光定位报告菌株可分别标示酵母细胞的肌动蛋白、晚期胞内体、细胞核、核周质、纺锤体、线粒体、过氧化物酶体、脂滴、初级内吞体、次级内吞体、高尔基体顺面及高尔基体反面。PCR扩增及测序验证、荧光检测、染料与相应报告菌株的共定位、已知定位蛋白SipA与相应报告菌株的共定位均提示报告菌株构建成功。【结论】这些报告菌株的构建,为日后在酵母中观察细胞器动态变化,以及未知蛋白在酵母中的定位提供了基础性工具。     

人组氨酸磷酸酶蛋白PHPT1的细胞定位及其对细胞层状伪足形成的影响

目的:获取人组氨酸磷酸酶蛋白PHPT1基因,并构建其C端GFP融合的真核表达载体,通过瞬时转染观察融合蛋白在细胞内的表达和定位,并研究其定位与细胞层状伪足形成的关系。方法:以人宫颈癌细胞株HeLa cDNA为模板,PCR扩增PHPT1的全长编码基因,克隆到pEGFPN2载体中,构建pEGFP-N2-PHPT1真核表达载体,利用脂质体将构建的载体转染到HeLa细胞中,用激光共聚焦扫描显微镜观察C端GFP连接的PHPT1的细胞定位,并进一步探讨其定位与细胞层状伪足形成的关系。结果:成功构建了PHPT1的GFP融合表达载体pEGFP-N2-PHPT1,并在He La细胞中检测到了融合蛋白的表达,发现其定位与细胞层状伪足的形成密切相关,并可直接影响细胞的运动能力。结论:GFP融合形式表达的PHPT1蛋白在细胞质和细胞核中均有表达,并且定位于细胞层状伪足的前沿,影响细胞层状伪足的形成,从而影响细胞运动。     

(R)-、(S)-羰基还原酶在酿酒酵母中的表达和亚细胞定位

【目的】将增强型荧光蛋白标记的(R)-和(S)-羰基还原酶于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae W303-1A)细胞中表达,分析荧光蛋白表达谱,确定两种酶在细胞中的功能分布和亚细胞定位。【方法】采用SOE-PCR法克隆出增强型荧光蛋白与(R)-和(S)-羰基还原酶的融合基因,构建到真核表达载体pYX212中,电击转化酵母细胞,以荧光蛋白为筛选标志,观察两种酶在酵母细胞中的表达和分布。【结果】激光扫描共聚焦显微观察表明(R)-和(S)-羰基还原酶多定位于细胞内膜和细胞质中稳定表达,少数成点状分布于细胞中央。根据荧光强度可知(S)-羰基还原酶的表达水平明显高于(R)-羰基还原酶。生物转化结果显示融合型(R)-和(S)-羰基还原酶催化底物2-羟基苯乙酮,分别获得(R)-和(S)-苯基乙二醇,前者产物的光学纯度和产率为86.6%和70.4%,后者产物的光学纯度和产率分别为92.3%和81.8%。【讨论】荧光蛋白与酶的融合没有改变靶蛋白的分子构象与生物活性,酿酒酵母工程菌较重组大肠杆菌具有更明显的生物功能优势,该研究为羰基还原酶蛋白的功能表达调控与亚细胞定位的可视化研究奠定了坚实的基础。     

利用放线菌酮提高黄素单氧化酶FMO_(GS-OX1)亚细胞定位的准确性

研究蛋白质亚细胞定位的常规方法是构建由35S启动子驱动目的基因与绿色荧光蛋白基因(GFP)融合的表达载体,在细胞中瞬时或稳定表达来确定该蛋白质在细胞中的定位。35S启动子的优势是能够获得较强的GFP信号,但同时也可能因为蛋白质合成量过大,导致部分蛋白滞留在运输途径中或出现在其真实定位以外的区域。为了解决这一问题,以模式植物拟南芥中黄素单氧化酶FMOGS-OX1为例,利用蛋白质抑制剂放线菌酮处理过量表达FMOGS-OX1-GFP融合蛋白的烟草叶片。结果表明:未经放线菌酮处理的烟草叶片表皮细胞,细胞质和内质网中均呈现了较强的荧光信号,放线菌酮处理后,内质网上的信号消失,而细胞质则呈现出稳定的信号,因此判断FMOGS-OX1合成后可能是经过内质网运输到细胞质中的。上述结果证明适当的放线菌酮处理,能够避免强启动子驱动报告基因造成的蛋白质合成过量的问题,可有效地提高蛋白质亚细胞定位的准确性。     

一种基于绿色荧光蛋白的蛋白酶体抑制剂细胞筛选模型

为建立基于绿色荧光蛋白(GFP)的药物筛选模型,并用此模型从包括中药提取物在内的化合物中筛选新型蛋白酶体抑制剂,本研究构建了pGC-E1-ZU1-GFP融合蛋白慢病毒表达载体并感染A549细胞,筛选稳定表达细胞株,用已知蛋白酶体抑制剂PS-341处理细胞,荧光显微镜检测处理前后细胞GFP水平变化。结果获得了稳定表达pGC-E1-ZU1-GFP的A549细胞,这些细胞用PS-341处理24h后用荧光显微镜检测,发现细胞绿色荧光强度相对于对照组明显增强。利用这一模型对一些化合物进行筛查,发现了一些新的蛋白酶体抑制剂。     

KPNB1和Ran蛋白共同介导新城疫病毒基质蛋白的入核转运

【目的】鉴定与新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)基质蛋白(matrix protein,M)入核相关的细胞蛋白,以阐明NDV M蛋白细胞核定位的分子机制。【方法】从鸡胚成纤维细胞中分别克隆核转运受体蛋白KPNA1–KPNA6和KPNB1基因,将其构建到真核表达载体,并与表达NDV M蛋白的重组真核表达载体分别共转染HEK-293T细胞,通过免疫共沉淀方法鉴定与NDV M蛋白相互作用的核转运受体蛋白。另外,将M蛋白与Ran蛋白突变体或与M蛋白互作的核转运受体蛋白缺失体分别共表达,通过荧光共定位确定M蛋白入核转运相关的细胞蛋白。【结果】构建的重组真核表达载体在HEK-293T细胞中能够正确表达;通过间接免疫荧光观察发现,重组蛋白中除Myc-KPNA2蛋白定位在细胞质外,其它核转运受体蛋白均与M蛋白表现出相同的细胞核定位。免疫共沉淀试验结果表明,M蛋白与KPNA1蛋白和KPNB1蛋白均存在相互作用。进一步通过荧光共定位观察发现,M蛋白与KPNA1蛋白缺失体(DN-KPNA1)共表达不改变M蛋白的细胞核定位,而与KPNB1蛋白缺失体(DN-KPNB1)共表达后导致M蛋白变为细胞质定位,说明M蛋白入核转运需要KPNB1蛋白的参与。另外,将M蛋白与Ran蛋白突变体Ran-Q69L共表达,荧光观察发现M蛋白同样由细胞核定位变为细胞质定位,说明M蛋白入核转运还需要Ran蛋白的辅助。【结论】KPNB1和Ran蛋白共同介导NDV M蛋白的入核转运,其过程是KPNB1蛋白首先和M蛋白发生相互作用并形成复合物,然后通过Ran蛋白的辅助作用完成入核转运。     

茶尺蠖水通道蛋白EoAQP1的cDNA克隆、多克隆抗体制备及亚细胞定位

【目的】水通道蛋白(aquaporin,AQP)是一种广泛存在于哺乳动物、植物和微生物中的跨膜转运蛋白,它在细胞水分运输、离子选择透过性和渗透压平衡等过程中发挥着重要的作用。本研究旨在分析茶尺蠖Ectropis obliqua Prout水通道蛋白AQP1的基因特性,在制备多克隆抗体的基础上了解其亚细胞定位分布。【方法】采用同源克隆方法并结合RACE技术克隆茶尺蠖AQP1的基因全长,通过生物信息学网站和软件分析茶尺蠖AQP1的生物学信息;通过实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)检测茶尺蠖AQP1在不同发育阶段和6龄幼虫不同组织中的相对表达量;通过原核表达、镍柱纯化并免疫新西兰兔制备了茶尺蠖AQP1的多克隆抗体;通过荧光显微镜观测了茶尺蠖AQP1在黑腹果蝇Drosophila melanogaster胚胎细胞S2中的定位分布,并利用多克隆抗体进行了Western blot验证。【结果】克隆并鉴定了茶尺蠖AQP1全长,将其命名为Eo AQP1(Gen Bank登录号:KT819587),Eo AQP1 c DNA全长1 826 bp,含有780 bp开放阅读框,编码259个氨基酸。系统进化树和氨基酸序列同源性比对表明,Eo AQP1在鳞翅目昆虫中高度保守。跨膜结构和水分渗透模拟表明,Eo AQP1具有经典的水分渗透模型。qRT-PCR结果表明,Eo AQP1在不同发育时期和6龄幼虫不同组织中均有表达且差异显著。亚细胞定位结果表明,Eo AQP1以圆形颗粒状成群聚集于细胞膜周边,而在细胞膜、核膜和细胞质等处均不表达。多克隆抗体Western blot检测结果表明,Eo AQP1多克隆抗体特异性较好,可用于后续相关实验。【结论】获得了Eo AQP1的c DNA序列,明确了Eo AQP1的生物学特征,阐明了Eo AQP1的时空表达特性,成功制备了Eo AQP1多克隆抗体,初步了解了Eo AQP1的亚细胞定位,为进一步研究Eo AQP1的水分渗透机理奠定了分子基础。     

PS1/GFP融合蛋白对PS1的亚细胞定位的初步研究

PS1基因突变与早发家族性老年痴呆有密切联系.构建pEGFP-C1-PS1以及pEGFP-N2-PS1融合基因表达载体,于HEK293和CHO细胞系中表达PS1/GFP融合蛋白,以GFP绿色荧光作为PS1的亚细胞定位信号,通过SPOTII以及CONFOCAL显微镜进行观察,初步获得PS1全长蛋白在细胞中定位的部分信息,即PS1定位于细胞核膜,细胞质内有不均匀的分布,少量存在于细胞-细胞接触处的细胞膜上.     

Mpl与绿色荧光蛋白融合基因的真核载体构建及表达

目的:探索Mpl与绿色荧光蛋白GFP基因共同转粢哺乳动物细胞NIH3T3的方法.方法:采用PCR方法将GFP基因与Mpl基因构建融合荧光蛋白的真核表达载体,用脂质体介导转染NIH3T3细胞和筛选稳定细胞系,使用荧光显微镜方法和Westernblotting检测转染效果.结果:利用PCR方法有效扩增了Mpl基因,构建了融合荧光蛋白的真核表达载体,序列分析表明所构建的含Mpl基因的质粒与设计相同,使用荧光显微镜方法和Western blotting检测Mpl融合绿色荧光蛋白表达载体成功转染NIH3T3细胞.结论:成功构建了Mpl荧光表达载体,融合基因可以在NIH3T3细胞中稳定表达,为进一步研究Mpl的生物学活性及其与hNUDC蛋白相互作用提供了重要的理论依据.     

绿色荧光蛋白表达载体pXS75－GFP的构建及在嗜热四膜虫中的应用

为获得能够用于构建嗜热四膜虫蛋白定位的载体,该研究将GFP基因与镉（Cd2＋）诱导的四膜虫金属硫蛋白基因（MTTl）启动子序列和终止子序列融合,获得表达载体pXS75-GFP。通过同源重组和抗性筛选,pXS75-GFP载体携带的目的基因整合入四膜虫MTTl位点,在cd2＋诱导下实现GFP融合蛋白的可控表达。将α－tubulin基因ATUl克隆JN－pXS75－GFP中,重组质粒pXS75－GFP－ATUl通过基因枪转化入四膜虫细胞,在巴龙霉素筛选下获得稳定的α-tubulin－GFP过表达细胞株。激光共聚焦显微镜观察α－tubulin．GFP的定位,结果显示,α－tubulin—GFP融合蛋白在四膜虫细胞中表达并分布于皮层上,表明pXS75．GFP载体可用于嗜热四膜虫功能蛋白的定位分析。     

PS1/GFP融合蛋白对PS1的亚细胞定位与功能的初步研究

PS1基因突变与早发家族性老年痴呆有密切联系。本文构建pEGFP-C1-PS1以及pEGFP-N2-PS1融合基因表达载体,于HEK293和CHO细胞系中表达PS1/GFP融合蛋白,以GFP绿色荧光作为PS1的亚细胞定位信号,通过SPOTII以及CONFOCAL显微镜进行观察,初步获得PS1全长蛋白在细胞中定位的部分信息,即本实验条件下,PS1定位于细胞核膜,细胞质内有不均匀的分布,少量存在于细胞-细胞接触处的细胞膜上。     

绿色荧光蛋白在草鱼肾细胞中的表达

应用阳离子脂质体介导法,将含绿色荧光蛋白（GFP）基因的质粒pEGFP-N1转染到培养成单层的草鱼肾细胞（CIK）中,通过荧光倒置显微镜和特异性RT-PCR方法检测GFP的表达.在荧光倒置显微镜下可见CIK细胞的胞质和胞核均呈现绿色荧光,且细胞核的绿色荧光强度强于细胞质.转染细胞中的转录产物经RT-PCR扩增后,凝胶电泳鉴定出与GFP基因片段分子量大小一致的条带,经测序证明其为GFP基因序列.结果表明,GFP基因可以在草鱼CIK细胞内高效率成功表达,为构建以GFP为报告基因的真核重组质粒及研究草鱼出血病DNA疫苗奠定了重要的基础.     

真核表达载体pcDNA3.1(-)+KG的构建及在HeLa细胞中的表达

为了将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)引入细胞核内,采用两轮PCR方法从原先克隆在pcD-NA3.1(-)+GFP载体中将GFP编码序列扩增出来并引入Kozak序列和核定位信号,使用常规酶切和连接方法将其重组至pUCm-T克隆载体中,再将目的片段重组至pcDNA3.1(-)中,对阳性克隆进行酶切、PCR和测序鉴定后,构建了带有Kozak序列和核定位信号的绿色荧光蛋白(GFP)真核表达载体pcDNA3.1(-)+KG。真核表达载体pcDNA3.1(-)+KG被转染试剂Su-perfect转染至HeLa细胞中,绿色荧光蛋白基因在HeLa细胞中得到表达而且在细胞核中观察到绿色荧光。该研究以绿色荧光蛋白为标记初步建立了活体观察真核细胞核动态变化的研究体系。     

盐穗木功能未知蛋白 (HcUKPP)的亚细胞定位

藜科的极端盐生植物盐穗木（Halostachys caspica）的高盐胁迫抑制差减文库中有39%的功能未知蛋白（proteins with obscure features, POFs）,利用亚细胞定位分析可以初步判断其可能的功能.将盐穗木的1个POF-cDNA序列HcUKPP的编码区构建至pCAMBIA1301-GFP植物表达载体上,冻融法将重组质粒pCAMBIA1301-HcUKPP-GFP转化农杆菌EH105A,利用花序浸染法将基因导入拟南芥,经潮霉素筛选获得T1代阳性幼苗.通过激光扫描共聚焦显微镜观察转基因拟南芥植株的根部细胞. 结果显示,表达GFP蛋白的对照转基因植株中,绿色荧光在细胞核、细胞膜以及细胞质中均能检测到,而表达HcUKPP-GFP融合蛋白的转基因植株中,绿色荧光只在细胞质膜上表达,说明HcUKPP蛋白为细胞质膜相关蛋白.本研究为深入探讨盐穗木未知蛋白的功能奠定了基础.     

马尾松毛虫质型多角体病毒非结构蛋白p44在Bac-to-Bac系统中的表达和亚细胞定位

为探寻马尾松毛虫质型多角体病毒(DpCPV 1)p44蛋白的功能,构建了DpCPV 1基因组S8片段的原核表达体系,表达纯化蛋白后免疫家兔制备了多克隆抗体。利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,构建了3种重组的杆状病毒质粒(Bacmid-p44、Bacmid-p44-e GFP和Bacmid-e GFP)。转染昆虫细胞Sf9进行表达,通过Western blot检测和蛋白的亚细胞定位观察。Western blot检测结果显示,Bacmid-S8在昆虫细胞Sf9中表达实际蛋白的大小为35 kD,比在原核系统中表达的蛋白(44 k D)略小;利用激光共聚焦显微镜观察p44-e GFP的融合蛋白的亚细胞定位发现,融合p44的绿色荧光蛋白(eGFP)主要聚集在细胞质中,而未融合的eGFP则分布于整个细胞,说明DpCPV 1的p44蛋白定位于细胞质中。